Name: Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę transfekcji makrofagów nanocząstkami tlenku żelaza pokrytymi polietylenominą do dostarczania siRNA in vitro i in vivo. Technika umożliwia skuteczne wyciszanie genów w badaniach immunologicznych i terapii chorób zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81772308) oraz Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (nr 2017YFA0205502).

Wszystkie metody z udziałem żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Południowo-Wschodnim w Chinach.
1. Przygotowanie PEI-SPIONs
<ol>
	<li>Przygotowanie SPION-ów modyfikowanych kwasem oleinowym
	<ol>
		<li>Rozpuścić FeCl3•6H2Oi FeSO4•7H2Ow wodzie pod ochronąN2.
		<ol>
			<li>Dodać 28 g FeCl3•6H2O i 20 g FeSO4•7H2O do 80 ml wody dejonizowanej w zlewce. Wprowadzić N2 do wody przez szklany przewód i mieszać, aż ciało stałe się rozpuści.</li>
			<li>Podgrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury 72 °C z szybkością mieszania 800 obr./min, a następnie dodać 40 ml wody amoniakalnej (28%). Mieszaj przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać kroplami 9 ml kwasu oleinowego do wyżej wymienionego roztworu i mieszać w temperaturze 72 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Schłodzić powstały roztwór do temperatury pokojowej (RT). Wytrącić roztwór przez separację magnetyczną.</li>
		<li>Przepłukać osad zawierający SPIONs 3x absolutnym alkoholem etylowym, a następnie rozproszyć osad w 100 ml N-heksanu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie SPION-ów modyfikowanych kwasem dimerkaptobursztynowym
	<ol>
		<li>Dodać 800 mg SPION-ów modyfikowanych kwasem oleinowym (OA) rozproszonych w 200 ml N-heksanu i 400 mg kwasu dimerkaptobursztynowego (DMSA) zdyspergowanego w 200 ml acetonu do kolby trójszyjkowej w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. 
		Uwaga: Aby określić stężenie SPION modyfikowanego OA uzyskane w poprzednim kroku, należy pobrać niewielką objętość (np. 1 ml) dyspersji SPION, ulatniać N-heksan i zważyć otrzymany proszek.</li>
		<li>Dodać kroplami 200 μl trietyloaminy do wyżej wymienionego roztworu, mieszając z prędkością 1 000 obr./min i refluksując.</li>
		<li>Po 5 godzinach mieszania i refluksowania uzyskać osad przez separację magnetyczną.</li>
		<li>Zdyspergować hydrofilowe SPION-y w wodzie dejonizowanej jednorodnie, regulując pH roztworu za pomocą wodorotlenku tetrametyloamonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie PEI-SPION-PION-ów
	<ol>
		<li>Dodawać kroplami roztwór koloidalny SPION modyfikowany DMSA do roztworu PEI (10 kDa) w kolbie trójszyjkowej o pojemności 500 ml mieszając mechanicznie przy 1,000 obr./min przez 2 godziny (WFe:WPEI = 1:3). 
		Uwaga: Ładunek i rozmiar PEI-SPIONs różnią się w zależności od stosunku WFe do WPEI. Stosunek WFe:WPEI wynoszący 1:3 może być dobrym punktem wyjścia do syntezy PEI-SPIONs odpowiednich do dostarczania siRNA.</li>
		<li>Dodać otrzymany roztwór do probówki ultrafiltracyjnej o masie cząsteczkowej odcięcia 100 kDa i zawartości 15 ml, a następnie odwirować przy 5,400 x g przez 10 minut, aż pozostały roztwór osiągnie 1 ml. Dodaj wodę dejonizowaną do roztworu, aby ponownie uzyskać objętość 15 ml i powtórz powyższy proces 10 razy, aby uzyskać produkt końcowy. Następnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać produkt końcowy w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Określić stężenie Fe w PEI-SPIONs metodą kolorymetryczną przy użyciu phenanthroline17. Rozcieńczyć PEI-SPIONs dejonizowaną sterylną wodą do stężenia 1 mg Fe/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 μl roztworu PEI-SPION (1 mg Fe/ml) do 1 ml wodą dejonizowaną, a następnie sprawdzić jego wielkość hydrodynamiczną i potencjał zeta za pomocą urządzenia do dynamicznego rozpraszania światła. 
		Uwaga: Przygotować PEI-SPIONs w zakresie około 30 - 50 nm. W tym zakresie wielkości wpływ wielkości NP na wiązanie siRNA i wychwyt komórkowy nie wydaje się być znaczący. PEI-SPIONs o średnim potencjale zeta powyżej +37 mV mogą być toksyczne w zakresie dawek transfekcji, a w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy przeprowadzić test cytotoksyczności. Ładunek powierzchniowy i rozmiar hydrodynamiczny nanocząstek można kontrolować w pożądanym zakresie, dostosowując zawartość PEI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i elektroforeza w żelu agarozowym nanocząsteczek PEI-SPION/siRNA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć siRNA wodą wolną od RNaz, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μM (0,26 μg/μL).</li>
	<li>Przygotuj pięć probówek mikrowirówek wolnych od RNaz oznaczonych 0, 1, 2, 4 i 8. Etykiety reprezentują różne proporcje wagowe Fe:siRNA. Odpipetować 3 μl roztworu siRNA do wszystkich probówek (~0,8 μg siRNA/probówkę).</li>
	<li>Dodaj 0, 0,8, 1,6, 3,2 i 6,4 μg Fe w postaci PEI-SPIONs do probówek oznaczonych odpowiednio 0, 1, 2, 4 i 8. Całkowita objętość próbki w każdej probówce nie powinna przekraczać 20 μl. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksu PEI-SPION/siRNA. W tym okresie przygotuj 3% żel agarozowy z agarozą o wysokiej czystości. 
	Uwaga: Można przygotować i przetestować dodatkowe kompleksy PEI-SPION/siRNA o innych proporcjach Fe:siRNA (np. 5 lub 6).</li>
	<li>Dodać 1 μl 6-krotnego buforu obciążającego DNA na próbkę o objętości 5 μl i ostrożnie wymieszać. Załadować wszystkie próbki i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 5 V/cm, aż błękit bromofenolowy będzie migrował aż do dwóch trzecich długości żelu. Żel barwić bromkiem etydyny (EB) przez 15 - 20 min. 
	Uwaga: Należy użyć świeżo przygotowanego buforu do elektroforezy i roztworu EB.</li>
	<li>Wizualizacja pasm siRNA w systemie obrazowania UV. Sprawdź proporcje Fe:siRNA, w których siRNA tworzy kompleksy z PEI-SPION, w wyniku czego prążki reprezentujące wolne siRNA są opóźnione lub niewykrywalne.</li>
</ol>
3. Transfekcja makrofagów RAW264.7 in vitro
<ol>
	<li>Hodowla mysich komórek RAW264.7 podobnych do makrofagów w 10-centymetrowym naczyniu przy użyciu kompletnej pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 100 U/ml penicyliny na 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Na dzień przed transfekcją odessać pożywkę z komórek i przepłukać je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (pH 7,4). Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny do 10-centymetrowego naczynia. Trypsynizować komórki RAW264.7 przez około 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy większość komórek odłączy się (po 5 - 10 minutach), dodaj 5 ml kompletnej pożywki DMEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę. Pigazuj w górę iw dół, aby rozproszyć klastry komórek na pojedyncze komórki.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować go przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml świeżej kompletnej pożywki DMEM i policzyć komórki.</li>
	<li>Płytka 9 x 104 komórki na studzience na płytce 6-dołkowej z 2 ml kompletnej pożywki DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez około 24 godziny 
	Uwaga: W przypadku używania płytki o innym rozmiarze, dostosuj gęstość platerowanych komórek proporcjonalnie do względnej powierzchni, tak aby komórki osiągnęły 80% zbieżności w momencie transfekcji.</li>
	<li>Gdy konfluencja komórek wynosi 80%, usuń pożywkę z komórek i zastąp ją 1 ml kompletnej pożywki DMEM na dołek. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do momentu, gdy kompleksy PEI-SPION/siRNA zostaną przygotowane i będą gotowe do użycia (około 30 min).</li>
	<li>Przygotuj kompleksy PEI-SPION/siRNA: oblicz ilość kompleksów PEI-SPION/siRNA potrzebną do eksperymentu transfekcyjnego. W 1,5 ml probówce wirówkowej bez RNaz wymieszaj odpowiednią ilość PEI-SPIONs z siRNA w danym stosunku Fe:siRNA. Na przykład, aby przygotować nanocząsteczki PEI-SPION/siRNA zawierające 100 μg Fe w stosunku Fe:siRNA 4, dodaj 100 μl (1 mg Fe/ml) PEI-SPIONs do 96 μl siRNA (0,26 μg/μL), a następnie delikatnie wymieszaj je mikropipetą. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Przygotuj objętość kompleksu PEI-SPION/siRNA, która jest o 10% większa od całkowitej masy końcowej, aby uwzględnić wszelkie przypadkowe straty. Wytwarzaj kompleksy PEI-SPION/siRNA o niskich proporcjach Fe:siRNA, w których cząsteczki siRNA są całkowicie ładowane na PEI-SPION, a zatem można użyć niewielkich ilości PEI-SPION, aby zminimalizować potencjalną cytotoksyczność. Konieczne są eksperymenty pilotażowe (test opóźnienia żelu) w celu optymalizacji stosunku Fe:siRNA.</li>
	<li>Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora (krok 3.7). Do każdej studzienki dodawać kroplami wymaganą objętość kompleksu PEI-SPION/siRNA i ostrożnie obracać płytkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do czasu oceny wychwytu komórkowego lub skuteczności knockdownu genu (1 - 3 d). 
	Uwaga: Transfekcja makrofagów PEI-SPION/siRNA w stężeniu ~15 μg Fe/ml może zmaksymalizować wydajność transfekcji przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnej cytotoksyczności.</li>
</ol>
4. Systemowe dostarczanie siRNA do makrofagów u szczurów z eksperymentalnym zapaleniem stawów
<ol>
	<li>Uzyskaj specyficzne, wolne od patogenów samce szczurów Wistar w wieku 7 tygodni. Przyzwyczaj szczury przez 7 dni przed użyciem i zapewnij im odpowiednią ilość pożywienia i wody. Wywołać adiuwantowe zapalenie stawów (AA) u szczurów, jak opisano wcześniej18.</li>
	<li>Przygotować kompleksy PEI-SPION/siRNA zgodnie z opisem w kroku 3.8.</li>
	<li>Wstrzyknąć NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg siRNA/kg) szczurom AA przez żyłę ogonową. Oceń wychwyt komórkowy za pomocą, na przykład, cytometrii przepływowej, biodystrybucji tkanek za pomocą, na przykład, systemu obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym lub efektów terapeutycznych na podstawie, na przykład, analiz klinicznych, histologicznych i radiograficznych w żądanych punktach czasowych18. 
	Uwaga: W przypadku badań biodystrybucji komórkowej i tkankowej należy potraktować szczury pojedynczym wstrzyknięciem pożądanych nanocząsteczek; w przypadku badań terapeutycznych należy wstrzykiwać szczurom NP, które mają być testowane 1 raz w tygodniu przez trzy kolejne tygodnie.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723(2011).</li>
<li>Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).</li>
<li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Macrophages+and+Dendritic+Cells%22">Macrophages and Dendritic Cells</a>. , Springer. 123-143 (2009).</li>
<li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472(2015).</li>
<li>Davignon, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+monocytes%2Fmacrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li>
<li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224(2016).</li>
<li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li>
<li>Höbel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li>
<li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+barriers%3A+advances+in+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129(2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li>
<li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophages+with+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125(2014).</li>
<li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles%3A+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li>
<li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors%3A+Characterization+and+stability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li>
<li>Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li>
<li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles%3A+theory+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li>
<li>Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+%28II%29+and+total+iron+with+1%2C+10-phenanthroline%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li>
<li>Fröhlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703(2011).</li>
<li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li>
<li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39(2004).</li>
<li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li>
<li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+nanoparticles+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li>
<li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Makrofagi są oporne na transfekcję za pomocą powszechnie stosowanych metod niewirusowych, takich jak elektroporacja, liposomy kationowe i gatunki lipidów. Tutaj opisaliśmy niezawodną i wydajną metodę transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Korzystając z obecnego protokołu, ponad 90% komórek RAW 264.7 podobnych do makrofagów (Figura 2B) i makrofagów otrzewnowej szczura18 można transfekować siRNA bez znaczącego upośledzenia żywotności komórek. Metoda ta zależy od platfo...

Makrofagi to rodzaj wrodzonych komórek odpornościowych rozmieszczonych we wszystkich tkankach ciała, choć w różnych ilościach. Wytwarzając różnorodne cytokiny i inne mediatory, odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed atakującymi patogenami mikrobiologicznymi, w naprawie tkanek po urazie oraz w utrzymaniu homeostazy tkanek1. Ze względu na swoje znaczenie, makrofagi są nieustannie przedmiotem intensywnych badań. Jednak pomimo jego rozpowszechnienia w badaniach nad regulacją genów i funkcjami, wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA ma mniejsze szanse powodzenia w makrofagach, ponieważ komórki te - szczególnie makrofagi pierwotne - są często trudne do transfekcji. Można to przypisać stosunkowo wysokiemu stopniowi toksyczności związanemu z większością dobrze ugruntowanych metod transfekcji, w których błona komórkowa jest chemicznie (np. za pomocą polimerów i lipidów) lub fizycznie (np. przez elektroporację i pistolety genowe) przerywana, aby umożliwić cząsteczkom siRNA przejście przez błonę, co drastycznie zmniejsza żywotność makrofagów2,3. Ponadto makrofagi są dedykowanymi fagocytami bogatymi w enzymy degradacyjne. Enzymy te mogą uszkadzać integralność siRNA, osłabiając jego skuteczność wyciszania, nawet jeśli specyficzne dla genu siRNA zostało dostarczone do komórki3,4. Dlatego skuteczny system dostarczania siRNA ukierunkowany na makrofagi musi chronić integralność i stabilność siRNA podczas dostarczania4.
Coraz bardziej oczywiste jest, że dysfunkcyjne makrofagi są zaangażowane w inicjację i postęp pewnych powszechnych zaburzeń klinicznych, takich jak choroby autoimmunologiczne, miażdżyca i rak. Z tego powodu modulacja funkcji makrofagów, na przykład za pomocą siRNA, staje się atrakcyjną metodologią leczenia tych zaburzeń5,6,7. Chociaż poczyniono znaczne postępy, głównym wyzwaniem strategii leczenia opartej na siRNA jest słaba swoistość komórkowa siRNA podawanego ogólnoustrojowo i niewystarczający wychwyt siRNA przez makrofagi, co w konsekwencji prowadzi do niepożądanych skutków ubocznych. W porównaniu z terapiami opartymi na wolnych kwasach nukleinowych, które zwykle nie mają optymalnej selektywności komórek i często prowadzą do działań niepożądanych poza celem, nanocząstki (NP), ze względu na ich spontaniczną skłonność do wychwytywania przez układ siateczkowo-śródbłonkowy, mogą być modyfikowane do pasywnego kierowania na makrofagi in vivo, co pozwala na poprawę skuteczności terapeutycznej przy minimalnych skutkach ubocznych8. Obecnie nanocząsteczki badane pod kątem dostarczania cząsteczek RNA obejmują nieorganiczne nanonośniki, różne liposomy i polimery9. Wśród nich polietylenoimina (PEI), rodzaj kationowych polimerów zdolnych do wiązania i kondensacji kwasów nukleinowych w stabilizowane nanocząsteczki, wykazuje najwyższą zdolność dostarczania RNA9,10. PEI chroni kwasy nukleinowe przed degradacją enzymatyczną i nieenzymatyczną, pośredniczy w ich przenoszeniu przez błonę komórkową i wspomaga ich uwalnianie wewnątrzkomórkowe. Chociaż początkowo wprowadzono go jako odczynnik do dostarczania DNA, następnie wykazano, że PEI jest atrakcyjną platformą do dostarczania siRNA in vivo, zarówno lokalnie, jak i ogólnoustrojowo9,10.
Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPION) okazały się bardzo obiecujące w biomedycynie, dzięki swoim właściwościom magnetycznym, biokompatybilności, porównywalnym rozmiarom do biologicznie ważnych obiektów, wysokiemu stosunkowi powierzchni do objętości i łatwej do adaptacji powierzchni do mocowania bioagentu<klasa sup="xref">11. Na przykład, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako środka kontrastowego i szybkie wchłanianie przez makrofagi, SPION-y stały się ulubionym narzędziem klinicznym do obrazowania makrofagów tkankowych12. Chociaż SPION-y były również szeroko badane jako nośniki dostarczania kwasów nukleinowych11,13,14,15, o ile nam wiadomo, literatura zawiera niewiele doniesień o SPIONach jako nośniku do dostarczania siRNA ukierunkowanego na makrofagi. W przypadku dostarczania genów przez SPION, ich powierzchnia jest zwykle pokryta warstwą hydrofilowych polimerów kationowych, na których ujemnie naładowane kwasy nukleinowe mogą być elektrostatycznie przyciągane i wiązane. W niniejszej pracy przedstawiono metodę syntezy SPION-ów, których powierzchnia jest modyfikowana za pomocą niskocząsteczkowych (10 kDa), rozgałęzionych PEI (PEI-SPIONs). Te magnetyczne nanoplatformy są następnie wykorzystywane do kondensacji siRNA, tworząc kompleksy PEI-SPION/siRNA, które umożliwiają transport siRNA do komórki. Uważamy, że spontaniczna fagocytoza SPION-ów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego16, w połączeniu z silną zdolnością wiązania i kondensacji kwasów nukleinowych przez PEI, sprawia, że PEI-SPIONs są odpowiednie do efektywnego transportu siRNA do makrofagów. Przedstawione tutaj dane potwierdzają wykonalność wyciszania genów za pośrednictwem PEI-SPION/siRNA w makrofagach w hodowli, a także in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Ciepły w 37& C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (1,5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania MTS na bazie tetrazolii</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Do analizy cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Linia komórkowa RAW 264.7</td><td>Bank Komórek Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych (6-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych (10 cm)</td><td>Probówki</td><td></td> bez RNaz 430167 <td></td>Corning</tr><tr><td>(1,5 ml)</td>Probówki wirówkowe <td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Szczury Wistar</td><td>Centrum Zwierząt Doświadczalnych w Szanghaju Akademii Chińskiej </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nauki Bacillus Calmette&ndash; Gu&eacute; liofilizowany proszek rin</td><td>National Institutes for Food and Drug Control, Chiny</td><td></td><td>do wywoływania adiuwantowego zapalenia stawów u szczurów</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (Szanghaj, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (Guangzhou, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietylenimina (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>Woda amoniakalna</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Odczynnik chemiczny dimetylosulfotlenku</td><td>Aladdin Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4 i byk; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dimerkaptochtynowy</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>rurka ultrafiltracyjna</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorotlenku tetrametyloamonu</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>Analizator wielkości cząstek i potencjału zeta</td><td>Malvern, Anglia</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących rna do makrofagów in vitro i in vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Ze względu na ich kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej, makrofagi są nieustannie przedmiotem intensywnych badań i stanowią obiecujący cel terapeutyczny w wielu zaburzeniach, takich jak choroby autoimmunologiczne, miażdżyca i rak. Wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi jest cennym podejściem z wyboru do badania i manipulowania funkcją makrofagów; jednak transfekcja makrofagów za pomocą siRNA jest często uważana za wyzwanie techniczne, a obecnie dostępnych jest niewiele metodologii poświęconych transferowi siRNA do makrofagów. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI-SPIONs) jako nośnika do ukierunkowanego dostarczania siRNA do makrofagów. PEI-SPIONy są zdolne do wiązania i całkowitej kondensacji siRNA, gdy stosunek wagowy Fe:siRNA osiąga 4 i więcej. In vitro te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do pierwotnych makrofagów, a także do linii komórkowej RAW 264.7 podobnej do makrofagów, bez uszczerbku dla żywotności komórek w optymalnej dawce do transfekcji, a ostatecznie indukują wyciszanie docelowego genu za pośrednictwem siRNA. Oprócz tego, że PEI-SPIONy są wykorzystywane do transfekcji siRNA in vitro, są również obiecującym narzędziem do dostarczania siRNA do makrofagów in vivo. Ze względu na połączone cechy właściwości magnetycznych i zdolności wyciszania genów, oczekuje się, że podawane systemowo cząstki PEI-SPION/siRNA nie tylko modulują funkcję makrofagów, ale także umożliwiają obrazowanie i śledzenie makrofagów. W istocie, PEI-SPIONs stanowią prostą, bezpieczną i skuteczną niewirusową platformę do dostarczania siRNA do makrofagów zarówno in vitro, jak i in vivo.

Wielkość i potencjał zeta PEI-SPIONs przygotowanych zgodnie z tym protokołem mieściły się odpowiednio w zakresie 29 - 48 nm (indeks polidyspersyjności: 0,12 - 0,23) oraz 30 - 48 mV. Pozostawały one stabilne w wodzie w temperaturze 4 °C przez ponad 12 miesięcy bez wyraźnej agregacji. Aby ocenić ich zdolność do wiązania siRNA, PEI-SPIONs zmieszano z siRNA w różnych stosunkach masowych Fe:siRNA. Rysunek 1 pokazuje, że gdy stosunek masowy Fe:siRNA osiąga wartość ...

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Środek ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania. W dziedzinie humanologii. To odpowiedź w funkcji makrofagów w fizjologicznym końcu warunków patologicznych.Główną zaletą tej techniki jest to, że powłoka polietylenoiminowa może skutecznie prowadzić en vitro bez narażania komórki. W optymalnych dawkach. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę wielu przewlekłych zaburzeń zapalnych i nowotworów.Gdzie makrofagi odgrywają istotną rolę w patogenezie. Demonstracją procedury będzie Na Jia. Doktorantka z mojego laboratorium.I Kaixuan Wang, doktorant z laboratorium dr Xiaohua. Aby przygotować super paramagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza modyfikowane kwasem allilowym lub najpierw SPION, dodaj 28 gramów sześciowodnego chlorku fary. I 20 gramów pharas samowystarczalnych siedmiowodnych do zlewki zawierającej 80 mililitrów wody dejonizowanej.I użyj szklanego przewodu, aby wprowadzić azot do roztworu. Mieszanie, aż ciało stałe się rozpuści. Podgrzej mieszaninę reakcyjną do 72 stopni Celsjusza, mieszając z prędkością 800 obrotów na minutę.I dodaj 40 mililitrów 28% wody amoniakalnej do zlewki. Po pięciu minutach dodaj kroplami dziewięć mililitrów kwasu allilowego. I utrzymuj mieszaninę w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez trzy godziny, ciągle mieszając.Pod koniec inkubacji schłodzić powstały roztwór do temperatury pokojowej. I wytrącić mieszaninę poprzez separację magnetyczną zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przemyć osad zawierający SPION trzykrotnie absolutnym alkoholem etylowym.I wytrącić osad w 100 mililitrach n-heksanu. Aby przygotować dimerkapto modyfikowane kwasem akrylowym SPION, dodaj 800 miligramów SPION-ów modyfikowanych kwasem allilowym. Zdyspergowany w 200 mililitrach n-heksanu i 400 miligramach dimerkapto kwasu akrylowego zdyspergowanego w 200 mililitrach acetonu w kolbie z trzema szyjkami w łaźni wodnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Następnie dodaj kroplami 200 mikrolitrów trietyloaminy do kolby, mieszając z prędkością 1000 obrotów na minutę i cofając. osad można uzyskać przez separację magnetyczną po pięciu godzinach. Następnie użyj wodorotlenku tetrametyloamonu, aby dostosować pH roztworu do jednorodnego dyspersji hydrofilowych SPION-ów w wodzie dejonizowanej.Zdegenerowane SPION's pokryte polietylenoiminą dodają dimerkapto modyfikowany kwasem akrylowym roztwór koloidalny SPION do 10-kilodaltonowego roztworu polietylenoiminy. W kolbie o pojemności 500 mililitrów z trzema szyjkami pod mieszaniem mechanicznym z prędkością 1000 obrotów na minutę przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji dodać powstały roztwór do rurki ultrafiltracyjnej o masie cząsteczkowej odciętej 100 kilodaltonów i zawartości 15 mililitrów.Odcentrować próbkę, aż pozostały roztwór osiągnie objętość jednego mililitra. Dodaj wodę dejonizowaną do roztworu, aby przywrócić objętość do 15 mililitrów. Następnie odwirować i ponownie uwodnić roztwór jeszcze dziesięć razy, jak to właśnie pokazano.Następnie przefiltruj roztwór przez filtr o średnicy 22 mikronów do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować nanocząstki siRNA, najpierw dodaj trzy mikrolitry świeżo przygotowanych 20 mikromolowych roztworów siRNA do pięciu wolnych mikrocentrycznych probówek znakowanego RNA. I dodaj 0, 8, 1,6, 3,2 i 6,4 mikrogramów polietylenoiminy SPION do probówek oznaczonych odpowiednio zero, jeden, dwa, cztery i osiem.Po wymieszaniu z delikatnym pipetowaniem inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów siRNA polietylenoiminy SPION. I przygotuj trzyprocentowy żel agarozowy z agarozą o czystości I. Pod koniec inkubacji dodać jeden mikrolitr buforu ładującego DNA 6X na pięć mikrolitrów próbki do każdej probówki i dokładnie wymieszać.Następnie załaduj wszystkie próbki do żelu. I uruchom elektroforezę przy pięciu woltach na centymetr. Aż niebieski barwnik bromofenolowy przeniesie dwie trzecie długości żelu.Dzień przed transfekcją przemyj hodowlę komórkową myszy mikrofagową, taką jak RAW264.7, PBS. I potraktuj komórki jednym mililitrem 25% trypsyny przez pięć do dziesięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Gdy większość komórek się odłączy.Dezaktywuj trypsynę za pomocą pięciu mililitrów kompletnego DMEN. Następnie kilkakrotnie przetrzeć roztwór pipetą, aby rozproszyć wszelkie skupiska komórek. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnej 15-mililitrowej probówki conackel w celu odwirowania.Następnie ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach świeżego kompletnego DMEN w celu zliczenia. Rozcieńczyć komórki do 4,5 razy dziesięć do czwartej komórki na mililitr całkowitego stężenia DMEN. I dodaj dwa mililitry pożywki do każdej studzienki sześciodołkowej płytki na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych.Następnego dnia przygotuj odpowiedni stosunek nanocząstek siRNA polietylenoiminy SPION w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej ze strumieniem RNA, delikatnie mieszając, jak pokazano. I dodaj odpowiednią objętość kompleksu nanocząstek polietylenoiminy SPION siRNA do każdej studzienki, która została zastąpiona jednym mililitrem świeżej pożywki. Przygotować kompleksy polietylenoiminy SPION si.w tym przypadku można zastosować o wiele więcej miesięcy polietylenoiminy SPION, minimalizując w ten sposób ich potencjalną toksyczność. Następnie ostrożnie zakręć płytką, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie nanocząstek na dnie studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu późniejszej aktualizacji komórkowej lub analizy niedoboru genu.Polietylenoiminy SPION's o potencjale zeta 30,5 i 37 miliwoltów nie wykazują widocznej cytotoksyczności w stężeniach do 30 mikrogramów żelaza na mililitr. Czyli około dwa razy więcej niż stężenie zwykle stosowane do transfekcji komórek. Potencjał zeta polietylenoiminy SPION wynoszący 48 miliwoltów jest jednak toksyczny.Nawet przy najniższej badanej dawce. Jak wynika z analizy za pomocą cytometrii przepływowej, ponad 90% komórek można transfekować znakowanymi fluorescencyjnie kompleksami siRNA z polietylenoiminy SPION w stężeniu 15 mikrogramów żelaza na mililitr. Ocena wpływu stężeń siRNA polietylenoiminy SPION na internalizację komórkową poprzez kruszenie niebieskiego barwienia ujawnia minimalnie wykrywalne barwienie przy 7,5 mikrograma żelaza na mililitr.Ale wyraźnie widoczne plamy przy 15 mikrogramach żelaza na mililitr, które nie zwiększają się przy wyższych stężeniach żelaza, prawdopodobnie z powodu wysycenia siRNA polietylenoinoiminy SPION. Makrofagi otrzewnowe transfekowane polietylenoiminą SPION zawierające specyficzne siRNA wykazują znaczny spadek poziomów mRNA w porównaniu z niespecyficznym siRNA. Sugeruje to, że siRNA może uciec z pęcherzyków endocytarnych do cytoplazmy, aby dotrzeć do maszynerii interferencyjnej RNA.Co więcej, po dożylnym wstrzyknięciu pojedynczej dawki polietylenoinoiminy SPION kompleksy nanocząstek siRNA, analiza flocentymetryczna komórek CD11b dodatnich i CD3-dodatnich ujawnia bardziej efektywny wychwyt nanocząstek przez makrofagi eksprymujące CD11b niż przez komórki CD3-dodatnie w dowolnym punkcie czasowym we wszystkich badanych narządach. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu polietylenoiniminowych SPION-ów o średnim potencjale danych nie wyższym niż 37 miliwoltów oraz o przygotowaniu kompleksów siRNA polietylenoiminy SPION o niskim stosunku żelaza do siRNA. Technika ta porównuje potrzebę zbadania przez naukowców potencjału terapeutycznego ukierunkowanego na makrofagi w silnikach zwierzęcych chorób ludzkich, takich jak rak.

polyethyleneimine-coated-iron-oxide-nanoparticles-as-vehicle-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ten manuskrypt demonstruje wyczerpanie ekspresji genów w jelicie środkowym karalucha niemieckiego poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w liposomach.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Hamowanie mikroRNA specyficzne dla tkanek to technologia, która jest słabo rozwinięta w dziedzinie mikroRNA. W tym artykule opisujemy protokół skutecznego hamowania rodziny mikroRNA miR-181 w komórkach mioblastów z serca. Technologia nanowektorowa jest wykorzystywana do dostarczania gąbki mikroRNA, która wykazuje znaczące inhibicję rodziny miR-181 specyficznej dla układu krążenia in vivo.

In vivo (in vivo) Nanowektorowe dostarczanie gąbki mikroRNA specyficznej dla serca

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj metodę transfekcji makrofagów nanocząstkami tlenku żelaza pokrytymi polietylenominą do dostarczania siRNA in vitro i in vivo. Technika umożliwia skuteczne wyciszanie genów w badaniach immunologicznych i terapii chorób zapalnych.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów