Name: Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę wykrywania tlenku azotu we krwi za pomocą płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP. Protokół umożliwia nanomolarną detekcję in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu NIH dla dr Alana N. Schechtera.

UWAGA: Próbki krwi zostały pobrane z banku krwi NIH (protokół zatwierdzony przez IRB: 99-CC-0168).
1. Przygotowanie próbki krwi
UWAGA: Aby uniknąć aktywacji płytek krwi, powoli pobieraj krew i delikatnie mieszaj z cytrynianem, kilkakrotnie odwracając rurkę.
<ol>
	<li>Preparat osocza bogatopłytkowego (PRP)
	<ol>
		<li>Pobrać 30-50 ml krwi za pomocą igły o średnicy 20 g lub większej i dodać do probówki zawierającej cytrynian sodu (3,8%) w stosunku 1:9 lub kwaśną cytrynian-dekstrozę (ACD) (85 mM cytrynian trisodowy, 66,6 mM kwas cytrynowy, 111 mM glukozy, pH 4,5) w stosunku 1:6.</li>
		<li>Podwielokrotność 5 ml świeżo pobranej krwi pełnej do pustych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować krew pełną o sile 120 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie pobrać supernatant zawierający płytki krwi (osocze bogatopłytkowe, PRP) z górnej części za pomocą plastikowej pipety transferowej. 
		UWAGA: PRP z kroku 1.1.3 jest gotowy do użycia w eksperymentach lub do dalszego przetwarzania w celu przygotowania przemytych płytek krwi. Miękki osad otrzymany po odwirowaniu (etap 1.1.2) zawiera krwinki czerwone i krwinki białe i może być dalej oczyszczany w celu uzyskania przemytych krwinek czerwonych (RBC) – patrz etap 1.3. Eksperyment musi zostać zakończony w ciągu 2 godzin od pobrania krwi. Podczas zbierania PRP (supernatantu) należy unikać gromadzenia leukocytów zawierających otoczkę kożuchową nagromadzonych na granicy faz PRP/RBC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat z płukanymi płytkami krwi (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Odwirować zebrane PRP w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zachować granulki płytek krwi.</li>
		<li>Delikatnie umyć granulki, dodając 5 ml buforu CGS (120 mM NaCl, 12,9 mM cytrynian trisodowy i 30 mM glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić osady płytek krwi w 3 ml zmodyfikowanego buforu Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM pH glukozy 7,4).</li>
		<li>Rozcieńczyć płytki krwi (1:100 — na przykład 10 μl płytek krwi w 990 μl roztworu Reesa-Eckera) roztworem Reesa Eckera i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Dostosuj gęstość płytek krwi do 3 x 108 komórek/ml, dodając bufor Tyrode.</li>
		<li>Inkubować zawiesinę płytek krwi w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed rozpoczęciem doświadczenia. 
		UWAGA: Umyte płytki krwi są stabilne przez 5–8 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przemytych krwinek czerwonych (RBC)
	<ol>
		<li>Po zebraniu odwirować miękki osad otrzymany w kroku 1.1.3 przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad RBC 5 ml PBS przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
		<li>Wyrzuć PBS i użyj umytych krwinek czerwonych do dalszych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odtlenienie
<ol>
	<li>Dodać 1 ml mieszaniny PRP (przygotowanej w kroku 1.1.4 lub 1.2.4.) i erytrocytów (przygotowanych w kroku 1.3.) w żądanym hematokrycie do polipropylenowej butelki zamkniętej gumowym korkiem. Na przykład przy 20% hematokrycie dodaj 200 μl erytrocytów do 800 μl PRP. 
	UWAGA: Sugerowany hematokryt wynosi od 0% do 40%. Nie należy używać szklanej butelki ani kolby, ponieważ płytki krwi przylegają do powierzchni szkła.</li>
	<li>Włóż igłę podłączoną do zbiornika helu do zamkniętej butli i wykonaj wylot gazu, wkładając igłę 26 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Powoli obracaj butelką w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby gaz He przedostał się przez preparat krwi. W przypadku tej procedury preferowany jest powolny przepływ gazu, a zbyt szybki przepływ gazu He prowadzi do zwiększonej hemolizy. Najbardziej efektywny przepływ gazu musi zostać określony za pomocą próby, ponieważ w dużym stopniu zależy od geometrii układu doświadczalnego.</li>
	<li>Okresowo śledź proces odtleniania, mierząc ciśnienie parcjalne tlenu (pO2) za pomocą CO-oksymetru. 
	UWAGA: W naszych rękach 10 minut odtleniania zmniejsza pO2 do 25 mmHg, co jest wymagane do redukcji azotynów przez erytrocyty. Kontynuowanie odtleniania jeszcze bardziej zmniejszyło pO2 do 10 mmHg; jednak doprowadziło to do zwiększonej hemolizy i wzrostu hemoglobiny bezkomórkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Redukcja azotynów w czerwonych krwinkach
<ol>
	<li>Dodać 1 ml PBS (pH 7,4) do 0,0345 gNaNO2, aby uzyskać 500 mM roztworu podstawowego azotynów. Rozcieńczyć 500 mMNaNO2 do 250 μMNaNO2 (25x) przez seryjne rozcieńczanie w PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknąć azotyny (40 μl) przez przegrodę do odtlenionej próbki PRP i RBC, aby uzyskać końcowe stężenia 10 μM w sumie 1 ml próbki. 
	UWAGA: W tym eksperymencie końcowe stężenie użytego azotynu wynosi 10 μM.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut lub dłużej. 
	UWAGA: Dostosuj dokładny czas inkubacji RBC z azotynami potrzebnymi do maksymalnej redukcji azotynów dla różnych typów eksperymentów.</li>
	<li>Usunąć korek i odpipetować 1 ml próbki do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać pipetą 300 μl zawiesiny płytek krwi z górnej części supernatantu i wymieszać z ACD (pH 6,5) w stosunku 1:9. Wyrzuć osad RBC.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę płytek krwi o sile 500 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do granulek płytek krwi dodać 80 μl lodowatego buforu do lizy (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) zawierającego koktajl inhibitorów proteazy III (1:500).</li>
</ol>
4. Western Blotting VASP
<ol>
	<li>Załaduj 15 μg białka z każdej próbki do 2 oddzielnych 10% żeli SDS-PAGE. 
	UWAGA: Ostry bufor odpędzający, który zawiera b-merkaptoetanol, nie może usunąć P-VASPSer239 i przeciwciał VASP z membrany; w związku z tym P-VASP Ser239 i VASP powinny być uruchamiane oddzielnie.</li>
	<li>Uruchom żele pod napięciem 120 V przez 1,30 godziny i przenieś do membrany nitrocelulozowej.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku.</li>
	<li>Inkubować błonę z P-VASPSer239 (1:500), VASP (1:1,000) i GAPDH (1:1,000) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe peroksydazy chrzanowej (HRP) z membraną przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wystaw membranę za pomocą imagera i określ ilościowo gęstość pasma za pomocą ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

Dr Alan Schechter jest wymieniony jako współwynalazca kilku patentów wydanych dla National Institutes of Health na stosowanie soli azotynów w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Otrzymuje tantiemy na podstawie licencji NIH na te patenty na rozwój kliniczny, ale nie otrzymuje żadnego innego wynagrodzenia.

Ponieważ płytki krwi łatwo się aktywują, konieczne jest delikatne obchodzenie się z próbkami zawierającymi płytki krwi. Należy unikać szybkiego pipetowania i energicznego potrząsania. Inhibitory płytek krwi, takie jak prostacyklina (ChOG2), mogą być stosowane w celu zapobiegania aktywacji płytek krwi; Może to jednak wpływać na niektóre szlaki sygnałowe wewnątrz płytek krwi. Do przygotowania granulek płytek krwi dodajemy ACD do zawiesin płytek krwi i stosujemy wirowanie z niską prędkością.
<p class="jove_co...

Płytki krwi to małe fragmenty komórek w kształcie dysku, pochodzące z megakariocytów, które są kluczowe dla krzepnięcia krwi. Kaskada krzepnięcia jest inicjowana przez różne cząsteczki bioaktywne (takie jak kolagen lub ADP), uwalniane po uszkodzeniu ściany naczyniowej. Proces krzepnięcia krwi może być modyfikowany między innymi przez tlenek azotu (NO). NO, naturalnie wytwarzany przez komórki ssaków, jest jednym z najbardziej wszechstronnych sygnałów fizjologicznych. Działa jako silny środek rozszerzający naczynia krwionośne, neuroprzekaźnik i modulator immunologiczny, aby wymienić tylko kilka z wielu jego funkcji. W krwiobiegu NO pomaga również regulować stopień krzepnięcia krwi poprzez hamowanie agregacji płytek krwi. Jednym z najbardziej prawdopodobnych źródeł NO w krwiobiegu jest azotyn, jon nieorganiczny, który, jak wykazano, służy jako prekursor NO. W reakcji z czerwonymi krwinkami (RBC) azotyn jest redukowany do NO, a deoksyHb jest utleniany do methemoglobiny (metHb)1. NO uwalniany z erytrocytów jest wazoaktywny i powoduje wazorelaksację2. Ten szlak redukcji azotynów jest alternatywnym szlakiem wytwarzania NO, działającym razem i uzupełniającym klasyczną ścieżkę generowania NO przez śródbłonkową syntazę tlenku azotu w warunkach niedotlenienia.
Płytki krwi same w sobie nie są w stanie zredukować azotynu do NO, ale są bardzo wrażliwe na jego obecność. W nienaruszonych płytkach krwi NO w zakresie nanomolowym zwiększa cGMP (EC50 = 10 nM) i fosforylację VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Dlatego płytki krwi mogą służyć jako doskonały czujnik redukcji azotynów przez erytrocyty i uwalniania NO do krwi. Istnieje kilka metod, które mogą bezpośrednio mierzyć stopień aktywacji płytek krwi - takich jak agregegometria i tromboelastografia (TEG)4,5. Metody te wymagają jednak drogiego specjalistycznego oprzyrządowania i dość dużych ilości materiału. Możliwe jest również monitorowanie zdarzeń później, po uwolnieniu NO z erytrocytów, przy użyciu zmian w ekspresji białek powierzchniowych płytek krwi – takich jak P-selectin6. Wiadomo również, że NO zwiększa ilość cGMP w płytkach krwi7. Wcześniej używaliśmy cGMP do monitorowania uwalniania NO do krwi po redukcji azotynów przez odtlenione RBC8. Okazało się, że jest to bardzo delikatna metoda; jednak cGMP jest cząsteczką krótkotrwałą, a jej wykrycie wymaga dużego nakładu pracy. Inna możliwość, opisana w przedstawionym protokole, wykorzystuje fosforylację stymulowanego przez środek rozszerzający naczynia krwionośne białka fosfo (VASP) w celu wykrycia obecności NO we krwi. VASP jest substratem aktywacji kinazy białkowej G, która ulega fosforylacji w wyniku interakcji z NO poprzez szlak sGC / cGMP9. Wykrywalna fosforylacja VASP zachodzi przy bardzo niskich stężeniach NO, co może sprawić, że płytki krwi będą bardzo czułym detektorem obecności NO we krwi. VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi, ale nie w innych komórkach krwi, co pozwala na selektywne śledzenie zdarzeń z udziałem płytek krwi10.
Głównym celem tego protokołu jest szczegółowe opisanie metody wykrywania uwalniania NO w pełnej krwi za pomocą jej interakcji z płytkami krwi poprzez monitorowanie fosforylacji VASP11,12. Opisana metoda pozwala na wczesne wykrycie niskich stężeń NO - teoretycznie w zakresie nanomolowym, co sprawia, że obecny protokół jest bardziej czuły niż oznaczanie cGMP, ze względu na zastosowanie standardowych technik Western blot osiągalnych w większości warunków laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>Cytrynian trójsodowy</td><td>Dostawa przez bank</td><td></td><td></td>krwi NIH</tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Dostawa przez bank</td><td></td><td></td>krwi NIH</tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S-7653 1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; sodu fosforan jednozasadowy, monohydrat</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; chlorek potasu</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; wodorowęglan sodu</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; Kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[-etanosulfonowy]</td><td>Sigma</td><td>H3375-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); chlorek magnezu</td><td>Jakość Biologia</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Butelki ekonomiczne HDPE wąskootworowe</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>Czerwona przegroda Korek nr 29</td><td>Fisherbrand</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; azotyn sodu</td><td>Sigma</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA Base; Tris[hydroksymetylo]aminometan</td><td>Sigma</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; Glikol 4-nonylofenylo-polietylenowy</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koktajlowy inhibitorów proteazy III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Phospho-VASP (Ser239)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało VASP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Królicza mAb</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Przejrzystość Zachodni substrat ECL</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200ml</td><td></td></tr><tr><td>CO-oksymetr (ABL 90 flex)</td><td>Radiometr</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji vasp

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Płytki krwi to składniki krwi odpowiedzialne za prawidłowe krzepnięcie krwi. Ich funkcja jest silnie regulowana przez różne szlaki. Jeden z najsilniejszych czynników wazoaktywnych, tlenek azotu (NO), może również działać jako silny inhibitor agregacji płytek krwi. Bezpośrednie wykrywanie NO we krwi jest bardzo trudne ze względu na jego wysoką reaktywność z hemoglobiną bezkomórkową, która ogranicza okres półtrwania NO do zakresu milisekund. Obecnie brak zmian po interwencjach szacuje się jedynie na podstawie zmierzonych zmian azotynów i azotanów (członków szlaku metabolicznego azotan-azotyn-NO). Jakkolwiek precyzyjne, pomiary te są raczej trudne do zinterpretowania w stosunku do rzeczywistych zmian NO, ze względu na naturalnie wysokie wyjściowe poziomy azotynów i azotanów, które są o kilka rzędów wielkości wyższe niż oczekiwane zmiany samego NO. Dlatego opracowanie bezpośrednich i prostych metod, które pozwoliłyby na bezpośrednie wykrycie NO, jest już dawno spóźnione. Protokół ten odnosi się do potencjalnego zastosowania płytek krwi jako wysoce czułego czujnika NO we krwi. Opisuje początkowe osocze bogatopłytkowe (PRP) i przemyte preparaty płytek krwi oraz zastosowanie azotynów i odtlenionych czerwonych krwinek jako generatorów NO. Fosforylacja VASP w serynie 239 (P-VASPSer239) służy do wykrywania obecności NO. Fakt, że białko VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi i że ulega szybkiej fosforylacji, gdy obecny jest NO, prowadzi do wyjątkowej możliwości wykorzystania tego szlaku do bezpośredniego wykrywania obecności NO we krwi.

Próbki krwi żylnej mają wartości pO2 w zakresie 50-80 mmHg. Deoksygenacja helem szybko obniża pO2 do 25 mmHg w ciągu 10 min. Wydłużenie czasu deoksygenacji prowadzi do niewielkiego, dalszego spadku pO2. Jednakże zwiększenie czasu deoksygenacji powoduje również znaczący wzrost poziomu hemoglobiny wolnej od komórek (oznaczonej za pomocą oksymetru CO, widocznej na Rysunku 2 jako coraz bardziej czerwone zabarwienie osocza) (<stron...

Tutaj prezentujemy protokół dotyczący potencjalnego zastosowania płytek krwi jako bardzo czułego czujnika tlenku azotu we krwi. Opisano w nim wstępne przygotowanie płytek krwi oraz zastosowanie azotynów i odtlenionych krwinek czerwonych jako generatorów tlenku azotu.

Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Protokół ten odnosi się do potencjalnego zastosowania płytek krwi jako wysoce czułego czujnika tlenku azotu zarówno in vitro, jak i in vivo we krwi. Zwiększona fosforylowana fosfoproteina stymulowana rozszerzeniem naczyń krwionośnych lub seryna P-VASP 239 w płytkach krwi tlenek azotu ma pewne zalety, w tym zdolność do wykrywania obecności tlenku azotu w liniach nanomolowych. W ciągu dwóch godzin od pobrania od 30 do 50 mililitrów krwi pełnej od zdrowego dawcy dodaj pięć mililitrowych porcji krwi do odpowiedniej liczby 15-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania.Za pomocą plastikowej pipety transferowej ostrożnie pobrać osocze bogatopłytkowe z górnej części supernatantów. Opastylizować płytki krwi bogate w osocza za pomocą drugiego wirowania i delikatnie umyć granulki w pięciu mililitrach buforu CGS. Wirować przy 400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec wirowania ponownie zawieś granulki w trzech mililitrach zmodyfikowanego buforu Tyrode. Do liczenia należy użyć hemocytometru i dostosować gęstość zawiesin płytek krwi do trzykrotnie od 10 do ośmiu komórek na mililitr w świeżym buforze Tyrode. Następnie inkubować zawiesiny płytek krwi przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W międzyczasie zbierz czerwone krwinki z bezpłytkowych warstw osocza próbek krwi pełnej przez odwirowanie, a następnie cztery przemycia w pięciu mililitrach PBS na przemycie. Po ostatnim przemyciu wyrzucić supernatanty i wymieszać czerwone krwinki z jednym mililitrem płytek krwi bogatych w osocz w odpowiednim eksperymentalnym hematokrycie w butelkach polipropylenowych zamkniętych gumowymi korkami. Włóż igłę podłączoną do zbiornika helu do każdej przegrody i włóż igły o rozmiarze 26, aby wykonać wyloty gazu.Następnie powoli obracaj butelki w temperaturze pokojowej i użyj pulsoksymetru do pomiaru ciśnienia cząstkowego tlenu w celu monitorowania procesu odtleniania. Szybkość spadku tlenu zależy od natężenia przepływu helu i prędkości mieszania. Dlatego czas natleniania powinien być zoptymalizowany przed rozpoczęciem eksperymentu, ponieważ jest on w dużym stopniu zależny od geometrii zestawu eksperymentalnego.W celu redukcji azotynów krwinek czerwonych należy użyć mikrostrzykawki do wstrzyknięcia azotynów przez przegrodę do odtlenionych próbek PRP i erytrocytów, tak aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mikromolowe. Inkubować próbki przez co najmniej 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieść jeden mililitr każdej próbki do probówki mikrowirówkowej w celu odwirowania. Przenieść 300 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi z górnej części supernatantów do nowych probówek do mikrowirówek i dodać dekstrozę kwaśnego cytrynianu do każdej probówki w stosunku od jednego do dziewięciu.Ponownie odwirować płytki krwi i ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy zawierającego koktajl inhibitorów proteazy po trzy do każdej probówki. Następnie załaduj 15 mikrogramów białka z każdej próbki do dwóch oddzielnych żeli 10%SDS-PAGE. Uruchom żele pod napięciem 120 woltów przez 1,3 godziny.Na koniec cyklu należy przenieść żele do poszczególnych membran z podazotu celulozy i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania odpowiednią objętością 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie znakować odpowiednim przeciwciałem przeciwko wtórnej peroksydazie chrzanowej przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie naświetl membrany za pomocą imagera, aby określić ilościowo gęstość pasma za pomocą odpowiedniego programu do analizy obrazu.Zdrowe próbki krwi żylnej mają wartości częściowego ciśnienia tlenu od 50 do 80 milimetrów słupa rtęci. Deoksygenacja helem szybko obniża ciśnienie parcjalne tlenu do 25 milimetrów słupa rtęci w ciągu 10 minut. Dalsze obniżenie ciśnienia parcjalnego tlenu można osiągnąć dzięki wydłużeniu czasu odtleniania.Zwiększone odtlenienie prowadzi do zwiększonego poziomu hemolizy, na co wskazuje coraz bardziej czerwona plazma. Jest to efekt odtlenienia i nie jest spowodowany samym mieszaniem, na co wskazuje brak hemolizy w próbkach mieszanych bez helu. Zarówno poziomy ekspresji fosfoproteiny stymulowanej przez rozszerzenie naczyń krwionośnych lub VASP, jak i fosforylowanej VASP w płytkach krwi zmniejszały się wraz ze wzrostem hematokrytu w odtlenionych próbkach, jak wykryto za pomocą western blot.Leczenie krótkotrwałym donorem tlenku azotu zwiększa ekspresję fosfoprotein stymulowanych przez fosforylowane leki rozszerzające naczynia krwionośne w płytkach krwi w ciągu 10 sekund od zabiegu. Ponadto poziomy fosforylowanego VASP lub P-VASP pozostały stabilne do 10 minut po inkubacji dawcy NO z osoczem bogatopłytkowym, co wskazuje, że istnieje wystarczający czas na oddzielenie erytrocytów od płytek krwi bez wpływu na istniejące poziomy P-VASP. Azotyny zwiększają również poziom P-VASP płytek krwi w obecności odtlenionych erytrocytów.Tutaj stosunek P-VASP do całkowitego VASP zależy od poziomu hematokrytu. VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi i ulega szybkiej fosforylacji w obecności tlenku azotu. Dlatego protokół ten zapewnia metodę badania indukcji tlenku azotu przez różne bodźce fizjologiczne.Dzięki tej metodzie z powodzeniem zastosowaliśmy podwyższony poziom P-VASP w płytkach krwi jako marker stymulacji tlenkiem azotu przez wdychane azotyny in vivo. Nie zapominaj, że praca z płytkami krwi z próbką biologiczną powinna zawsze odbywać się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.

platelet-based-detection-nitric-oxide-blood-measuring-vasp

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zaprezentowano nieinwazyjną procedurę oceny funkcji śródbłonka z wykorzystaniem urządzenia Endo-PAT 2000.

Ocena funkcji rozszerzania naczyń śródbłonka za pomocą urządzenia Endo-PAT 2000

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.

Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Poznaj metodę wykrywania tlenku azotu we krwi za pomocą płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP. Protokół umożliwia nanomolarną detekcję in vitro i in vivo.

Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP

Przeglądaj więcej filmów