Name: Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny ekspresji mikroRNA w płucach myszy narażonych na działanie ozonu w różnych fazach cyklu rujowego. Technika ta pozwala badać wpływ hormonów na regulację genów zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z NIH K01HL133520 (PS) i K12HD055882 (PS). Autorzy dziękują dr Joannie Floros za pomoc w eksperymentach z ekspozycją na ozon.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego w Pennsylwanii.
1. Ocena etapu cyklu rujowego
<ol>
	<li>Prawidłowo unieruchom, którą samica myszy C57BL/6 (w wieku 8–9 tygodni) ma za pomocą techniki krępowania jedną ręką opisanej w Machholz et al.10.</li>
	<li>Napełnij sterylną plastikową pipetę 10 μl ultraczystej wody.</li>
	<li>Wprowadź końcówkę plastikowej pipety do pochwy.</li>
	<li>Delikatnie przepłucz płyn 4–5 razy, aby pobrać próbkę.</li>
	<li>Umieść końcowe płukanie zawierające płyn dopochwowy na szklanym szkiełku.</li>
	<li>Obserwuj niezabarwione płukanie pochwy pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 20x. 
	nuta: Zwierzęta, które nie wykazują regularnych cykli z powodu ciąży rzekomej lub innych przyczyn, muszą zostać wykluczone z eksperymentu. Zaleca się wykonywanie codziennej wydzieliny z pochwy przez co najmniej trzy kolejne cykle w celu potwierdzenia cykliczności.</li>
</ol>
2. Narażenie na ozon
<ol>
	<li>Umieść maksymalnie 4 myszy w dwóch szklanych pojemnikach o pojemności 1,2 l z pokrywkami z siatki drucianej i wodą ad libitum.</li>
	<li>Umieść jeden szklany pojemnik w komorze ozonowej, a drugi w komorze naświetlania przefiltrowanego powietrza.</li>
	<li>Dostosować stężenie ozonu do 2 ppm i regularnie monitorować poziom ozonu. 
	nuta: Aparat ozonowy zapewnia regulowany przepływ powietrza (>30 wymian powietrza/h) z kontrolowaną temperaturą (25 °C) i wilgotnością względną (50%). System wytwarza ozon za pomocą ozonizatora elektroerozyjnego, który jest monitorowany i kontrolowany przez analizator ozonu ultrafioletowego i kontrolery przepływu masowego, jak opisano wcześniej11.</li>
	<li>Wyjmij szklane pojemniki po 3 godzinach ekspozycji na ozon/przefiltrowane powietrze. Umieść zwierzęta w klatce z ściółką, jedzeniem i wodą ad libitum.</li>
</ol>
3. Zbieranie płuc
<ol>
	<li>4 godziny po ekspozycji znieczulić zwierzęta wstrzyknięciem dootrzewnowym koktajlu ketamina/ksylazyna (90 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny). 
	nuta: Aby potwierdzić prawidłowy poziom znieczulenia, sprawdź, czy w myszy nie ma odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i w razie potrzeby dostosuj znieczulenie.</li>
	<li>Zwilż skórę myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek operacyjnych i pęsety chirurgicznej, aby odsłonić żyłę główną.</li>
	<li>Ofiaruj myszy przez przecięcie żyły głównej i aorty. W razie potrzeby wprowadzić igłę o rozmiarze 21 G do żyły głównej powyżej żył nerkowych, aby pobrać krew przed wykrwawieniem. Alternatywnie, pobierz krew przez nakłucie serca zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby rozciąć jamę brzuszną i usunąć skórę/górny mięsień, przesuwając się w górę w kierunku żeber.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przebić przeponę. 
	nuta: Płuca zapadną się z dala od przepony.</li>
	<li>Odetnij klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić serce i płuca.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy weź 1,5 ml probówki do mikrowirówki bez RNaz i zanurz ją w ciekłym azocie, aby napełnić probówkę. 
	nuta: Używaj okularów i rękawic ochronnych do obchodzenia się z ciekłym azotem.</li>
	<li>Wyjmij płuca, umieść je w probówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych ciekłym azotem do mikrowirówki bez RNaz w celu natychmiastowego zamrożenia tkanki i odczekaj kilka sekund, aż płyn odparuje.</li>
	<li>Zamknij pokrywę probówki i przechowuj chusteczkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie RNA
<ol>
	<li>Sproszkować całe płuca za pomocą rozdrabniacza do tkanek ze stali nierdzewnej. 
	nuta: Rozdrabniacz do tkanek należy przed użyciem umieścić w ciekłym azocie. Czyścić rozpylacz po każdym użyciu roztworem RNAzy.</li>
	<li>Podziel sproszkowane płuca i umieść je w dwóch probówkach o pojemności 1,5 ml (po połowie płuca każda).</li>
	<li>Dodać 500 μl tiocyjanianu guanidyny na probówkę z próbką i wymieszać. Homogenizować każdą próbkę za pomocą igieł o sile odpowiednio 18 G, 21 G i 23 G. 
	nuta: Próbki można wzbogacić 5,6 x 108 kopiami małej kontroli kolca RNA (z innego gatunku) przed przystąpieniem do ekstrakcji.</li>
	<li>Dodać 500 μl etanolu do każdej próbki i wirować przez 15 sekund.</li>
	<li>Załadować mieszaninę do kolumny wirowej do probówki zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Do leczenia DNazą I (w kolumnie);
	<ol>
		<li>Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>W probówce wolnej od RNaz dodać 5 μl DNazy I i 75 μl 1x buforu do trawienia DNA i wymieszać. Dodaj mieszankę bezpośrednio do matrycy kolumnowej.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 400 μl roztworu do płukania wstępnego RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten krok.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu do płukania RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałego buforu. Przenieść kolumnę do probówki wolnej od RNaz.</li>
	<li>Aby wymyć RNA, dodaj 35 μl wody wolnej od DNaz/RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i odwiruj przy 12 000 x g przez 1,5 minuty.</li>
	<li>Zmierzyć całkowite stężenie RNA (260 nm) i czystość za pomocą spektrofotometru. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby przeprowadzić kwantyfikację RNA w podwielokrotności próbki o objętości 1,5 μl. Opróżnij przyrząd wodą wolną od DNaz/RNaz używaną do elucji. 
	nuta: Stosunek 260/280 wynoszący ~2,0 jest ogólnie akceptowany jako "czysty" dla RNA. Typowe stężenie RNA zwykle waha się od 750 do 2 500 ng/μl.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Profilowanie miRNA
<ol>
	<li>Aby dokonać transkrypcji retro-małych RNA, użyj 200 ng całkowitego RNA.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji na lodzie (całkowita objętość na reakcję wynosi 20 μl). Do każdej reakcji dodać 4 μl 5x buforu, 2 μl mieszanki 10x nukleotydów, 2 μl odwrotnej transkryptazy i 2 μl wody wolnej od RNaz. Wymieszać wszystkie składniki i podwielokrotność w 600 μl plastikowych probówkach bez RNAse (10 μl mieszaniny na reakcję). 
		nuta: Główna mieszanina odwrotnej transkrypcji zawiera wszystkie składniki wymagane do syntezy pierwszej nici cDNA z wyjątkiem matrycy RNA. 
		nuta: Oblicz nadmiar objętości (10%) podczas przygotowywania mieszanki głównej.</li>
		<li>Dodać matrycę RNA (200 ng w 10 μl) do każdej probówki zawierającej główną mieszankę odwrotnej transkrypcji. Wymieszaj, odwiruj przez 15 s przy 1,000 x g i przechowuj je na lodzie do momentu umieszczenia w termocyklerze lub suchym bloku.</li>
		<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C i umieścić probówki na lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć cDNA, dodając 200 μl wody wolnej od RNaz do każdych 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu macierzy miRNA PCR myszy z odpowiedzią zapalną i autoimmunizacją.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną (całkowita objętość 1100 μL): Do każdej reakcji dodać 550 μL 2x głównej mieszanki PCR, 110 μL 10x uniwersalnej mieszaniny starterów, 340 μl wody wolnej od RNaz i 340 μL matrycy cDNA (rozcieńczona reakcja z kroku 5.1.5).</li>
		<li>Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki wstępnie załadowanej macierzy miRNA PCR za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę miRNA PCR Array optyczną folią samoprzylepną.</li>
		<li>Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków.</li>
		<li>Zaprogramuj cykler w czasie rzeczywistym, etap początkowej aktywacji PCR przez 15 minut w temperaturze 95 °C, 3-etapowy cykl zawierający denaturację przez 15 s w temperaturze 94 °C, wyżarzanie przez 30 s w temperaturze 55 °C i przedłużenie przez 30 s w temperaturze 70 °C przez 40 cykli liczba. 
		nuta: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi warunków jazdy na rowerze, aby skonfigurować cykler w czasie rzeczywistym. Wykonaj krok krzywej dysocjacji wbudowany w oprogramowanie cyklera w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Przeprowadzanie analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyodrębnij wartości Ct z oprogramowania do PCR w czasie rzeczywistym dla każdej próbki do oprogramowania analitycznego. 
	nuta: Wartość Ct wynosząca 34 jest uważana za wartość odcięcia. Jeśli próbki zawierają kontrolę skoków (np. cel-mir-39), należy znormalizować wartości Ct do wartości skoku w kontroli dla każdej próbki. Może być konieczne ręczne ustawienie wartości progowych. Wartości linii bazowej są ustawiane automatycznie.</li>
	<li>Znormalizuj wartości Ct do średniej Ct z sześciu kontrolnych porządków miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, używając następującego równania: 
	ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>W przypadku obliczeń zmiany krotności należy obliczyć wartości ΔΔCt, używając określonej próbki jako kontroli, używając równania wyrażenia względnego12: 
	Względna ekspresja miRNA: 
	2-∆∆Ct, gdzie - ∆∆Ct = -[∆Ct test - ∆Ct kontrola] 
	nuta: Zmiana krotności o 200 jest uważana za odcięcie.</li>
	<li>Eksportuj wartości wyrażeń zmiany krotności, aby przeprowadzić analizę statystyczną na R przy użyciu pakietu limma w Bioconductor8.</li>
	<li>Popraw dla wielokrotnych porównań przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga13. 
	UWAGA: Kopia skryptu języka R jest dostępna pod adresem: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Zestawy danych i przeanalizowane dane są również dostępne w Gene Expression Omnibus pod numerem GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>
7. Analiza danych: Oprogramowanie do analizy funkcjonalnej
<ol>
	<li>Rozmieść zestaw danych. Uwzględnij miRNA wraz z ich odpowiednimi stosunkami logarytmu ekspresji i wartościami p. Zobacz Tabela 1, aby zapoznać się z określonym formatowaniem zestawu danych.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy funkcjonalnej (wersja 01-10).</li>
	<li>Przekaż zestaw danych przy użyciu następującego formatu: Format pliku: "Format elastyczny", Zawiera nagłówek kolumny: "Tak", Wybierz typ identyfikatora: "miRBase (dojrzałe)", Platforma tablicy używana do eksperymentów: wybierz platformę tablicy. 
	nuta: Akceptowane formaty plików to .txt (pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami), .xls (pliki Excela) i .diff (pliki cuffdiff).</li>
	<li>Wybierz opcję "Wnioskuj obserwacje" i sprawdź, czy etykietowanie grupy eksperymentalnej jest poprawne.</li>
	<li>Przejdź do "Podsumowanie zestawu danych", aby zmienić całkowitą ilość zmapowanych i niezmapowanych miRNA.</li>
	<li>Kliknij przycisk "nowy" w lewym górnym rogu programu. Wybierz "Nowy filtr docelowy mikroRNA" i prześlij zestaw danych mikroRNA.
	<ol>
		<li>Ustaw źródło na: TarBase, Ingenuity Experts Findings, miRecords.</li>
		<li>Ustaw Ufność na: Zaobserwowane eksperymentalnie lub Wysokie (przewidywane).</li>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj kolumny", aby uwzględnić różne informacje biologiczne o obiektach, takie jak gatunki, choroby, tkanki, szlaki i inne.</li>
		<li>Aby skupić się na obiektach docelowych, które zmieniły ekspresję w eksperymencie, wybierz opcję "Dodaj/zamień zestaw danych mRNA". Użyj "Parowania wyrażeń", aby zlokalizować mikroRNA o tych samych lub różnych poziomach ekspresji. 
		nuta: Analiza filtra dostarczy nazw i symboli mikroRNA, celów mRNA, źródła opisującego związek docelowy oraz poziomu ufności przewidywanego związku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij "Dodaj do mojej ścieżki", aby wysłać przefiltrowany zestaw danych do płótna ścieżki i zbadać więcej relacji biologicznych.</li>
	<li>Użyj narzędzia Path Designer, aby utworzyć model efektów mikroRNA o jakości publikacji.</li>
	<li>Alternatywną opcją jest utworzenie analizy podstawowej.
	<ol>
		<li>Jako typ analizy podstawowej wybierz "Analiza wyrażeń".</li>
		<li>Jako typ pomiaru wybierz "Expr Log Ratio".</li>
		<li>Podsumowanie filtra analizy: weź pod uwagę tylko cząsteczki i/lub relacje, gdzie: (gatunek = mysz) AND (pewność = zaobserwowane eksperymentalnie) AND (źródła danych = "Ingenuity Expert Findings", "Ingenuity ExpertAssist Findings", "miRecords", "TarBase", OR "TargetScan Human").</li>
		<li>Wybierz wartość odcięcia wartości p = 0,05.</li>
		<li>Uruchom plik analysis. 
		nuta: Raport będzie zawierał: szlaki kanoniczne, analizę regulatorów wyższego szczebla, choroby i funkcje, efekty regulatorów, sieci, cząsteczki i inne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+microRNAs+regulate+gene+expression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">How do microRNAs regulate gene expression?</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microrna%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li>
<li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li>
<li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).</li>
<li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li>
<li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.681.4748">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2346101">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Stomatologica+Croatica%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+purification-+precipitation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/0-387-29362-0_23">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li>
<li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59745-123-1:129">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li>
<li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TarBase%3A+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRecords%3A+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li>
<li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Profilowanie mikroRNA jest korzystną techniką zarówno w diagnostyce chorób, jak i badaniach mechanistycznych. W tym manuskrypcie zdefiniowaliśmy protokół oceny ekspresji miRNA, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne w płucach samic myszy narażonych na działanie ozonu w różnych etapach cyklu rujowego. Opisano metody określania cyklu rujowego, takie jak metoda detekcji wzrokowej16. Opierają się one jednak na jednorazowych pomiarach, a zatem są niewiarygodne. Aby dokładnie zidentyfikow...

mikroRNA (miRNA) to krótkie (od 19 do 25 nukleotydów), naturalnie występujące, niekodujące cząsteczki RNA. Sekwencje miRNA są ewolucyjnie konserwatywne u różnych gatunków, co sugeruje znaczenie miRNA w regulacji funkcji fizjologicznych1. Udowodniono, że profilowanie ekspresji mikroRNA jest pomocne w identyfikacji miRNA, które są ważne w regulacji różnych procesów, w tym odpowiedzi immunologicznej, różnicowania komórek, procesów rozwojowych i apoptozy2. Niedawno miRNA zostały docenione ze względu na ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób. Dla naukowców badających mechanizmy regulacji genów, pomiar ekspresji miRNA może oświecić modele procesów regulacyjnych na poziomie systemu, zwłaszcza gdy informacje o miRNA są łączone z profilowaniem mRNA i innymi danymi w skali genomu3. Z drugiej strony, wykazano również, że miRNA są bardziej stabilne niż mRNA w wielu typach próbek, a także są mierzalne z większą czułością niż białka4. Doprowadziło to do znacznego zainteresowania rozwojem miRNA jako biomarkerów do różnych zastosowań w diagnostyce molekularnej, w tym w chorobach płuc.
W płucach miRNA odgrywają ważną rolę w procesach rozwojowych i utrzymaniu homeostazy. Co więcej, ich nieprawidłowa ekspresja została związana z rozwojem i progresją różnych chorób płuc5. Zapalna choroba płuc wywołana zanieczyszczeniem powietrza wykazała większe nasilenie i gorsze rokowanie u kobiet, co wskazuje, że hormony i cykl rujowy mogą regulować wrodzoną odporność płuc i ekspresję miRNA w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe6. W tym protokole wykorzystujemy ekspozycję na ozon, który jest głównym składnikiem zanieczyszczenia powietrza, w celu wywołania formy zapalenia płuc u samic myszy, która występuje przy braku odporności nabytej. Stosując ozon, indukujemy rozwój nadreaktywności dróg oddechowych, która jest związana z uszkodzeniem komórek nabłonka dróg oddechowych oraz wzrostem liczby neutrofili i mediatorów stanu zapalnego w bliższych drogach oddechowych7. Obecnie nie ma dobrze opisanych protokołów charakteryzujących i analizujących miRNA w całym cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu. 
Poniżej opisujemy prostą metodę identyfikacji etapów cyklu rujowego i ekspresji miRNA w tkance płucnej samic myszy narażonych na działanie ozonu. Zajmujemy się również skutecznymi podejściami bioinformatycznymi do odkrywania miRNA i identyfikacji celów, z naciskiem na biologię obliczeniową. Analizujemy dane z mikromacierzy za pomocą limma, oprogramowania R/Bioconductor, które zapewnia zintegrowane rozwiązanie do analizy danych z eksperymentów z ekspresją genów8. Analiza danych z macierzy PCR z limma ma przewagę pod względem mocy nad procedurami opartymi na teście t przy użyciu niewielkiej liczby macierzy/próbek do porównania ekspresji. Aby zrozumieć biologiczny kontekst wyników ekspresji miRNA, użyliśmy oprogramowania do analizy funkcjonalnej. Aby zrozumieć mechanizmy regulujące zmiany transkrypcyjne i przewidzieć prawdopodobne wyniki, oprogramowanie łączy zestawy danych dotyczące ekspresji miRNA i wiedzę z literatury9. Jest to zaleta w porównaniu z oprogramowaniem, które po prostu szuka wzbogacenia statystycznego w nakładaniu się na zestawy miRNA.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td>8 tygodni</td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>Pojemność: 1,7 ml</td></tr><tr><td>Matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Świat</td><td>MW3-H5</td><td>10x i 20x obiektyw</td></tr><tr><td>Ketathesia- Ketamina HCl Injection USP</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>55853</td><td>90 mg / kg. Kontrolowany lek.</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór ksylazyny</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg / kg. Kontrolowany lek.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Rozcieńczyć wodą do 70% etanolu.</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 21 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, ostre/, zakrzywione i 9 cm, proste, cienkie zestaw pęsety z ostrą końcówką</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Rozdrabniacze do tkanek Bessman</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>Pojemność: od 10 do 50 mg</td></tr><tr><td>probówek do mikrofug bez RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>odczynnika TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>Reakcja zapalna myszy & Autoimmunizacja miRNA PCR Array</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne, wolne od DNaz i RNaz probówki do PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AM12225 dla 20 &mu; L reakcje</td></tr><tr><td>miRNeasy Surowica/Plazma Kontrola skoków</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Ingenuity Analiza ścieżek</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Oprogramowanie</td><td></td><td></td> <td>Fundacja Rhttps://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Termocykler lub blok chłodząco-grzewczy</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Cykler do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Ogólny dostawca laboratoryjny Pipeta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wielokanałowa</td><td>Ogólny dostawca laboratoryjny Bufor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do płukania RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>bufor do trawienia DNA</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 ml</td></tr><tr><td>RNA bufor do płukania wstępnego</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Analizator ozonu ultrafioletowego</td><td>Teledyne API</td><td>Model T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Kontrolery przepływu masowego</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

profilowanie mikrorna płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Profilowanie mikroRNA (miRNA) stało się przedmiotem zainteresowania badaczy zajmujących się różnymi obszarami badawczymi biologii i medycyny. Obecne badania wskazują na obiecującą przyszłość wykorzystania miRNA w diagnostyce i leczeniu chorób płuc. W tym miejscu definiujemy protokół profilowania miRNA w celu zmierzenia względnej obfitości grupy miRNA, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne w tkance płucnej z mysiego modelu zapalenia dróg oddechowych wywołanego ozonem. Ponieważ wykazano, że poziomy krążących hormonów płciowych mogą wpływać na regulację wrodzonej odporności płuc u samic, celem tej metody jest opisanie protokołu profilowania zapalnego miRNA u samic myszy, biorąc pod uwagę etap cyklu rujowego każdego zwierzęcia w momencie ekspozycji na ozon. Zajmujemy się również odpowiednimi podejściami bioinformatycznymi do odkrywania miRNA i metod identyfikacji celów przy użyciu limma, oprogramowania R/Bioconductor i oprogramowania do analizy funkcjonalnej, aby zrozumieć kontekst biologiczny i szlaki związane z różnicową ekspresją miRNA.

Różne typy komórek obserwowane w mazidłach służą do identyfikacji fazy cyklu rujowego u myszy (Rysunek 1). Są one rozpoznawane na podstawie morfologii komórek. Podczas proestrusy komórki stanowią niemal wyłącznie skupiska okrągłych, dobrze uformowanych jądrowych komórek nabłonkowych (Rysunek 1A). Gdy mysz znajduje się w fazie estrusu, komórki są zrogowaciałymi komórkami nabłonka płaskiego, występującymi w gęstych skupiskach (<str...

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności płuc dotyczące tego, jak ocenić ekspresję mikroRNA, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne w płucach. Technika ta oferuje prosty sposób identyfikacji udziału krążących hormonów w ekspresji mikroRNA w płucach. Aby ocenić etap cyklu rujowego, ręcznie unieruchom, w którym znajduje się ośmio- lub dziewięciotygodniowa samica myszy, i wprowadź do pochwy końcówkę plastikowej pipety o pojemności 10 mikrolitrów wypełnionej ultra czystą wodą.Delikatnie spłucz cztery do pięciu razy, aby pobrać próbkę i umieść ostatnie spłukiwanie płynu z pochwy na szklanym szkiełku. Następnie obserwuj niezabarwione płukanie pochwy pod mikroskopem świetlnym w 20-krotnym powiększeniu. W przypadku ekspozycji na ozon i przefiltrowane powietrze umieść maksymalnie cztery myszy w jednym z dwóch pojedynczych szklanych pojemników o pojemności 1.2 litra z pokrywkami z siatki drucianej.Umieść jeden szklany pojemnik w komorze ozonowej, a drugi w komorze naświetlania przefiltrowanego powietrza. Następnie dostosuj stężenie ozonu do dwóch części na milion, wyjmując pojemnik po trzech godzinach. Cztery godziny po ekspozycji zdezynfekuj odsłoniętą powierzchnię skóry pierwszej eksperymentalnej myszy 70% etanolem i odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca.Użyj kleszczy, aby zanurzyć 1,5-mililitrową probówkę wirówkową bez RNaz w ciekłym azocie i zamrozić pobrane płuco w ciekłym azocie. Następnie użyj rozpylacza do tkanek ze stali nierdzewnej, aby zmaskować całe płuco i podzielić sproszkowaną tkankę między dwie 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek. Po zebraniu i sproszkowaniu płuc wszystkich zwierząt w ten sam sposób, dodaj 500 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny do każdej próbki i sekwencyjnie homogenizuj każdą tkankę za pomocą igieł o rozmiarze 18, 21 i 23.Po ostatniej homogenizacji dodaj 500 mikrolitrów etanolu do każdej próbki przed wirowaniem przez 15 sekund. Załadować mieszaniny do indywidualnych kolumn wirowych w oddzielnych probówkach zbiorczych do odwirowania i wyrzucić przepływy. W przypadku leczenia DNazą 1 dodać 400 mikrolitrów buforu płuczącego RNA do każdej kolumny w celu kolejnego odwirowania i wymieszać pięć mikrolitrów DNazy 1 i 75 mikrolitrów buforu trawienia DNA na próbkę w probówkach wolnych od RNaz.Dodaj mieszaninę bezpośrednio do matryc kolumn w celu 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie przepłucz dwoma roztworami do płukania wstępnego RNA o pojemności 400 mikrolitrów przez odwirowanie. Aby wymyć RNA, dodaj 35 mikrolitrów wody wolnej od RNaz DNazy bezpośrednio do każdej matrycy kolumny w celu końcowego odwirowania i zmierz całkowite stężenie RNA i czystość każdej próbki na spektrofotometrze. Następnie przechowuj RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W przypadku retrotranskrypcji małej RNazy dodać 200 nanogramów całkowitego RNA w 10 mikrolitrach roztworu do płukania wstępnego do jednej probówki mieszaniny reakcji odwrotnej transkrypcji na próbkę. Po wymieszaniu próbki należy na krótko odwirować i umieścić je na lodzie do czasu ich inkubacji. Następnie inkubuj probówki przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie pięciominutową inkubację w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Pod koniec drugiej inkubacji rozcieńczyć CDNA 200 mikrolitrami wody wolnej od RNaz na 20 mikrolitrów reakcji odwrotnej transkrypcji i dodać 10 mikrolitrów każdej próbki mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki wstępnie załadowanej mysiej odpowiedzi zapalnej i macierzy PCR mikroRNA autoimmunizacji. Stadium proestrus można zidentyfikować po obecności okrągłych i dobrze uformowanych jądrzastych komórek nabłonkowych. Kiedy mysz jest w fazie rui, w rozmazie obserwuje się gęsto upakowane skupiska bezjądrzastych, rogowatych i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych.Podczas metestrus widoczne są zrogowaciałe komórki nabłonkowe i leukocyty wielojądrzaste. W diestrus leukocyty są na ogół bardziej rozpowszechnione. RNA wyekstrahowane z czterech płuc myszy, jak wykazano, wykazują stężenia kwasów nukleinowych w zakresie od 1198 do 2178 nanogramów na mikrolitr i średni stosunek A260 do A280 między 2,01 a 2,02 oraz średni stosunek A260 do A230 między 2,139 a 2,223.W tej tabeli przedstawiono logarytmiczne podwójne zmiany w ekspresji mikroRNA między myszami wystawionymi na działanie ozonu a przefiltrowanym powietrzem. Po przeprowadzeniu filtra docelowego mikroRNA i analizie rdzenia dla 14 mikroRNA, w celu uzyskania znaczącego stosunku logarytmu ekspresji i wartości P, dane te można zmapować za pomocą filtra docelowego mikroRNA. Podstawowa analiza dostarcza również informacji o szlakach kanonicznych, chorobach i funkcjach, regulatorach i sieciach.Co więcej, oprogramowanie do analizy funkcjonalnej może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy sieciowej, która pokazuje związek między interesującymi mikroRNA a innymi cząsteczkami. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby przed przeprowadzeniem eksperymentu codziennie sprawdzać cykl rui przez co najmniej trzy kolejne cykle. Po tej procedurze można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów zapalenia płuc w całym cyklu rui.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę innym badaczom zajmującym się odpornością płuc do zbadania mechanizmów regulacji hormonów płciowych przy użyciu innych modeli.

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym materiale opisujemy sposób identyfikacji fazy cyklu rozrodczego myszy (proestrus, estrus, metestrus lub diestrus) poprzez prosty, nieinwazyjny pobór oraz ocenę cytologiczną wymazów z pochwy. Opisujemy również, w jaki sposób cytologia pochwy odzwierciedla poziomy krążących hormonów, które warunkują przejście przez poszczególne etapy cyklu rozrodczego myszy.

Wykonanie płukania pochwy, barwienia fioletem krystalicznym i cytologicznej oceny pochwy w celu identyfikacji fazy cyklu rujowego u myszy

Dwa paradygmaty ćwiczeń zostały przetestowane na nowo opracowanym chemicznie indukowanym modelu myszy menopauzalnej, aby zbadać wpływ menopauzy na zdolność do ćwiczeń i adaptację serca do ćwiczeń.

Metoda badania wpływu chemicznie wywołanej niewydolności jajników na wydolność wysiłkową i adaptację serca u myszy

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Hormon folikulotropowy (FSH) w różnych tkankach i organach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Mysi model owariektomii i leczony FSH (OVF) może być wykorzystany do zbadania pozagonowego działania FSH.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis testu zakopanego jedzenia i eksperymentu z dyskryminacją zapachów społecznych, aby ocenić wpływ narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na funkcje węchowe u myszy.

Badanie wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe u myszy

Przedstawiamy tutaj protokół indukujący hipoksję u noworodkowych myszy poprzez podawanie ich w kontrolowanych warunkach z różnym stężeniem tlenu. Modele mysie poddane zmianom tlenu przy urodzeniu trwało zmieniały ekspresję miRNA zaangażowanych w indukcję zmian behawioralnych fenotypowych, takich jak autyzm.

Hipoksja zmienia poziomy miRNA zaangażowane w dziedziczenie niemendelowskie zaburzeń ze spektrum autyzmu u myszy

Poznaj metodę oceny ekspresji mikroRNA w płucach myszy narażonych na działanie ozonu w różnych fazach cyklu rujowego. Technika ta pozwala badać wpływ hormonów na regulację genów zapalnych.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

Przeglądaj więcej filmów