Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP

Protokół ten odnosi się do potencjalnego zastosowania płytek krwi jako wysoce czułego czujnika tlenku azotu zarówno in vitro, jak i in vivo we krwi. Zwiększona fosforylowana fosfoproteina stymulowana rozszerzeniem naczyń krwionośnych lub seryna P-VASP 239 w płytkach krwi tlenek azotu ma pewne zalety, w tym zdolność do wykrywania obecności tlenku azotu w liniach nanomolowych. W ciągu dwóch godzin od pobrania od 30 do 50 mililitrów krwi pełnej od zdrowego dawcy dodaj pięć mililitrowych porcji krwi do odpowiedniej liczby 15-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania.

Za pomocą plastikowej pipety transferowej ostrożnie pobrać osocze bogatopłytkowe z górnej części supernatantów. Opastylizować płytki krwi bogate w osocza za pomocą drugiego wirowania i delikatnie umyć granulki w pięciu mililitrach buforu CGS. Wirować przy 400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec wirowania ponownie zawieś granulki w trzech mililitrach zmodyfikowanego buforu Tyrode. Do liczenia należy użyć hemocytometru i dostosować gęstość zawiesin płytek krwi do trzykrotnie od 10 do ośmiu komórek na mililitr w świeżym buforze Tyrode. Następnie inkubować zawiesiny płytek krwi przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W międzyczasie zbierz czerwone krwinki z bezpłytkowych warstw osocza próbek krwi pełnej przez odwirowanie, a następnie cztery przemycia w pięciu mililitrach PBS na przemycie. Po ostatnim przemyciu wyrzucić supernatanty i wymieszać czerwone krwinki z jednym mililitrem płytek krwi bogatych w osocz w odpowiednim eksperymentalnym hematokrycie w butelkach polipropylenowych zamkniętych gumowymi korkami. Włóż igłę podłączoną do zbiornika helu do każdej przegrody i włóż igły o rozmiarze 26, aby wykonać wyloty gazu.

Następnie powoli obracaj butelki w temperaturze pokojowej i użyj pulsoksymetru do pomiaru ciśnienia cząstkowego tlenu w celu monitorowania procesu odtleniania. Szybkość spadku tlenu zależy od natężenia przepływu helu i prędkości mieszania. Dlatego czas natleniania powinien być zoptymalizowany przed rozpoczęciem eksperymentu, ponieważ jest on w dużym stopniu zależny od geometrii zestawu eksperymentalnego.

W celu redukcji azotynów krwinek czerwonych należy użyć mikrostrzykawki do wstrzyknięcia azotynów przez przegrodę do odtlenionych próbek PRP i erytrocytów, tak aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mikromolowe. Inkubować próbki przez co najmniej 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieść jeden mililitr każdej próbki do probówki mikrowirówkowej w celu odwirowania. Przenieść 300 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi z górnej części supernatantów do nowych probówek do mikrowirówek i dodać dekstrozę kwaśnego cytrynianu do każdej probówki w stosunku od jednego do dziewięciu.

Ponownie odwirować płytki krwi i ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy zawierającego koktajl inhibitorów proteazy po trzy do każdej probówki. Następnie załaduj 15 mikrogramów białka z każdej próbki do dwóch oddzielnych żeli 10%SDS-PAGE. Uruchom żele pod napięciem 120 woltów przez 1,3 godziny.

Na koniec cyklu należy przenieść żele do poszczególnych membran z podazotu celulozy i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania odpowiednią objętością 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie znakować odpowiednim przeciwciałem przeciwko wtórnej peroksydazie chrzanowej przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie naświetl membrany za pomocą imagera, aby określić ilościowo gęstość pasma za pomocą odpowiedniego programu do analizy obrazu.

Zdrowe próbki krwi żylnej mają wartości częściowego ciśnienia tlenu od 50 do 80 milimetrów słupa rtęci. Deoksygenacja helem szybko obniża ciśnienie parcjalne tlenu do 25 milimetrów słupa rtęci w ciągu 10 minut. Dalsze obniżenie ciśnienia parcjalnego tlenu można osiągnąć dzięki wydłużeniu czasu odtleniania.

Zwiększone odtlenienie prowadzi do zwiększonego poziomu hemolizy, na co wskazuje coraz bardziej czerwona plazma. Jest to efekt odtlenienia i nie jest spowodowany samym mieszaniem, na co wskazuje brak hemolizy w próbkach mieszanych bez helu. Zarówno poziomy ekspresji fosfoproteiny stymulowanej przez rozszerzenie naczyń krwionośnych lub VASP, jak i fosforylowanej VASP w płytkach krwi zmniejszały się wraz ze wzrostem hematokrytu w odtlenionych próbkach, jak wykryto za pomocą western blot.

Leczenie krótkotrwałym donorem tlenku azotu zwiększa ekspresję fosfoprotein stymulowanych przez fosforylowane leki rozszerzające naczynia krwionośne w płytkach krwi w ciągu 10 sekund od zabiegu. Ponadto poziomy fosforylowanego VASP lub P-VASP pozostały stabilne do 10 minut po inkubacji dawcy NO z osoczem bogatopłytkowym, co wskazuje, że istnieje wystarczający czas na oddzielenie erytrocytów od płytek krwi bez wpływu na istniejące poziomy P-VASP. Azotyny zwiększają również poziom P-VASP płytek krwi w obecności odtlenionych erytrocytów.

Tutaj stosunek P-VASP do całkowitego VASP zależy od poziomu hematokrytu. VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi i ulega szybkiej fosforylacji w obecności tlenku azotu. Dlatego protokół ten zapewnia metodę badania indukcji tlenku azotu przez różne bodźce fizjologiczne.

Dzięki tej metodzie z powodzeniem zastosowaliśmy podwyższony poziom P-VASP w płytkach krwi jako marker stymulacji tlenkiem azotu przez wdychane azotyny in vivo. Nie zapominaj, że praca z płytkami krwi z próbką biologiczną powinna zawsze odbywać się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.