Name: qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę qKAT do ilościowego typowania genów KIR w badaniach immunogenetycznych. Ta technika umożliwia analizę liczby kopii genów receptorów komórek NK i ich związku z chorobami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt otrzymał finansowanie od Rady ds. Badań Medycznych (MRC), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 695551) oraz od National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre i NIH Research Blood and Transplant Research Unit (NIHR BTRU) w zakresie dawstwa i transplantacji narządów na Uniwersytecie Cambridge oraz we współpracy z NHS Blood and Transplant (NHSBT). Wyrażone poglądy są poglądami autorów, a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR, Departamentu Zdrowia lub NHSBT.

1. Przygotowanie i posiewanie z DNA
<ol>
	<li>Dokładne określenie ilościowe stężenia gDNA za pomocą przyrządu spektrofotometrycznego lub fluorometrycznego.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA do 4 ng/μl na 96-dołkowej płytce głębinowej. Dołącz co najmniej jedną kontrolną próbkę gDNA o znanej liczbie kopii i jedną kontrolę bez matrycy.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkowe płytki o masie 450 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Za pomocą przyrządu do obchodzenia się z cieczami dozuj każdą próbkę w poczwórnym duplikacji na 384-dołkowe płytki qPCR, tak aby każda studzienka zawierała 10 ng DNA (2,5 μl / dołek). Przygotuj co najmniej dziesięć płytek 384-dołkowych, po jednej na każdą reakcję qKAT.</li>
	<li>Jeśli gDNA jest dozowane z więcej niż jednej 96-dołkowej płytki, wykonaj pełne mycie 2% wybielaczem i ultraczystą wodą, aby wyczyścić igły systemu obsługi płynów między każdą 96-dołkową płytką próbek gDNA.</li>
	<li>Wysuszyć DNA na powietrzu, inkubując 384-dołkowe płytki w czystym miejscu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie starterów i sond
UWAGA: qKAT składa się z dziesięciu reakcji multipleksowych. Każda reakcja obejmuje trzy pary starterów i trzy sondy znakowane fluorescencyjnie, które specyficznie amplifikują dwa geny KIR i jeden gen referencyjny. Sondy, które zostały opublikowane w Jiang et al.27 zostały zmodyfikowane tak, że oligonukleotydy są teraz znakowane barwnikami ATTO, ponieważ oferują lepszą fotostabilność i długą żywotność sygnału. Wstępnie podymimulowane kombinacje podkładów są dostępne w handlu (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przygotować kombinacje starterów dla każdej reakcji zgodnie z rozcieńczeniami podanymi w tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować kombinacje sond dla każdej reakcji zgodnie z tabelą 1. Przetestuj każdą pojedynczą sondę przed wykonaniem kombinacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie Master Mixu
UWAGA Objętości wymienione poniżej służą do przeprowadzenia jednej reakcji qKAT na zestawie 10 płytek 384-dołkowych.
<ol>
	<li>Upewnij się, że próbki gDNA posiane na płytkach 384-dołkowych są całkowicie suche. Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i utrzymuj odczynniki przykryte przed ekspozycją na światło tak bardzo, jak to możliwe, ponieważ sondy znakowane fluorescencyjnie są światło- i termoczułe.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotności buforu qPCR, startera i sondy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na lodzie przygotuj mieszankę wzorcową dla 10 płytek 384-dołkowych, dodając 18,86 ml ultraczystej wody, 20 ml buforu qPCR, 1 000 μl wstępnie przygotowanej kombinacji starterów i 180 μl wstępnie przygotowanej kombinacji sond (Tabela 2).</li>
	<li>Rozprowadzić mieszankę wzorcową równomiernie na płytce dołka o głębokości 96 za pomocą pipety wielokanałowej, pipetując 415 μl do każdego dołka. Przechowuj ten talerz w pojemniku na lód przykrytym przed światłem.</li>
	<li>Za pomocą przyrządu do obchodzenia się z cieczami dozować 9,5 μl mieszanki głównej do każdego dołka płytki 384-dołkowej z wysuszonym gDNA. Uszczelnić płytkę folią i natychmiast umieścić ją w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten proces dla pozostałych płytek, upewniając się, że igły systemu obchodzenia się z cieczami zostały umyte wodą między każdą płytką.</li>
	<li>Odwirować 384-dołkowe płytki o sile 450 x g przez 3 minuty i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc lub między 6-12 godzinami w celu ponownego zawieszenia DNA i rozproszenia pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
4. Test qPCR
<ol>
	<li>Po całonocnej inkubacji odwirować przy 450 x g przez 3 minuty, aby rozproszyć pozostałe pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>W celu automatyzacji należy podłączyć maszynę qPCR (np. LightCycler 480) do urządzenia do obsługi mikropłytek (patrz Tabela materiałów). Zaprogramować manipulator mikropłytek tak, aby umieszczał płytki w maszynie qPCR z chłodzonej stacji dokującej, która jest chroniona przed światłem. 
	UWAGA Testy powinny teoretycznie działać na innych maszynach qPCR z kompatybilnymi ustawieniami optycznymi.</li>
	<li>Stosować następujące warunki cyklu: 95 °C przez 5 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 66 °C przez 50 s, z gromadzeniem danych w temperaturze 66 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu biegu poproś robota, aby zebrał płytkę z maszyny qPCR i umieścił ją w doku do odrzutów.</li>
</ol>
5. Analiza po uruchomieniu
<ol>
	<li>Po amplifikacji oblicz wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) przy użyciu metody maksimum drugiej pochodnej lub metody Fit Points za pomocą oprogramowania maszyny qPCR (patrz Tabela materiałów), wykonując poniższe czynności.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie qPCR i w zakładce Navigator otwórz zapisany plik eksperymentu reakcyjnego dla jednej płytki.</li>
	<li>W przypadku analizy przy użyciu metody maksimum drugiej pochodnej wybierz zakładkę Analiza i utwórz nową analizę przy użyciu metody Abs Quant/Second Derived Max.
	<ol>
		<li>W oknie Utwórz nową analizę należy wybrać typ analizy: Abs Quant/Second Derivative Max method, podzbiór: All Samples, program: Amplifikacja, nazwa: Rx-DFO (gdzie x to numer reakcji).</li>
		<li>Wybierz Filter Comb i wybierz VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Gwarantuje to, że dane zebrane dla STAT6 zostaną wybrane.</li>
		<li>Wybierz Kompensacja kolorów dla VIC/HEX/Yellow555(533-580). Kliknij przycisk Oblicz. Powtórz to dla Fam (465-510) i Cy5/Cy5.5(618-660). Kliknij Zapisz plik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku analizy przy użyciu metody Fit Points wybierz opcję Abs Quant/Fit Points na karcie Analysis.
	<ol>
		<li>W oknie Utwórz nową analizę należy wybrać typ analizy: metoda Abs Quant/Fit Points, podzbiór: Wszystkie próbki, program: Amplifikacja, nazwa: RxF-DFO (gdzie x to numer reakcji).</li>
		<li>Wybierz odpowiednie filtry i kompensacje kolorów dla STAT6 i każdego z genów KIR (Fam/Cy5). Na karcie Pasmo szumów ustaw pasmo szumów, aby wykluczyć szum tła.</li>
		<li>Na karcie Analiza ustaw punkty dopasowania na 3 i wybierz opcję Pokaż punkty dopasowania. Kliknij przycisk Oblicz. Kliknij Zapisz plik.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Eksport wyników
<ol>
	<li>W oprogramowaniu qPCR otwórz zakładkę Navigator (Nawigator). Wybierz opcję Results Batch Export (Eksport wsadowy wyników).</li>
	<li>Otwórz folder, w którym są zapisane pliki eksperymentu, i przenieś je do prawej części okna. Kliknij Dalej. Wybierz nazwę i lokalizację eksportowanego pliku.</li>
	<li>Wybierz Typ analizy Abs Quant/Second Derivative Max method lub Abs Quant/Fit Points. Kliknij Dalej. Sprawdź, czy nazwa pliku, folder eksportu i typ analizy są poprawne, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć proces eksportu.</li>
	<li>Poczekaj, aż stan eksportu zmieni się na Ok. Ekran automatycznie przejdzie do następnego kroku. Sprawdź, czy wszystkie wybrane pliki zostały pomyślnie wyeksportowane, aby liczba plików, które zakończyły się niepowodzeniem = 0. Kliknij Gotowe.</li>
	<li>Użyj skryptów split_file.pl i roche2sds.pl, aby podzielić wyeksportowane płytki na indywidualne reakcje dla każdej płyty. 
	UWAGA Skrypty są dostarczane na żądanie/GitHub.</li>
</ol>
7. Kopiuj obliczenia liczbowe
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy numerów kopii (np. CopyCaller). Wybierz opcję Importuj plik z wynikami PCR w czasie rzeczywistym i załaduj pliki tekstowe utworzone przez roche2sds.pl.</li>
	<li>Wybierz opcję Analizuj i przeprowadź analizę, wybierając kalibrator próbki ze znanym numerem kopii lub wybierając najczęstszy numer kopii. W Tabeli 5 przedstawiono najczęstszą liczbę kopii genów KIR zwykle obserwowaną w populacjach pochodzenia europejskiego.</li>
</ol>
8. Kontrole jakości danych
<ol>
	<li>Użyj skryptu języka R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R, aby połączyć dane kopii numerów ze wszystkich tablic w arkuszu kalkulacyjnym. 
	UWAGA Skrypty są dostarczane na żądanie/GitHub.</li>
	<li>Ponownie sprawdź surowe dane w oprogramowaniu do analizy liczby kopii dla próbek, które nie są zgodne ze znaną nierównowagą sprzężeń (LD) dla genów KIR (Tabela 6).</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
<li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+%28HLA%29+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+%28KIR%29+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+%28KIR%29+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li>
<li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-4-44">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li>
<li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A%2A11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li>
<li>Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li>
<li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li>
<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
<li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li>
<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
<li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+locus+polymorphisms%3A+genotyping+and+disease+association+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li>
<li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+%28KIR%29+gene+sequence+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li>
<li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li>
<li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection%3A+Evidence+for+discrete+immunological+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li>
<li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2DL1%2C+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qKAT%3A+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy nowatorską, półautomatyczną, wysokoprzepustową metodę o nazwie qKAT, która ułatwia typowanie liczby kopii genów KIR. Metoda ta stanowi postęp w stosunku do konwencjonalnych metod, takich jak SSP-PCR, które są niskoprzepustowe i mogą jedynie wskazywać na obecność lub brak tych wysoce polimorficznych genów.
Dokładność uzyskanych danych dotyczących liczby kopii zależy od wielu czynników, w tym od jakości i jednorodności stężenia próbek gDNA oraz jakości odczynników. Jakość i dokładność próbek gDNA na płytce są niezwykle ważne, ponieważ różnice w stężeniu na płytce mogą powodować błędy w obliczeniach liczby kopii. Ponieważ testy zostały zwalidowane przy użyciu zestawów próbek pochodzenia europejskiego, dane z kohort z innych części świata wymagają dokładniejszych kontroli. Ma to na celu zapewnienie, że przypadki zaniku alleli lub niespecyficznego wiązania starter/sonda nie zostaną błędnie zinterpretowane jako zmiana liczby kopii.
Chociaż testy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem wysokiej przepustowości, można je modyfikować w celu badania mniejszej liczby próbek. Metryka ufności w oprogramowaniu do analizy liczby kopii ulega pogorszeniu w przypadku analizy mniejszej liczby próbek, ale można ją poprawić, jeśli na płytce zostaną uwzględnione kontrolne próbki genomowego DNA o znanym numerze kopii genu KIR i uwzględnione zostaną dodatkowe powtórzenia próbek.
W przypadku laboratoriów bez robotów do obsługi cieczy/płytek, mieszanka wzorcowa może być dozowana za pomocą pipet wielokanałowych, a płytki można ręcznie ładować do urządzenia qPCR.
Głównym celem stojącym za opracowaniem qKAT było stworzenie prostej, wysokoprzepustowej, wysokorozdzielczej i opłacalnej metody genotypowania KIR do badań asocjacyjnych chorób. Udało się to osiągnąć, ponieważ qKAT został wykorzystany do zbadania roli KIR w kilku dużych badaniach asocjacji chorób, w tym w szeregu chorób zakaźnych, chorób autoimmunologicznych i zaburzeń ciąży 4,24,25,26.

U ludzi, locus receptora immunoglobulinowego (KIR) jest odwzorowany na długim ramieniu chromosomu 19 w kompleksie receptorów leukocytów (LRC). Locus ten ma około 150 kb długości i zawiera 15 genów KIR ułożonych od głowy do ogona. Obecnie znane loci KIR to KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 oraz dwa pseudogeny, KIR2DP1 i KIR3DP1. Geny KIR kodują dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D) immunoglobulinopodobne receptory domenowe z krótkimi (S; aktywującymi) lub długimi (L; hamującymi) ogonami cytoplazmatycznymi, które ulegają ekspresji przez komórki NK i podzbiory limfocytów T. Zmienność liczby kopii wykazywana w locus KIR tworzy różnorodne haplotypy o zmiennej zawartości genów1. Niealleliczną rekombinacją homologiczną (NAHR), ułatwioną przez bliski układ genów od głowy do ogona i homologię o wysokiej sekwencji, jest mechanizmem, który uważa się za odpowiedzialny za zmienność haplotypową. W populacjach na całym świecie zgłoszono ponad 100 różnych haplotypów1,2,3,4. Wszystkie te haplotypy można podzielić na dwie główne grupy: haplotypy A i B. Haplotyp A zawiera 7 genów KIR: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1 i KIR3DL2, które są genami hamującymi KIR, oraz aktywujący gen KIR KIR2DS4. Jednak nawet 70% osób pochodzenia europejskiego, które są homozygotyczne pod względem haplotypu A KIR, ma wyłącznie niefunkcjonalną formę "delecji" KIR2DS45,6. Wszystkie inne kombinacje genów KIR tworzą haplotypy grupy B, w tym co najmniej jeden ze specyficznych genów KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2 i KIR2DL5 i zazwyczaj zawierają dwa lub więcej aktywujących genów KIR.
Cząsteczki HLA klasy I zostały zidentyfikowane jako ligandy dla pewnych receptorów hamujących (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 i KIR3DL1), receptorów aktywujących (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5 i KIR3DS1), oraz dla KIR2DL4, które jest unikalnym KIR który zawiera długie ogony cytoplazmatyczne, podobnie jak inne hamujące receptory KIR, ale ma również dodatnio naładowaną resztę w pobliżu domeny zewnątrzkomórkowej, co jest wspólną cechą innych aktywujących receptorów KIR. Połączenie wariantów w obrębie genów KIR i genów HLA wpływa na interakcję liganda receptora, która kształtuje potencjalną odpowiedź komórek NK na poziomie indywidualnym7,8. Dowody z badań asocjacji genetycznych wskazują, że KIR odgrywa rolę w oporności wirusów (np. ludzki wirus niedoboru odporności [HIV]9 i wirus zapalenia wątroby typu C [HCV]10), powodzenie transplantacji11, ryzyko zaburzeń ciąży i sukces reprodukcyjny12,13, ochrona przed nawrotem choroby po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)14,15,16, oraz ryzyko zachorowania na nowotwory17.
Połączenie homologii o wysokiej sekwencji oraz różnorodności allelicznej i haplotypowej stanowi wyzwanie w zadaniu dokładnego genotypowania genów KIR. Konwencjonalne metody typowania genów KIR obejmują specyficzną dla sekwencji starter (SSP), reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)18,19,20, specyficzna dla sekwencji sonda oligonukleotydowa (SSOP) PCR21 oraz desorpcja laserowa wspomagana matrycą-jonizacja czasu lotu spektrometria mas (MALDI-TOF MS)22. Wadą tych technik jest to, że zapewniają one tylko częściowy wgląd w genotyp osobnika, a jednocześnie są pracochłonne w wykonaniu. Ostatnio sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zostało zastosowane do typowania locus KIR. Chociaż ta metoda jest bardzo wydajna, może być kosztowna w uruchomieniu, a przeprowadzanie dogłębnych analiz i sprawdzania danych jest czasochłonne.
qKAT to wysokoprzepustowa ilościowa metoda PCR. Podczas gdy konwencjonalne metody są pracochłonne i czasochłonne, ta metoda umożliwia przeprowadzenie prawie 1000 próbek genomowego DNA (gDNA) w ciągu pięciu dni i daje genotyp KIR, a także liczbę kopii genu. qKAT składa się z dziesięciu reakcji multipleksowych, z których każda jest ukierunkowana na dwa loci KIR i jeden gen referencyjny o ustalonej liczbie kopii w genomie (STAT6) używany do względnej kwantyfikacji liczby kopii genu KIR23. Test ten został z powodzeniem wykorzystany w badaniach obejmujących duże panele populacyjne i kohorty chorób zakaźnych, takich jak HCV, choroby autoimmunologiczne, takie jak cukrzyca typu 1 i zaburzenia ciąży, takie jak stan przedrzucawkowy, a także stanowi genetyczne podstawy dla badań mających na celu zrozumienie funkcji komórek NK1,4,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Sigma</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>SEKWENCJE: Wymienione w Tabeli 4</td></tr><tr><td>Sondy oznaczone barwnikami ATTO</td><td>Sigma</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>SEKWENCJE: Wymienione w Tabeli 3</td></tr><tr><td>Sonda SensiFAST No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>MiliQ woda</td><td>&minus;</td><td>&minus;</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z obrotowym wirnikiem kubełkowym</td><td>Eppendorf (lub odpowiednik)</td><td>Eppendorf 5810R lub równoważny system</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Naukowy</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II Instrument 384-dołkowy</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II Mikropłytka z M&eacute; Termiczny układarka płytowa Cour (M&eacute; Cour)</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (zakres objętości: 0,5&ndash; 10 &mikro; L, 2&ndash; 20 &mikro; L, 20&ndash; 200 i mikro; L, 200&ndash; 1 000 i mikro; L; 1-10 mL)</td><td>Gilson (lub odpowiednik)</td><td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet bez RNaz i DNaz filtrowane (10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1,000 i mikro; L, 10 mL)</td><td>Starlab (lub odpowiednik)</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika StarTub PS, 55 ml</td><td>Probówka</td> wirówkowa STARLAB <td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka głębinowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384 Płytki wielodołkowe</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Applied Biosystems CopyCaller v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr> <tr><td></td>identyfikator <td></td><td></td><td>haplotypu KIR</td> http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</tr></tbody></table>

qkat: ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Receptory immunoglobulinowe komórek zabójczych (KIRs) to zestaw hamujących i aktywujących receptorów immunologicznych na limfocytach NK i T, kodowanych przez polimorficzny klaster genów na chromosomie 19. Ich najlepiej scharakteryzowanymi ligandami są cząsteczki ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), które są kodowane w locus głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na chromosomie 6. Istnieje wiele dowodów na to, że odgrywają one znaczącą rolę w odporności, reprodukcji i transplantacji, co sprawia, że tak ważne jest posiadanie technik, które mogą je dokładnie genotypować. Jednak homologia o wysokiej sekwencji, a także zmienność alleli i liczby kopii utrudniają zaprojektowanie metod, które mogą dokładnie i skutecznie genotypować wszystkie geny KIR. Tradycyjne metody są zwykle ograniczone pod względem rozdzielczości uzyskanych danych, przepustowości, opłacalności oraz czasu potrzebnego na przygotowanie i przeprowadzenie eksperymentów. Opisujemy metodę zwaną ilościowym półautomatycznym typowaniem KIR (qKAT), która jest wysokoprzepustową metodą wielopoziomowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym, która może określić liczbę kopii genów dla wszystkich genów w locus KIR. qKAT to prosta metoda o wysokiej przepustowości, która może dostarczyć danych o liczbie kopii KIR o wysokiej rozdzielczości, które można dalej wykorzystać do wnioskowania o różnicach w strukturalnie polimorficznych haplotypach, które je obejmują. Te dane dotyczące liczby kopii i haplotypów mogą być korzystne dla badań nad powiązaniami chorób na dużą skalę, genetyką populacyjnej, a także badaniami nad ekspresją i funkcjonalnymi interakcjami między KIR i HLA.

Ilościowe półautomatyczne typowanie immunoglobuliny z komórek zabójczych (KIR) (qKAT) to prosta, wysokoprzepustowa i opłacalna metoda kopiowania genów KIR typu liczbowego do ich zastosowania w badaniach populacyjnych i asocjacyjnych chorób.

qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące genetyki receptorów komórek NK, takie jak różnorodność haplotypów i ich związek z chorobą. Wizualna demonstracja tej metody pomoże w ustaleniu protokołu w laboratorium, w tym procesu automatyzacji i analizy danych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, qKAT, co oznacza ilościowe automatyczne typowanie KIR, jest wysokoprzepustowy i zapewnia liczbę kopii genów.qKAT może dostarczyć informacji na temat związku chorobowego. Implikacje tej techniki mogą być przydatne w terapii infekcji wirusowych, takich jak HIV i wirusowe zapalenie wątroby typu C, w nowotworach, po przeszczepach komórek macierzystych i zaburzeniach ciąży. qKAT może być również stosowany w badaniu genetyki populacyjnej, a także w badaniu ekspresji i interakcji funkcjonalnych między cząsteczkami KIR i HLA.qKAT składa się z 10 reakcji multipleksowych, które są specyficznie ukierunkowane na eksony dwóch genów KIR i jeden gen referencyjny. W tym protokole specyficzne startery są zaprojektowane do wykrywania alleli danego genu, a wyniki PCR w krótkich amplikonach. Następnie podwójnie znakowane specyficzne sondy hydrolizy są używane do monitorowania amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym.Analiza liczby kopii wykorzystuje względną kwantyfikację docelowych genów KIR w stosunku do genu referencyjnego. qKAT został zaprojektowany i skonfigurowany jako technika wysokoprzepustowa. W związku z tym każdą reakcję można przeprowadzić na nieco poniżej 1 000 próbek.Poniższe kroki pokazują etapy związane z przygotowaniem i posiewem z każdej 96-dołkowej płytki DNA. Na początek, po ilościowym określeniu DNA, rozcieńczyć DNA w 96-dołkowej płytce głębokiej. Dołącz co najmniej jedną próbkę kontrolną o znanym numerze kopii i jedną próbkę kontrolną inną niż szablon.Odwirować płytkę o masie 450 g przez dwie minuty. Następnie dozuj każdą próbkę w czterokrotnym duplikacji do 384-dołkowych płytek qPCR. Następnie wysusz DNA na powietrzu w czystym miejscu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Aby uruchomić jedną reakcję qKAT dla 10 płytek 384-dołkowych, najpierw rozmrozić bufor qPCR, starter i podwielokrotności sondy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę wzorcową na 96-dołkowej płytce głębinowej.Dozować 9,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej studzienki płytki z wysuszonymi próbkami gDNA. Następnie uszczelnij płytkę folią i natychmiast przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy pamiętać o wykonaniu krótkiego mycia wodą w celu oczyszczenia igieł systemu obsługi płynów, jeśli dozuje się mieszankę wzorcową na więcej niż jedną 384-dołkową płytkę DNA.Odwirować płytkę z próbkami gDNA o masie 450 g przez trzy minuty. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby ponownie zawiesić DNA i rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza. Po inkubacji płytki przez noc powtórz wirowanie, aby rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie umieść płytę w chłodzonej stacji dokującej. Podłączyć maszynę qPCR do urządzenia do obsługi mikropłytek. Następnie należy zaprogramować obsługę mikropłytek zgodnie z protokołem tekstowym.Po zakończeniu biegu poproś robota, aby zebrał płytkę z maszyny qPCR i umieścił ją w doku do odrzutów. Po zakończeniu amplifikacji otwórz oprogramowanie qPCR. Na karcie Nawigator otwórz zapisany plik eksperymentu reakcji dla płytki.Następnie należy otworzyć okno Utwórz nową analizę i wybrać odpowiednie ustawienia dla metody 2. pochodnej maksymalnej. Następnie wybierz opcję Filter Comb i upewnij się, że wybrano dane zebrane dla STAT6. Wybierz odpowiednią kompensację kolorów.Kliknij przycisk Oblicz, a następnie kliknij przycisk Zapisz plik. Aby przeanalizować dane za pomocą metody Fit Points, należy otworzyć okno Create new analysis (Utwórz nową analizę) i wybrać odpowiednie ustawienia dla metody Fit Points. Następnie wybierz odpowiednie filtry i kompensacje kolorów dla STAT6.Ustaw pasmo szumów, aby wykluczyć szum tła. Następnie otwórz kartę Analiza i ustaw punkty dopasowania na trzy, a następnie wybierz opcję Pokaż punkty dopasowania. Zapisz zmiany i powtórz kroki z odpowiednimi ustawieniami dla analizy Fit Point i 2nd Derivative dla genów KIR.Otwórz zakładkę Navigator w oprogramowaniu qPCR i wybierz opcję Results Batch Export. Następnie otwórz folder zawierający pliki eksperymentu i przenieś je na prawą stronę okna. Kliknij przycisk Dalej, a następnie wybierz nazwę i lokalizację pliku eksportu.Następnie wybierz interesujący Cię typ analizy i kliknij przycisk Dalej. Upewnij się, że nazwa pliku, folder eksportu i typ analizy są poprawne przed kliknięciem przycisku Dalej, aby rozpocząć proces eksportowania. Gdy status eksportu zmieni się na OK, ekran automatycznie przejdzie do następnego kroku.Upewnij się, że wszystkie wybrane pliki zostały pomyślnie wyeksportowane i kliknij przycisk Gotowe. Następnie za pomocą skryptów w protokole tekstowym podziel wyeksportowane tablice na poszczególne reakcje i przekonwertuj pliki na oprogramowanie do odczytu przez oprogramowanie do analizy numerów kopii. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy liczby kopii i wybierz opcję Importuj plik wyników PCR w czasie rzeczywistym, aby załadować pliki tekstowe utworzone przez skrypty.Na koniec wybierz pozycję Analizuj i przeprowadź analizę, wybierając pozycję Najczęstszy numer kopii próbki. W tym protokole do kopiowania genów KIR typu liczbowego użyto półautomatycznego typowania lub qKAT. Najczęstszym numerem kopii dla KIR2DL4 były dwie kopie, podczas gdy najczęstszym numerem kopii dla KIR3DS1 było zero.Podczas próby tej procedury niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że DNA jest dokładnie określone ilościowo, aby przeprowadzić wszystkie kroki na lodzie i upewnić się, że odczynniki są pokryte światłem. Ważne jest również, aby przeprowadzić dokładne kontrole surowych danych dla próbek, które nie są zgodne ze znanymi regułami LD dla genów KIR. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład obecność genów fuzyjnych lub identyfikacja nowych alleli.Po jej opracowaniu metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogenetyką do zbadania roli KIR w biologii komórek NK, odporności na choroby i rozrodzie człowieka.

qkat-quantitative-semi-automated-typing-killer-cell-immunoglobulin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy technikę opartą na cytometrii przepływowej, aby określić proporcję indukowanych przez cytokiny limfocytów T, komórek CIK, rozwiniętych z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Rozpoznawanie markerów CD ludzkich komórek zabójczych indukowanych cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę in vitro do pomiaru cytotoksyczności komórek zabójczych (CIK) indukowanych cytokinami przeciwko komórkom nowotworowym. Po kokulturze docelowych komórek rakowych z komórkami CIK, martwe komórki rakowe są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika żywotności i oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, szacując cytotoksyczne działanie komórek CIK.

Test in vitro do badania zdolności cytotoksycznych komórek zabójczych indukowanych cytokinami

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Poznaj metodę qKAT do ilościowego typowania genów KIR w badaniach immunogenetycznych. Ta technika umożliwia analizę liczby kopii genów receptorów komórek NK i ich związku z chorobami.

qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych

Przeglądaj więcej filmów