qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych
6 marca 2019
Ilościowe półautomatyczne typowanie immunoglobuliny z komórek zabójczych (KIR) (qKAT) to prosta, wysokoprzepustowa i opłacalna metoda kopiowania genów KIR typu liczbowego do ich zastosowania w badaniach populacyjnych i asocjacyjnych chorób.
Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące genetyki receptorów komórek NK, takie jak różnorodność haplotypów i ich związek z chorobą. Wizualna demonstracja tej metody pomoże w ustaleniu protokołu w laboratorium, w tym procesu automatyzacji i analizy danych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, qKAT, co oznacza ilościowe automatyczne typowanie KIR, jest wysokoprzepustowy i zapewnia liczbę kopii genów.
qKAT może dostarczyć informacji na temat związku chorobowego. Implikacje tej techniki mogą być przydatne w terapii infekcji wirusowych, takich jak HIV i wirusowe zapalenie wątroby typu C, w nowotworach, po przeszczepach komórek macierzystych i zaburzeniach ciąży. qKAT może być również stosowany w badaniu genetyki populacyjnej, a także w badaniu ekspresji i interakcji funkcjonalnych między cząsteczkami KIR i HLA.
qKAT składa się z 10 reakcji multipleksowych, które są specyficznie ukierunkowane na eksony dwóch genów KIR i jeden gen referencyjny. W tym protokole specyficzne startery są zaprojektowane do wykrywania alleli danego genu, a wyniki PCR w krótkich amplikonach. Następnie podwójnie znakowane specyficzne sondy hydrolizy są używane do monitorowania amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym.
Analiza liczby kopii wykorzystuje względną kwantyfikację docelowych genów KIR w stosunku do genu referencyjnego. qKAT został zaprojektowany i skonfigurowany jako technika wysokoprzepustowa. W związku z tym każdą reakcję można przeprowadzić na nieco poniżej 1 000 próbek.
Poniższe kroki pokazują etapy związane z przygotowaniem i posiewem z każdej 96-dołkowej płytki DNA. Na początek, po ilościowym określeniu DNA, rozcieńczyć DNA w 96-dołkowej płytce głębokiej. Dołącz co najmniej jedną próbkę kontrolną o znanym numerze kopii i jedną próbkę kontrolną inną niż szablon.
Odwirować płytkę o masie 450 g przez dwie minuty. Następnie dozuj każdą próbkę w czterokrotnym duplikacji do 384-dołkowych płytek qPCR. Następnie wysusz DNA na powietrzu w czystym miejscu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
Aby uruchomić jedną reakcję qKAT dla 10 płytek 384-dołkowych, najpierw rozmrozić bufor qPCR, starter i podwielokrotności sondy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę wzorcową na 96-dołkowej płytce głębinowej.
Dozować 9,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej studzienki płytki z wysuszonymi próbkami gDNA. Następnie uszczelnij płytkę folią i natychmiast przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy pamiętać o wykonaniu krótkiego mycia wodą w celu oczyszczenia igieł systemu obsługi płynów, jeśli dozuje się mieszankę wzorcową na więcej niż jedną 384-dołkową płytkę DNA.
Odwirować płytkę z próbkami gDNA o masie 450 g przez trzy minuty. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby ponownie zawiesić DNA i rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza. Po inkubacji płytki przez noc powtórz wirowanie, aby rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie umieść płytę w chłodzonej stacji dokującej. Podłączyć maszynę qPCR do urządzenia do obsługi mikropłytek. Następnie należy zaprogramować obsługę mikropłytek zgodnie z protokołem tekstowym.
Po zakończeniu biegu poproś robota, aby zebrał płytkę z maszyny qPCR i umieścił ją w doku do odrzutów. Po zakończeniu amplifikacji otwórz oprogramowanie qPCR. Na karcie Nawigator otwórz zapisany plik eksperymentu reakcji dla płytki.
Następnie należy otworzyć okno Utwórz nową analizę i wybrać odpowiednie ustawienia dla metody 2. pochodnej maksymalnej. Następnie wybierz opcję Filter Comb i upewnij się, że wybrano dane zebrane dla STAT6. Wybierz odpowiednią kompensację kolorów.
Kliknij przycisk Oblicz, a następnie kliknij przycisk Zapisz plik. Aby przeanalizować dane za pomocą metody Fit Points, należy otworzyć okno Create new analysis (Utwórz nową analizę) i wybrać odpowiednie ustawienia dla metody Fit Points. Następnie wybierz odpowiednie filtry i kompensacje kolorów dla STAT6.
Ustaw pasmo szumów, aby wykluczyć szum tła. Następnie otwórz kartę Analiza i ustaw punkty dopasowania na trzy, a następnie wybierz opcję Pokaż punkty dopasowania. Zapisz zmiany i powtórz kroki z odpowiednimi ustawieniami dla analizy Fit Point i 2nd Derivative dla genów KIR.
Otwórz zakładkę Navigator w oprogramowaniu qPCR i wybierz opcję Results Batch Export. Następnie otwórz folder zawierający pliki eksperymentu i przenieś je na prawą stronę okna. Kliknij przycisk Dalej, a następnie wybierz nazwę i lokalizację pliku eksportu.
Następnie wybierz interesujący Cię typ analizy i kliknij przycisk Dalej. Upewnij się, że nazwa pliku, folder eksportu i typ analizy są poprawne przed kliknięciem przycisku Dalej, aby rozpocząć proces eksportowania. Gdy status eksportu zmieni się na OK, ekran automatycznie przejdzie do następnego kroku.
Upewnij się, że wszystkie wybrane pliki zostały pomyślnie wyeksportowane i kliknij przycisk Gotowe. Następnie za pomocą skryptów w protokole tekstowym podziel wyeksportowane tablice na poszczególne reakcje i przekonwertuj pliki na oprogramowanie do odczytu przez oprogramowanie do analizy numerów kopii. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy liczby kopii i wybierz opcję Importuj plik wyników PCR w czasie rzeczywistym, aby załadować pliki tekstowe utworzone przez skrypty.
Na koniec wybierz pozycję Analizuj i przeprowadź analizę, wybierając pozycję Najczęstszy numer kopii próbki. W tym protokole do kopiowania genów KIR typu liczbowego użyto półautomatycznego typowania lub qKAT. Najczęstszym numerem kopii dla KIR2DL4 były dwie kopie, podczas gdy najczęstszym numerem kopii dla KIR3DS1 było zero.
Podczas próby tej procedury niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że DNA jest dokładnie określone ilościowo, aby przeprowadzić wszystkie kroki na lodzie i upewnić się, że odczynniki są pokryte światłem. Ważne jest również, aby przeprowadzić dokładne kontrole surowych danych dla próbek, które nie są zgodne ze znanymi regułami LD dla genów KIR. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład obecność genów fuzyjnych lub identyfikacja nowych alleli.
Po jej opracowaniu metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogenetyką do zbadania roli KIR w biologii komórek NK, odporności na choroby i rozrodzie człowieka.
Przegląd
Ilościowe półautomatyczne typowanie receptorów immunoglobulinopodobnych komórek zabójczych (qKAT) jest wysokoprzepustową metodą typowania genów KIR. Technika ta pomaga w zrozumieniu genetyki receptorów komórek NK oraz jej znaczenia w przebiegu różnych chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunogenetyka
- Genetyka populacyjna
- Biologia komórki
Wstęp
- Geny KIR odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi odpornościowej.
- Zrozumienie różnorodności haplotypów jest istotne dla badań nad asocjacjami z chorobami.
- Metody konwencjonalne często charakteryzują się niską przepustowością i są kosztowne.
- Metoda qKAT pozwala na efektywne pozyskiwanie informacji o liczbie kopii genów.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody typowania genów KIR.
- Zbadanie zależności między genetyką KIR a chorobami.
- Ułatwienie badań w dziedzinie immunogenetyki oraz badań populacyjnych.
Zastosowane metody
- Projektowanie specyficznych starterów do detekcji genów KIR.
- Zastosowanie reakcji multipleksowych celujących w geny KIR oraz gen referencyjny.
- Real-time PCR w celu monitorowania amplifikacji.
- Analiza danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania do oceny liczby kopii.
Główne wyniki
- qKAT pozwala na analizę prawie 1 000 próbek w jednym przebiegu.
- Zidentyfikowano najczęstsze liczby kopii dla KIR2DL4 oraz KIR3DS1.
- Metoda wykazała wiarygodność w kwantyfikowaniu liczb kopii genów KIR.
- Ułatwiło to dalsze badanie roli KIR w chorobach.
Wnioski
- qKAT jest cennym narzędziem dla badaczy w dziedzinie immunogenetyki.
- Umożliwia ono lepsze zrozumienie funkcji genów KIR w zdrowiu i chorobie.
- Metodę tę można dostosować do różnych zastosowań w genetyce populacyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Kluczowe znaczenie dla przemysłu
Dokładne genotypowanie polimorficznych locus receptorów immunologicznych, takich jak KIR, jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w badaniach nad immunologią i transplantologią. Metoda qKAT umożliwia analizę liczby kopii o wysokiej rozdzielczości w dużych kohortach, co wspiera zrozumienie mechanizmów oporności na choroby oraz odpowiedzi terapeutycznej pośredniej przez komórki NK. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania, łącząc zmienność genetyczną z wynikami funkcjonalnymi w modelach chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zmienności liczby kopii genów KIR w celu wyjaśnienia różnorodności haplotypów oraz ich wpływu na funkcję receptorów komórek NK.
- Wartość operacyjna: Zapewnia półautomatyczne, wysokoprzepustowe genotypowanie kompatybilne z formatami 96- i 384-dołkowymi, co pozwala na skalowalną obróbkę próbek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych o liczbie kopii dla wszystkich genów KIR z wykorzystaniem multipleksowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem sond hydrolitycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testu poprzez normalizację względem genów referencyjnych oraz zdefiniowane przepływy analizy (2nd Derivative Max, Fit Points).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia badanie interakcji KIR-HLA w kontekstach chorobowych, takich jak infekcje wirusowe, nowotwory i transplantologia.
- Wartość operacyjna: Generuje dane informujące o haplotypach, które można wykorzystać w dalszym sekwencjonowaniu lub testach funkcjonalnych w celu odkrywania nowych alleli.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda qKAT wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytowych po walidację przedkliniczną, szczególnie w sytuacjach, gdy mechanizmy efektorowe układu odpornościowego wpływają na skuteczność terapeutyczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie liczby kopii KIR z aktywnością komórek NK w fenotypach związanych z chorobami.
- Przesiewanie: Umożliwia wykorzystanie gotowych systemów biologicznych o zdefiniowanych genotypach KIR do przesiewania związków w modelach immunologicznych.
- Analityka: Dostarcza danych z kwantyfikacji względnej, odpowiednich do określania liczby kopii oraz porównań statystycznych pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy profilowanie genetyczne z ciągłością przedkliniczną w modelach reconstitucji immunologicznej lub choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowana jako wielokrotnego użytku platforma genotypowania, którą można zastosować w portfolio immunologii, onkologii i zdrowia reprodukcyjnego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów immunologicznych poprzez wysokorozdzielcze profilowanie genetyczne loci polimorficznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej obsłudze odczynników, przygotowaniu master mixu w łańcuchu chłodniczym oraz zautomatyzowanemu przetwarzaniu płytek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wielkoskalową stratyfikację genetyczną w badaniach wczesnej fazy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera progresję dostosowaną do ryzyka poprzez identyfikację haplotypów KIR związanych z różnicową odpowiedzią na leczenie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w konfiguracji real-time PCR, projektowaniu starterów i sond oraz obsłudze oprogramowania do analizy liczby kopii.
- Zależne od instrumentacji qPCR kompatybilnej z płytkami 384-dołkowymi oraz od manipulatorów mikroplatek w celu automatyzacji.
- Wymaga standaryzacji pomiędzy zespołami w zakresie kwantyfikacji DNA, spójności nakładania próbek na płytki oraz kontroli zanieczyszczeń.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzaniu metody na modele niehumanoidalne lub alternatywne geny referencyjne.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność dokładnej kwantyfikacji DNA, stosowanie odczynników chronionych przed światłem oraz kontrolę jakości danych surowych w celu zapewnienia zgodności z regułą LD.
