Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Metoda ta pozwala na precyzyjne oznaczanie ilościowe histonów rdzeniowych H3 i H4 oraz ich modyfikacje potranslacyjne z ekstraktów komórkowych i tkankowych, co prowadzi do uzyskania wysokiej jakości, powtarzalnych wyników. Prezentowana technika ma trzy główne zalety. Po pierwsze, zachowuje natywne modyfikacje potranslacyjne histonów.

Po drugie, omija drogie metody o niskiej przepustowości. Wreszcie, jest w pełni kompatybilny z dalszymi aplikacjami o średniej przepustowości. Procedurę zademonstruje Karolina Janczura, utalentowana doktorantka z mojego laboratorium, która w pełni zoptymalizowała ten protokół i zastosowała technikę, aby odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące regulacji epigenetycznej w chorobie Alzheimera.

Na początek umieść komórki w 10-centymetrowych naczyniach poddanych kulturze tkankowej z odpowiednią pożywką do hodowli komórkowych zgodnie z protokołem tekstowym. Pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną około 90% zbieżności. Po osiągnięciu przez komórki pożądanego zbiegu delikatnie zaaspiruj pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki wstępnie podgrzaną pożywką bez surowicy.

Następnie usuń pożywkę bez surowicy z komórek i umieść 10-centymetrowe szalki na lodzie. Dodaj jeden mililitr lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdego naczynia. Za pomocą plastikowego skrobaka do komórek zbierz komórki w buforze ekstrakcyjnym i przenieś je do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie umieść rurki na lodzie. Jeśli używana jest zamrożona chusteczka, umieść ją we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 mililitra i krótko rozmroź na lodzie. Następnie homogenizuj tkankę mózgową za pomocą ręcznego homogenizatora, używając zalecanej ilości bufora ekstrakcyjnego i liczby uderzeń.

Homogenizacja jest zakończona, gdy nie ma widocznych fragmentów tkanki, a roztwór nabiera mlecznego wyglądu. Następnie za pomocą jednokanałowej pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówki na lodzie. Umieść probówkę zawierającą lizaty komórkowe i homogenizowaną tkankę mózgową na obrotowej platformie obracającej się z prędkością 15 obrotów na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odwiruj probówkę z maksymalną prędkością przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wyrzuć osad. Następnie zneutralizuj histony za pomocą 1/4 objętości buforu neutralizującego i wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Użyj pasków pH, aby sprawdzić pH mieszaniny i w razie potrzeby dostosuj pH za pomocą buforu neutralizującego. Jeśli kwaśne histony nie zostaną zneutralizowane na tym etapie, nie zwiążą się prawidłowo z membraną kolumny, przejdą przez nią i zostaną wykryte w przepływie. Dodać 37,5 mikrolitra próbki do 12,5 mikrolitra buforu próbki.

Po krótkim odwirowaniu denaturować mieszaninę w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie umieść rurki na lodzie i krótko je obróć, aby zebrać kondensat. Załaduj próbkę do żelu SDS-PAGE i uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez godzinę.

Następnie zabejcuj żel przez noc. I odplamić go podczas trzech kolejnych prań. Najpierw dodaj 500 mikrolitrów bufora równowagi do każdej kolumny wirowej.

Odwirować kolumnę przez trzy minuty. Odrzucić przepływowy płyn i powtórzyć wirowanie jeszcze raz. Następnie dodaj 500 mikrolitrów próbki do kolumny.

Odwirować kolumnę przez trzy minuty i zebrać przepływ. Następnie przeanalizuj przepływ kolumny zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania do kolumny.

Odwirować kolumnę przez trzy minuty i zebrać przepływ. Przenieś kolumnę do nowej oznaczonej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 50 mikrolitrów buforu elucyjnego histonów do kolumny.

Po odwirowaniu kolumny zachowaj przepływ zawierający białka histonowe. Pod kapturem chemicznym dodaj kwas nadchlorowy do oczyszczonych histonów, aby uzyskać końcowe stężenie 4% kwasu nadchlorowego. Pipetuj w górę i w dół sześć razy, aby wymieszać.

Jeśli histony w próbce są bardzo skoncentrowane, roztwór stanie się mętny po dodaniu kwasu nadchlorowego. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Jeśli wytrącanie histonów przez noc zakończy się sukcesem, po etapie wirowania na dnie fiolki będzie widoczna mała biała osadka.

Podczas mycia osadu w kolejnych krokach upewnij się, że osad nie jest naruszony, ponieważ może łatwo odczepić się od dna fiolki. Następnego dnia odwirować próbki przez 75 minut we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek. Ostrożnie odessać supernatant i dodać 500 mikrolitrów lodowatego kwasu nadchlorowego do granulowanej próbki.

Po odwirowaniu próbki przez 10 minut z maksymalną prędkością, odessać supernatant. Dodać 500 mikrolitrów lodowatego acetonu do próbki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Następnie usuń sklarowany osad i pozostaw probówki do wyschnięcia bez korka na lodzie przez 30 minut.

Następnie wyjmij probówki z lodu i pozostaw próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po wyschnięciu granulki należy ją ponownie zawiesić w 30 mikrolitrach sterylnej wody. Zakryj probówki i pozwól histonom rozpuścić się na lodzie przez 30 do 50 minut.

Po sprawdzeniu, czy granulat jest ponownie zawieszony, ponownie zakryj rurki i wyjmij je z lodu. W tym protokole oczyszczono histony z ludzkich komórek mikrogleju BV-2 i przeanalizowano skład ekstraktu. Barwiony żel pokazuje, że czas ekstrakcji od 15 minut do 24 godzin nie wpłynął na ogólny skład surowych ekstraktów histonowych.

Efektywność wiązania histonów z matrycą kolumny analizowano poprzez barwienie żelu. Sprawność kolumny wynosiła około 100%, o czym świadczy brak wykrywalnych białek histonowych w przepływie kolumny. Niezależnie od czasu trwania ekstrakcji, tj.

15 minut, dwie godziny czy 24 godziny, płukanie pierwszej kolumny eliminuje z ekstraktu największą ilość białek niehistonowych. Oczyszczone frakcje białek histonowych z grupy ekstrakcji 24-godzinnej zawierały więcej histonów H3 i H4 w porównaniu z 15-minutowym i dwugodzinnym czasem ekstrakcji.

Elucja w pierwszej kolumnie była w około 100% skuteczna, o czym świadczy brak białek histonowych w drugiej eluacji. Następnie wyekstrahowano surowe histony z całego mózgu myszy i zmierzono modyfikacje potranslacyjne. W odpowiedzi na szeroko działający inhibitor HADC, tributyrynę, acetylacja H4K12 w ekstrakcie wzrosła.

Jednak specyficzność przeciwciała zmniejszyła się ze względu na obecność zanieczyszczeń w surowym ekstrakcie. Protokół oczyszczania histonów zakończono korą przedczołową potrójnie transgenicznych myszy A / D leczonych inhibitorem HDAC klasy I i IIb, M344, a pojedynczą frakcję histonów rdzeniowych oceniono pod kątem zmian w acetylacji H4K12. Wykryto całkowitą liczbę histonów i zaobserwowano znaczny wzrost acetylacji H4K12 w odpowiedzi na M344.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wykonaniu wielu punktów kontrolnych opisanych w protokole, aby potwierdzić pomyślne oczyszczanie histonów w całym procesie. Po tej procedurze można uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące fosforylacji histonów i stanu metylacji. Opracowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom z naszego laboratorium do analizy mechanizmów genetycznych związanych z chorobą Alzheimera.

Można go jednak stosować w różnych modelach chorobowych, w których przypuszcza się, że modyfikacja chromatyny odgrywa znaczącą rolę.