Name: Lokalizacja miejsca sinawyego w mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę lokalizacji miejsca sinawego w mózgu myszy przy użyciu immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia analizę ekspresji białek oraz homeostazy metali w kluczowym obszarze neurologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Abigael Muchenditsi za utrzymanie kolonii myszy. Wykorzystanie Zaawansowanego Źródła Fotonów w Argonne National Laboratory było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, na podstawie umowy o numerze: DE-AC02-06CH11357. Dziękujemy Oldze Antipovej i dr. Stefanowi Vogtowi za wsparcie i pomoc w Advanced Photon Source. Praca ta została sfinansowana z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia 2R01GM101502 dla SL.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Animal Care and Use (ACUC) numer protokołu numer M017M385.
1. Cięcie mózgu
<ol>
	<li>Aby unieruchomić, znieczul myszy poprzez zastosowanie 3% izofluranu.
	<ol>
		<li>Namocz wacik z kroplami izofluranu i umieść go w probówce do mikrowirówek o pojemności 15 ml. Umieść nos zwierzęcia w rurki i pozwól mu wdychać izofluran. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Połóż zwierzę na grzbiecie i unieruchamij je, przygniatając jego kończyny szpilką T, mając dostęp do brzucha.</li>
	<li>Przetnij zwierzę nożyczkami chirurgicznymi, wykonując nacięcie ze skóry brzucha i przeciąć skórę w okolicy klatki piersiowej. Przypnij skórę za pomocą szpilek T. Następnie przerwij błonę otrzewnową aż do klatki piersiowej. Odsłoń serce, rozbijając klatkę piersiową i przecinając przeponę.</li>
	<li>Przetnij prawy przedsionek, aby krew mogła wypłynąć ze zwierzęcia. Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 25 do lewej komory i ukrwić 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). 
	UWAGA: Dzięki temu roztwór przepływa przez krążenie ogólnoustrojowe i wychodzi przez prawe przedsionki.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 10 ml i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 dołączoną do strzykawki o pojemności 60 ml. Przelej przez lewą komorę 50 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA).
	<ol>
		<li>Przygotować lodowaty 4% roztwór PFA, rozcieńczając 10% roztwór PFA wH2Oi schładzając końcowy 4% roztwór PFA w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj głowę myszy i usuń mózg z czaszki.
	<ol>
		<li>Odetnij skórę od szyi, a następnie przetnij w kierunku oczu, aby odsłonić czaszkę. Rozbij czaszkę od szyi do nosa, a następnie od jednej gałki ocznej do drugiej. Obierz czaszkę i wytnij cały mózg.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować mózg w 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś mózg za pomocą kleszczy do stożkowej rurki o pojemności 50 ml wypełnionej 25 ml 30% roztworu sacharozy. Utrzymuj go w temperaturze 4 °C przez 48-72 godzin, aż mózg opadnie na dno rurki.</li>
	<li>Przetnij mózg za pomocą dorosłej myszy wycinka mózgu matrycy koronalnej przez śródmózgowie (~ 3 mm za bregmą). Zachowaj sekcję mózgu zawierającą pień mózgu. 
	UWAGA: Spowoduje to powstanie dwóch sekcji mózgu – jednej zawierającej większość kory mózgowej (przed nacięciem) i drugiej zawierającej pień mózgu/móżdżek (z tyłu cięcia). Użyj sekcji pnia mózgu, aby wykonać następujące kroki.</li>
	<li>Osadź część pnia mózgu z powierzchnią cięcia umieszczoną na dnie formy do zatapiania, otoczoną związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT); przenieś osadzony mózg do zamrażarki o temperaturze -80 °C i zamrażaj przez co najmniej 12 godzin – do dalszego użycia.</li>
	<li>Cięcie kriostatu: umieścić formę do osadzania zawierającą mózg w OCT w kriostacie; inkubować ją w kriostacie przez kilka godzin, aby dostosować temperaturę bloku mózgowego do temperatury kriostatu.</li>
	<li>Oderwij formę do osadzania, aby odsłonić blok OCT zawierający mózg.</li>
	<li>Użyj żyletek, aby usunąć nadmiar OCT z powierzchni bloku bez dotykania mózgu.</li>
	<li>Zamontuj blok OCT na uchwycie kriostatu, odsłaniając przeciętą powierzchnię mózgu do przodu.</li>
	<li>Dostosuj powierzchnię cięcia mózgu tak, aby była zorientowana równolegle do żyletek kriostatu.</li>
	<li>Przytnij mózg, zaczynając od rdzenia, przecinając odcinki 100 μm rostralnie.</li>
	<li>Przycinaj rotacyjnie, aż móżdżek i pień mózgu będą ciąć jako jeden ciągły plasterek. Rozpocznij zbieranie plastrów o grubości 50 μm. 
	UWAGA: Gdy przycina się rostralnie od rdzenia, pień mózgu i móżdżek przetną się jako dwie oddzielne sekcje. W sekcjach rostralnych pień mózgu i móżdżek ostatecznie połączą się na poziomie 4. komory. Gdy boczne krawędzie 4. komory są dobrze uformowane, móżdżek i pień mózgu wyjdą jako jeden ciągły plasterek.
	<ol>
		<li>Zbierz plasterek mózgu otoczony OCT za pomocą kleszczy i umieść go w studzience na 24-dołkowej płytce wypełnionej PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a). LC będzie najbardziej widoczny, gdy móżdżek i wzgórek dolny spotkają się ze sobą w odległości ~ -5,52 mm za bregma (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1b). 
		UWAGA: Najbardziej przednia część LC zniknie, gdy móżdżek zostanie w pełni przecięty i nie będzie już otaczał wzgórka dolnego w odległości ~ -5,34 mm za bregmą (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1c).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunohistochemia dopaminy β-hydroksylazy lub hydroksylazy tyrozynowej (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Umyj wybrane plastry trzy razy przez 5 minut w PBS.</li>
		<li>Przepuszczać przez 24 godziny w 0,5% buforowanym roztworem soli fizjologicznej z detergentem (PBSD) w temperaturze 4 °C.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 125 μl detergentu w 25 ml PBS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Plastry myć trzy razy przez 5 minut w 0,5% PBSD.</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, anty-DBH lub anty-TH przez 18 godzin w rozcieńczeniu 1:500 w 0,5% PBSD w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Umyj plastry trzy razy przez 10 minut w 0,5% PBSD.</li>
		<li>Dodać pożądane przeciwciało drugorzędowe (488 anty-królik osła dla zielonej fluorescencji) w rozcieńczeniu 1:1000 w 0,5% PBSD przez 16 godzin.</li>
		<li>Owinąć płytkę 24-dołkową w aluminium i umieścić w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Plastry myć trzy razy przez 5 minut w 0,5% PBSD.</li>
		<li>Prać przez 5 minut w PBS.</li>
		<li>Przełóż plastry pędzlem ołówkowym do pojemnika na wodę.</li>
		<li>Zamontuj plastry unoszące się w wodzie na naładowanych zjeżdżalniach.</li>
		<li>Sekcje szkiełek nakrywkowych z twardymi nośnikami montażowymi (bez DAPI).</li>
		<li>Suszyć zamontowane sekcje mózgu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Obrazuj wycinki mózgu pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym z ustawieniami wykrywania sygnału z odpowiedniej długości fali fluoroforu przeciwciała wtórnego.</li>
		<li>Dostosuj mikroskop do płaszczyzny ogniskowej wycinka mózgu i zrób pojedynczy obraz w 10-krotnym powiększeniu.</li>
		Aby zlokalizować możliwy obszar LC w wycinku mózgu, użyj czwartej komory do orientacji; móżdżek znajduje się powyżej komory, most i pień mózgu znajdują się poniżej30.<li></li>
		<li>Aby zlokalizować LC, skup się na bocznych krawędziach 4. komory; LC zaczyna się od krawędzi 4. komory i jest skierowany w stronę obszaru mostu / pnia mózgu (ryc. 2b, 2c).</li>
		<li>Po zobrazowaniu i lokalizacji LC w niektórych wycinkach mózgu, należy przechowywać szkiełka zawierające wycinki mózgu w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykrywanie LC w wycinkach mózgu
<ol>
	<li>Aby zlokalizować sekcję mózgu zawierającą LC, pokrój mózg myszy zgodnie z powyższym opisem i zbierz skrawki w wypełnionych PBS 24 naczyniach dołkowych, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2a.
	<ol>
		<li>Umieść jedną sekcję mózgu w każdym dołku, aby umożliwić prawidłową lokalizację LC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz w sumie 48 wycinków mózgu, które zostaną wybarwione immunologicznie na każdy mózg. 
	UWAGA: Wszystkie dołki dwóch naczyń pokazanych w Rysunek 2a zawierają wycinki mózgu jednego zwierzęcia.</li>
	<li>Barwienie immunologiczne co trzeci do piątego plastra na DBH lub TH. Najlepiej przeprowadzić immunohistochemię tych wycinków mózgu, które sąsiadują z tymi, które są dalej badane (za pomocą rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej, XFM). 
	UWAGA: Ta procedura pozwala na dokładną lokalizację LC w końcowych warstwach testowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a; oznaczone numerami między dołkami).</li>
	<li>Dostosuj liczbę wycinków mózgu, które są barwione immunologicznie w zależności od zastosowania, np. czy wymagają one dokładnej lokalizacji środka i krawędzi LC, czy tylko przybliżonego oszacowania.</li>
	<li>Po immunohistochemii wykryj wycinki mózgu zawierające LC za pomocą charakterystycznego wzorca ekspresji po obu stronach czwartej komory (ryc. 2b, 2c). Powiększenie sygnału DBH w LC kolejnych wycinków mózgu pokazano na rysunku 2d, 2e; powiększony obraz LC, który jest zabarwiony dla TH, pokazano na rysunku 2f.</li>
	<li>Do dalszych badań należy wykorzystać sekcje sąsiadujące z sekcjami zawierającymi LC - w tym przypadku dla XFM do ilościowego określenia poziomów metali (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Aby wykonać XFM, należy zebrać 10-30 μm (w zależności od konfiguracji) cienkie koronalne wycinki mózgu na cienkiej folii polimerowej, za pomocą której można je zamontować na uchwytach próbek i zobrazować w synchrotronie.</li>
	<li>Przechowuj wycinki mózgu, które są przygotowane na cienkiej folii polimerowej dla XFM, w temperaturze pokojowej i wykonaj XFM.</li>
</ol>
4. Obrazowanie metalu w LC za pomocą XFM
<ol>
	<li>Pokrój przykładowy mózg myszy zgodnie z powyższym opisem, określ LC i zmierz poziom metalu za pomocą XFM z tych wycinków mózgu zawierających LC.</li>
	<li>Rozkład pierwiastków obrazu na linii badawczej 2-ID-E w Zaawansowanym Źródle Fotonów (Argonne National Laboratory, Argonne IL).</li>
	<li>Rejestruj dane "w locie", jak opisano wcześniej31.</li>
	<li>Określ stężenia pierwiastków w wycinkach mózgu zawierających LC za pomocą programu MAPS32,33.</li>
</ol>

<ol><li>Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+central+norepinephrine+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity.</a> Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).</li>
<li>Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+mapping+of+the+noradrenergic+projection+from+the+locus+coeruleus.+A+model+for+studies+of+brain+neuronal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways.</a> Neurology. 25, 223-233 (1975).</li>
<li>Olson, L., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+projections+from+the+locus+coeruleus+noradrealine+neurons%3A+the+cerebellar+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation.</a> Brain research. 28, 165-171 (1971).</li>
<li>Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+MCH-containing+fibers+in+the+feline+brainstem%3A+Relevance+for+REM+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation.</a> Peptides. , 50-61 (2018).</li>
<li>Semba, J., Toru, M., Mataga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-four+hour+rhythms+of+norepinephrine+and+serotonin+in+nucleus+suprachiasmaticus%2C+raphe+nuclei%2C+and+locus+coeruleus+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat.</a> Sleep. 7, 211-218 (1984).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537, 357-362 (2016).</li>
<li>Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+turnover+of+norepinephrine+in+the+rat+cerebral+cortex+during+stress%3A+role+of+the+locus+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus.</a> Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).</li>
<li>Sara, S. J., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+sensory+responses+of+locus+coeruleus+neurons+in+the+behaving+rat%3A+implications+for+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition.</a> Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).</li>
<li>Markevich, V. A., Voronin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+reactions+of+sensomotor+cortex+neurons+to+stimulation+of+emotionally+significant+brain+structures%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhurnal+vysshei+nervnoi+deiatelnosti+imeni+I+P+Pavlova%22%5BJournal%5D)">Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures].</a> Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).</li>
<li>File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+role+of+the+locus+coeruleus+in+anxiety+and+agonistic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour.</a> Brain research. 169, 411-420 (1979).</li>
<li>Pamphlett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+environmental+toxicants+by+the+locus+ceruleus%3A+a+potential+trigger+for+neurodegenerative%2C+demyelinating+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+hypotheses%22%5BJournal%5D)">Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders.</a> Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin-sensitive+magnetic+resonance+imaging+features+of+the+substantia+nigra+and+locus+coeruleus+in+de+novo+Parkinson%27s+disease+and+its+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes.</a> European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).</li>
<li>Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+locus+coeruleus+catecholaminergic+neurons+in+the+chemosensory+control+of+breathing+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model.</a> Experimental neurology. , 172-180 (2017).</li>
<li>Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+loss+is+greater+in+the+locus+coeruleus+than+nucleus+basalis+and+substantia+nigra+in+Alzheimer+and+Parkinson+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases.</a> Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).</li>
<li>Chandley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+deficits+in+pontine+locus+coeruleus+astrocytes+in+men+with+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+psychiatry+%26+neuroscience+%3A+JPN%22%5BJournal%5D)">Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder.</a> Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).</li>
<li>Bernard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+glutamate+signaling%2C+growth+factor%2C+and+glia+genes+in+the+locus+coeruleus+of+patients+with+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression.</a> Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).</li>
<li>Gos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+locus+coeruleus+is+elevated+in+violent+suicidal+depressive+patients%5BTitle%5D)+AND+%22European+archives+of+psychiatry+and+clinical+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients.</a> European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).</li>
<li>Bielau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+evidence+for+impaired+nitric+oxide+signaling+of+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Brain research. 1459, 91-99 (2012).</li>
<li>Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+and+serotonin+imbalance+in+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Bipolar+disorders%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).</li>
<li>Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Stress+Persistently+Alters+Locus+Coeruleus+Function+and+Anxiety-like+Behavior+in+Adolescent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats.</a> Neuroscience. 373, 7-19 (2018).</li>
<li>Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dichotomy+in+spinal-+vs+prefrontal-projecting+locus+coeruleus+modules+splits+descending+noradrenergic+analgesia+from+ascending+aversion+and+anxiety+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>McCall, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRH+Engagement+of+the+Locus+Coeruleus+Noradrenergic+System+Mediates+Stress-Induced+Anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety.</a> Neuron. 87, 605-620 (2015).</li>
<li>Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticotropin-Releasing+Factor+Mediates+Pain-Induced+Anxiety+through+the+ERK1%2F2+Signaling+Cascade+in+Locus+Coeruleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons.</a> The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).</li>
<li>Simone, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethinyl+estradiol+and+levonorgestrel+alter+cognition+and+anxiety+in+rats+concurrent+with+a+decrease+in+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+locus+coeruleus+and+brain-derived+neurotrophic+factor+expression+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus.</a> Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).</li>
<li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nature. 13, 1526-1533 (2010).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosterone+administration+up-regulated+expression+of+norepinephrine+transporter+and+dopamine+beta-hydroxylase+in+rat+locus+coeruleus+and+its+terminal+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions.</a> Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+regulates+rest-activity+cycles+through+the+locus+coeruleus-norepinephrine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system.</a> Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).</li>
<li>Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+coeruleus%3A+neurobiology+of+a+central+noradrenergic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus.</a> Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).</li>
<li>Ralle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+at+a+Single+Cell+Level%3A+intracellular+copper+trafficking+activates+compartment-specific+responses+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).</li>
<li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).</li>
<li>Bonnemaison, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%2C+zinc+and+calcium%3A+imaging+and+quantification+in+anterior+pituitary+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics+%3A+integrated+biometal+science%22%5BJournal%5D)">Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules.</a> Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).</li>
<li>Nietzold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+X-Ray+Fluorescence+Data+Using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).</li>
<li>Vogt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPS%3A+A+set+of+software+tools+for+analysis+and+visualization+of+3D+X-ray+fluorescence+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+IV+France%22%5BJournal%5D)">MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets.</a> J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+pathology+in+vulnerable+brain+regions+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease.</a> Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).</li>
<li>Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+dyshomoeostasis+in+Parkinson%27s+disease%3A+implications+for+pathogenesis+and+indications+for+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+science%22%5BJournal%5D)">Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics.</a> Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).</li>
<li>James, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+preparation+methodologies+for+X-ray+fluorescence+microscopy+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).</li>
</ol>

Właściwa orientacja próbki jest kluczowym krokiem w tym protokole. Ponieważ używamy cech anatomicznych grzbietowej powierzchni mózgu do zlokalizowania LC (granica między móżdżkiem a wzgórkiem dolnym), ważne jest, aby sekcje były prawidłowo wyrównane. Wymaga to ostrożności w prawidłowym ustawieniu mózgu w macierzy fragmentatora mózgu myszy. Zalecamy wycięcie ~500 μm więcej tkanki z przodu i z tyłu do LC, aby uniknąć pominięcia jądra. Najczęstszym błędem jest wycinanie zbyt małej liczby sekcji, co skutkuje całkowitym pomin...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.

Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Miejsce sinawe (LC) jest ważnym regionem w pniu mózgu i głównym miejscem produkcji noradrenaliny (NE)1. LC wysyła projekcje przez cały mózg2 do kory mózgowej, hipokampa i móżdżku3 i reguluje główne procesy fizjologiczne, w tym rytm okołodobowy4,5, uwaga i pamięć6, stress7, procesy poznawcze8 i emotion9,10. Dysfunkcja LC jest związana z zaburzeniami neurologicznymi i neuropsychiatrycznymi11, w tym choroba Parkinsona12,13,14, choroba Alzheimera14, depresja15,16,17, choroba afektywna dwubiegunowa18,19, oraz anxiety20,21,22,23,24. Biorąc pod uwagę te role, analiza LC ma kluczowe znaczenie dla badania jej funkcji i dysfunkcji.
Myszy są powszechnie używane do badań procesów fizjologicznych i patofizjologicznych. Ze względu na niewielkie rozmiary, mysz LC ma średnią średnicę ~300 μm, co prowadzi do trudności w zlokalizowaniu konstrukcji. Podczas sekcji mózgu LC można łatwo przeoczyć zarówno w przekroju czołowym, jak i strzałkowym. Dostępne badania opisujące identyfikację LC u zwierząt nie oferują protokołu krok po kroku, który mógłby zastosować laik1,25. Dlatego, aby zaoferować wskazówki dotyczące lokalizacji LC, opisujemy protokół, który opracowaliśmy w celu zlokalizowania tego regionu w mózgu myszy dla kilku zastosowań (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Protokół stosuje starannie kontrolowane podziały mózgu i immunohistochemiczne wykrywanie DBH26,27, lub alternatywnie TH24, oba enzymy są wysoce wzbogacone w LC28. Po zlokalizowaniu LC za pomocą immunohistochemii, sąsiednie wycinki mózgu można wykorzystać do dalszych badań, w tym analiz morfologicznych i metabolicznych, a także do badań obrazowania metali za pomocą mikroskopii fluorescencji rentgenowskiej (XFM)29. Opisujemy XFM jako przykład w tym protokole (Rysunek 3).

<table><tbody><tr><td>Matryca krajalnicy mózgu dorosłej myszy</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw królikowi, Alexa Fluor 488 (źródło - osioł)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Naładowane szkiełka</td><td>podstawowe Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza tnące kriostatu</td><td>Nożyczki Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Mini, 9,5 cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało dopaminy i beta;-hydroksylazy (DBH) - produkcja własna (źródło - królik)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko dopaminie i beta;-hydroksylazie (DBH) - dostępne w handlu (źródło - królik)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon, 50 ml</td><td>USA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forane (izofluoran)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Twarde media</td><td>montażowe EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe, 24 dołki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)</td><td>VWR/ tissue tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)/ formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td>ołówkowy</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>Trójniki</td><td></td> Magazyn <td>344615</td><td></td></tr><tr><td>Mózg myszy we współrzędnych stereotaktycznych, Paxinos i Franklin, 3rd Edition</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (do przygotowania PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało hydroksylazy tyrozyny (TH) (źródło - królik)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Ultralene cienka folia do przygotowania próbki XRF</td><td>SPEX</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalizacja miejsca sinawyego w mózgu myszy

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Locus coeruleus (LC) jest głównym ośrodkiem neuronów produkujących noradrenalinę, które modulują szereg funkcji fizjologicznych. Strukturalne lub funkcjonalne nieprawidłowości LC wpływają na kilka obszarów mózgu, w tym korę, hipokamp i móżdżek, i mogą przyczyniać się do depresji, choroby afektywnej dwubiegunowej, lęku, a także choroby Parkinsona i choroby Alzheimera. Zaburzenia te są często związane z nierównowagą metali, ale rola metali w LC jest tylko częściowo poznana. Potrzebne są badania morfologiczne i funkcjonalne LC, aby lepiej zrozumieć ludzkie patologie i udział metali. Myszy są szeroko stosowanym modelem eksperymentalnym, ale LC myszy jest mały (~0,3 mm średnicy) i trudny do zidentyfikowania dla laika. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół oparty na immunohistochemii do lokalizacji LC w mózgu myszy. Dopamino-β-hydroksylaza (DBH) i alternatywnie hydroksylaza tyrozynowa (TH), oba enzymy silnie eksprymowane w LC, są stosowane jako markery immunohistochemiczne w wycinkach mózgu. Skrawki przylegające do skrawków zawierających LC mogą być wykorzystane do dalszej analizy, w tym histologii do badań morfologicznych, badań metabolicznych, a także obrazowania metali za pomocą rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej (XFM).

Zaburzenia w gospodarce metali (takich jak Cu, Fe, Zn i Mn) są często obserwowane w zaburzeniach neurologicznych, w tym zmiany w jądrze zasadnym 34,35. Dlatego określenie poziomów metali w mózgu jest konieczne do zrozumienia mechanizmów choroby. Przekroje mózgu uzyskane za pomocą opisanego protokołu mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania poziomów Cu i innych metali w jądrze zasadnym oraz porównania ich z poziomami w obsza...

Locus coeruleus to małe skupisko neuronów biorących udział w różnych procesach fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania wycinków mózgu myszy do badań białek i metali w tym jądrze.

Lokalizacja miejsca sinawyego w mózgu myszy

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Prawidłowe zorientowanie preparatu jest kluczowym krokiem w tym protokole. Ponieważ do zlokalizowania LC (granica między móżdżkiem a wzgórkami dolnymi) wykorzystujemy cechy anatomiczne grzbietowej powierzchni mózgu, ważne jest, aby przekroje były odpowiednio wyrównane. Wymaga to staranności podczas umieszczania mózgu w matrycy do krojenia mózgu myszy. Zalecamy wycięcie ok. 500 μm więcej tkanki przed i za LC, aby uniknąć pominięcia jądra. Najczęstszym błędem jest wycięcie zbyt niewielkiej liczby przekrojów, co skutkuje całkowitym pominięciem LC. Dlatego przy pierwszym stosowaniu tego protokołu zalecamy wycięcie większej liczby przekrojów niż jest to konieczne. Bardzo pomocne jest dokładne zapoznanie się z obrazami z atlasu mózgu przed przeprowadzeniem barwienia. Wygląd pnia mózgu zmienia się znacząco co kilka stu mikronów i przy pewnym doświadczeniu możliwe jest określenie, które przekroje warto barwić, opierając się jedynie na wyglądzie makroskopowym.

Podczas procesu lokalizacji LC mogą wystąpić różnice w sygnale, zależnie od tego, jak dobrze mózg został zorientowany podczas sekcjonowania. Przy cięciu przez środek LC sygnał jest jasny i obejmuje większy obszar w porównaniu do krawędzi LC, która objawi się jako sygnał na znacznie mniejszym obszarze. W przypadku, gdy przekroje czołowe są lekko nachylone, LC po jednej stronie 4tej komory może być widoczny, podczas gdy LC po drugiej stronie może być widoczny dopiero na sąsiednim preparacie. W związku z tym nie zawsze można oczekiwać pojawienia się obu obszarów LC z maksymalną intensywnością w obrębie jednego przekroju mózgu. Tego artefaktu można uniknąć, wykonując cięcia dokładnie w płaszczyźnie czołowej za pomocą matrycy do krojenia mózgu myszy oraz starannie osadzając mózg w kostkowej formie do odlewów z użyciem OCT.

Immunobarwienie, przynajmniej z użyciem przeciwciała przeciwko tyrozynowej hydroksylazie, jest niezwykle tolerancyjne i w naszym doświadczeniu działa na przekrojach o grubości do 100 μm. Stwierdziliśmy, że roztwór blokujący nie jest konieczny do uzyskania wysokiego stosunku sygnału do szumu podczas barwienia LC, co zmniejsza koszty i skraca czas potrzebny na zlokalizowanie LC. Według naszych doświadczeń protokół barwienia można przyspieszyć – choć kosztem obniżonej jakości i penetracji barwnika – poprzez skrócenie czasu permeabilizacji do 2 h, inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym do 8 h oraz z przeciwciałem drugorzędowym do 2 h. Ponadto, jeśli celem jest jedynie zlokalizowanie LC (np. w celu walidacji wstrzyknięcia wirusa/znacznika), przekroje z utrwalonego mózgu można wycinać na wibrotomie przy grubości 100 μm.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest fakt, że z założenia wymaga on uśmiercenia zwierzęcia i wyjęcia mózgu. W związku z tym nie jest on przydatny do lokalizacji in vivo (np. w przypadku rejestracji elektrofizjologicznej). Kolejnym ograniczeniem jest wymóg utrwalenia w PFA, co może zmienić naturalny stan tkanki. Zmiany te obejmują zawartość pierwiastków, takich jak miedź, wapń, żelazo i cynk36. Rzeczywisty wpływ utrwalania w PFA na rozkład metali można przetestować na jednej próbce, którą analizuje się równolegle z próbką nieutrwaloną. Porównanie rozkładu metali między tymi dwiema próbkami dostarczy dowodów na wpływ utrwalenia w PFA na rozkład metalu, który jest przedmiotem danej analizy. Jeśli utrwalanie w PFA musi zostać pominięte, ogólna zasada tego protokołu (lokalizacja LC za pomocą immunobarwienia i wykorzystanie sąsiednich skrawków do dalszych eksperymentów) może zostać zastosowana do skrawków mrożonych bez utrwalania.

Zauważamy, że niniejszy protokół jest w dużej mierze udoskonaleniem istniejących metod rozwiązania tego problemu. Nowością jest dostosowanie poprzednich podejść w celu zlokalizowania bardzo małego, łatwego do przeoczenia jądra. Przewidujemy, że protokół ten może być łatwo modyfikowany i rozszerzany w zależności od potrzeb (np. poprzez zastosowanie zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję fluoroforów w LC, aby uniknąć immunostainingu).

localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Źródło: Xavier, A. L. R., et al. Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania kaniuli do cisterna magna znieczulonej myszy. Technika polega na przeprowadzeniu kaniuli zamontowanej na igle przez oponę twardą do odwróconego trójkątnego cisterna magna i zabezpieczeniu jej w celu ukierunkowanego dostarczenia do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna w modelu mysim

Ten film demonstruje in vivo rejestrację potencjału lokalnego pola (LFP) z obustronnych obszarów M2 mózgu myszy. Znieczulona mysz jest zabezpieczona i przygotowana do zabiegu. Aby zarejestrować LFP, należy wprowadzić mikroelektrody do docelowych współrzędnych obustronnych obszarów M2, które są odpowiedzialne za złożone ruchy motoryczne.

Rejestracja potencjału pola lokalnego z obu półkul mózgu myszy

Protokół ten przedstawia zastosowanie immunohistochemii do identyfikacji regionów miejsca sinawyego w sekcjach mózgu myszy. Poprzez celowanie w β-hydroksylazę dopaminy za pomocą zielonych przeciwciał znakowanych fluoroforem, neurony wytwarzające noradrenalinę są wizualizowane pod mikroskopem jako zielona fluorescencja.

Immunohistochemia do identyfikacji regionu miejsca sinawyego w wycinkach mózgu myszy

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Prezentujemy in vivo elektrofizjologiczny zapis potencjału pola lokalnego (LFP) w obustronnej wtórnej korze ruchowej (M2) myszy, który może być zastosowany do oceny lateralizacji półkuli. Badanie wykazało zmienione poziomy synchronizacji między lewym i prawym M2 u myszy APP/PS1 w porównaniu z kontrolami WT.

Ocena lateralizacji półkuli z obustronnym zapisem potencjału pola lokalnego w wtórnej korze ruchowej myszy

Aby sprawdzić, czy wpływ trójdzielny na wydajność poznawczą obejmuje aktywność miejsca sinawego, przedstawiono dwa protokoły, które mają na celu ocenę możliwych korelacji między wydajnością a związanymi z zadaniem zmianami wielkości źrenic wywołanymi przez żucie. Protokoły te mogą być stosowane w stanach, w których podejrzewa się udział locus coeruleus.

Ocena zmian związanych ze źrenicami w pobudzeniu za pośrednictwem miejsca sinawy, wywołanym stymulacją nerwu trójdzielnego

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Stereotaktyczna operacja celowania w miejsca mózgu u myszy zwykle obejmuje dostęp przez kości czaszki i jest prowadzona przez punkty orientacyjne czaszki. Poniżej przedstawiamy alternatywne podejście stereotaktyczne do celowania w ogonowy pień mózgu i górny odcinek szyjny rdzenia kręgowego za pomocą cisterna magna, które opiera się na bezpośredniej wizualizacji punktów orientacyjnych pnia mózgu.

Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Poznaj metodę lokalizacji miejsca sinawego w mózgu myszy przy użyciu immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia analizę ekspresji białek oraz homeostazy metali w kluczowym obszarze neurologicznym.

Lokalizacja miejsca sinawyego w mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów