Name: Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę generowania antygenowo specyficznych emigrantów grasicy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w trójwymiarowym systemie hodowli. Technika ta umożliwia uzyskanie homogennej populacji komórek T o fenotypie naiwnym, zdolnych do proliferacji i supresji nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hiroshi Kawamoto i Kyoko Masuda za uprzejme dostarczenie linii komórkowej OP9/DLL1. Dziękujemy Alanowi B. Hoofringowi i Erinie Z. On za pomoc graficzną. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program amerykańskiego National Cancer Institute (ZIA BC010763) oraz program Cancer Moonshot dla Center for Cell-based Therapy w NCI, NIH. Prace wsparła również Fundacja Rodziny Milsteinów.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Raka (NCI) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH.
1. Przygotowanie komórek OP9/DLL1 do kohodowli z iPSC
<ol>
	<li>Hodowla komórek OP9/DLL1 w pożywce OP9 (minimum α niezbędne pożywki [α-MEM] + 20% nieinaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej [FBS] + 1x penicylina-streptomycyna + kwas askorbinowy [50 ng / ml] i mono-tioglicerol [100 nM]) w temperaturze 37 °C. Gdy komórki OP9 / DLL1 osiągną 80-95% konfluencji, przemyj je raz solą fizjologiczną buforowaną 1x magnezem, wapniem i czerwienią fenolową (zwaną dalej PBS).</li>
	<li>Dodać 4 ml 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9, oddziel warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 12 ml pożywki OP9.</li>
	<li>Umieść 2 ml zawiesiny komórek OP9/DLL1 na nowej 10-centymetrowej szalce Petriego do hodowli komórkowych i dodaj dodatkowe 8 ml pożywki OP9. Powtarzaj przejście co 2-3 dni. 
	nuta: Jakość FBS i warunki hodowli mają kluczowe znaczenie dla utrzymania ekspansji komórek OP9/DLL1 bez utraty ich zdolności do wspierania różnicowania iPSC. Dlatego zaleca się wstępną ocenę partii FBS i konsekwentne pasażowanie przy 80% zbiegu, aby zapobiec różnicowaniu się komórek i starzeniu się. Ważne jest również, aby przygotować wystarczającą ilość zamrożonych ogniw OP9/DLL1 i rozmrażać nowy zapas co 4–6 tygodni.</li>
</ol>
2. Różnicowanie in vitro iPSC w niedojrzałe limfocyty T
<ol>
	<li>W dniu 0 rozpocznij kohodowlę iPSC na zlewających się naczyniach OP9/DLL1.
	<ol>
		<li>Zebrać iPSC jako zawiesinę pojedynczej komórki przez trypsynizację (5 minut w 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C), zebrać komórki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki przy 1,0 x 105 iPSC na 10 ml pożywki OP9. Płytka 1,0 x 105 iPSC na zlewającą się płytkę OP9/DLL1 10 cm. 
		nuta: Szalki OP9/DLL1 10 cm służą do różnicowania iPSC, gdy osiągną 90–100% konfluencji. Różnice w konfluencji mogą wpływać na skuteczność różnicowania iPSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 3 odessać stare pożywki i zastąpić je 10 ml świeżymi pożywkami OP9.</li>
	<li>W dniu 6 komórki pasażowe.
	<ol>
		<li>Umyj każde 10 cm zlewające się naczynie OP9 10 ml PBS. Dodaj 3 ml 0,05% trypsyny na naczynie i inkubuj przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Dodać 4 ml pożywki OP9 i zebrać komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Przepuścić komórki przez sitko o wielkości 100 μm i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki różnicującej (pożywka OP9 z 5 ng/ml mysiego liganda Flt3 [FLT3L] i 5 ng/ml myszy IL-7) i zawiesinę komórek płytki na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 9 należy odessać stare podłoża i zastąpić je 10 ml świeżych pożywek różnicujących.</li>
	<li>W 11 dniu, gdy zaobserwuje się kardiomiocyty w koloniach iPSC, należy mechanicznie odłączyć nieprzylegające komórki za pomocą pipetowania i przefiltrować przez sitko do komórek o wielkości 100 μm. Wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 24 ml pożywki różnicującej. Umieść iPSC w zlewającej się 6-dołkowej płytce OP9/DLL1 (4 ml / dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W 15 dniu zbierz wszystkie nieprzylegające komórki i przefiltruj przez sitko o wielkości 40 μm.
	<ol>
		<li>Wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Kontynuuj pasażowanie nieprzylegających komórek co 3-4 dni, powtarzając krok 2.5.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 3D Hodowla narządów grasicy w celu wygenerowania iTE
<ol>
	<li>Pobranie płatów grasicy u płodu myszy i rozmieszczenie endogennych limfocytów za pomocą leczenia deoksyguanozyną (dGUO), jak opisano wcześniej16.</li>
	<li>W 7 dniu leczenia dGUO weź cztery nowe 10 cm szalki i napełnij każdą z nich 20 ml kompletnego podłoża (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanylo-L-glutamina + 1x pirogronian sodu + 1x minimalna niezbędna pożywka z aminokwasami endogennymi (MEM-NEAA) + 1x penicylina-streptomycyna + [1:1000] 2-merkapto etanol).</li>
	<li>Przenieś wszystkie membrany nitrocelulozowe z płatkami grasicy do jednego 10 cm naczynia. Odłącz poszczególne płaty od błony za pomocą kleszczy, umożliwiając ich zanurzenie w pożywce. Wyrzuć membrany. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść płaty grasicy do nowego 10-centymetrowego naczynia z kompletną pożywką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przymocuj płaty grasicy do naczynia (pojedynczo), a drugą ręką wykonaj nacięcie o głębokości 100–200 μm pośrodku i przedłużające połowę średnicy płata, aby ułatwić migrację progenitorów limfocytów T do płata.</li>
	<li>Przenieś płatki grasicy do nowego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego kompletną pożywką różnicującą (kompletna pożywka + 5 ng/ml myszy IL-7 + 5 ng/ml myszy FLT3L + 5 ng/ml SCF).</li>
	<li>Opcjonalnie, jeśli używasz płytek hodowlanych 3D z siatkami dolnego i górnego poziomu, wypełnij obie siatki sterylnym PBS, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu wiszących kropli.</li>
	<li>Przenieść 30 μl kompletnej pożywki zawierającej jeden płat grasicy podany działaniu dGuo z kroku 3.6 do każdego dołka płytki hodowlanej 3D.</li>
	<li>Zebrać nieprzylegające komórki linii T (niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC) z kohodowli OP9/DLL1 (dni 16-21) (krok 2.6.2) i ponownie zawiesić w 2–5 x 103 komórki linii T na 20 μl pożywki.</li>
	<li>Dodać 20 μl zawiesiny komórek linii T do każdego płata grasicy na płytce hodowlanej 3D. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . </li>
	<li>Ustawić pipetę P200 na 30 μl i po kilkukrotnym pipetowaniu odessać pożywkę z każdej studzienki, aby usunąć wszystkie komórki otaczające płaty grasicy. Wyrzucić pożywkę i dodać 30 μl kompletnej pożywki. Powtórz tę procedurę 5-7 razy, aby usunąć wszelkie dodatkowe niedojrzałe limfocyty T, które nie migrują do płatów. Następnie należy wymieniać 25–30 μl pożywki dziennie.</li>
	<li>Potwierdź tworzenie się halo emigrantów grasicy pochodzących z iPSC (iTE) wokół płatów począwszy od 4-5 dnia za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
	<li>Codziennie zbieraj iTE, pipetując media bez zakłóceń płatkowych. Zmieniaj nośniki codziennie i kontynuuj zbieranie do około 12 dni.</li>
	<li>Pobrane iTE są gotowe do użycia do analiz molekularnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5) lub eksperymentów transplantacyjnych in vivo.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek prezentujących antygen (APC)
<ol>
	<li>Poświęć mysz C57BL/6 przez zwichnięcie szyjki macicy i umieść ją na macie laboratoryjnej, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Usuń śledzionę i umieść ją na sitku do komórek o wielkości 100 μm. Wyciśnij śledzionę na sitko za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 12 ml, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek przez sterylne sitko o wielkości 40 μm. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) w celu wykluczenia czerwonych krwinek (RBC). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ugasić bufor do lizy ACK, dodając 10 ml PBS. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki i przenieść na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Napromieniuj splenocyty 3500 radami za pomocą urządzenia do napromieniania (promieniowanie γ), aby zapobiec proliferacji komórek.</li>
	<li>Napromieniowane komórki należy natychmiast umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i przeprowadzić hodowlę przez noc.</li>
	<li>Użyj napromieniowanych komórek jako APC lub zamroź w banku komórek.</li>
</ol>
5. Pulsujący APC z antygenem
<ol>
	<li>Policz żywy napromieniowany APC za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego. Inkubować APC z peptydami (hgp100) lub nukleoproteiną przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj APC dwukrotnie 10 ml PBS, aby usunąć nadmiar peptydu.</li>
	<li>Policz iTE i wymieszaj z APC w stosunku 1:1 w kompletnych pożywkach ze 100 IU IL-2 i 5 ng/ml IL-7. Podwielokrotność 100 μl mieszaniny komórek (całkowite stężenie: 1 x 106 komórek/ml) do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu i hodowli przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 48 godzinach przenieść komórki na nową płytkę za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie pasować co 2-3 dni.</li>
	<li>W dniu 3 przeanalizuj profil wydzielania cytokin, barwiąc komórki przeciwciałem wewnątrzkomórkowym i analizuj za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).
	<ol>
		<li>Dodać 0,67 μl/ml inhibitora transportu białek (np. GolgiStop) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin, aby zwiększyć wewnątrzkomórkową akumulację cytokin. Przemyć 10 ml PBS.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 3 ml zimnego (4 °C) PBS i powoli dodaj 1 ml zimnego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA).</li>
		<li>Po 10 minutach odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przemyć 10 ml PBS.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 ml PBS + 1% FBS + 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i umieścić w temperaturze 4 °C na 10–15 minut.</li>
		<li>Dodać przeciwciała, chronić próbki przed światłem i umieścić w temperaturze 4 °C na 30 minut.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przemyć 10 ml PBS.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Komórki są gotowe do analizy w cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).</li>
<li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li>
<li>Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reactivity+in+thymic+double-positive+cells+commits+cells+to+a+CD8+alpha+alpha+lineage+with+characteristics+of+innate+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells.</a> Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).</li>
<li>Themeli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-targeted+human+T+lymphocytes+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).</li>
<li>Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+TCR+expression+and+aberrant+T+cell+development+in+mice+with+endogenous+prerearranged+T+cell+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes.</a> Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li>
<li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li>
<li>Serwold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor-driven+lymphomagenesis+in+mice+derived+from+a+reprogrammed+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li>
<li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+2-dGuo-treated+thymus+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li>
<li>Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medullary+thymic+epithelial+stem+cells%3A+role+in+thymic+epithelial+cell+maintenance+and+thymic+involution%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+L-selectin%3A+homing%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Adolescence%3A+Maturation+Events+Beyond+Positive+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection.</a> Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).</li>
<li>Best, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+insights+into+the+CD8%28%2B%29+T+cell+response+to+infection+and+memory+T+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation.</a> Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).</li>
<li>Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+thymocyte+selection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo.</a> International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).</li>
<li>Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+T+lymphocytes+in+fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).</li>
<li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+CCR7+ligands+in+the+emigration+of+newly+generated+T+lymphocytes+from+the+neonatal+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus.</a> Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).</li>
<li>Watanabe, Y., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+T+cell+receptor+alpha+beta-bearing+T+cells+in+the+submersion+organ+culture+of+murine+fetal+thymus+at+high+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration.</a> European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).</li>
</ol>

Autorzy Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen i Nicholas P. Restifo są wynalazcami w oczekującym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/US2017/65986, złożonym 13 grudnia 2017 r., zatytułowanym "Metody przygotowania izolowanej lub oczyszczonej populacji komórek emigranta grasicy i metody leczenia przy użyciu tego samego".

Wykorzystanie T-iPSC do regeneracji limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego może przezwyciężyć wiele obecnych przeszkód związanych z ACT poprzez generowanie młodych komórek o lepszej trwałości. Chociaż zgłoszono kilka metod wykorzystujących system kohodowli OP9 / DLL1 w celu wygenerowania komórek CD8 SP 6,7,10,13, które wyrażają cząsteczki CD8 i TCR specyficzne dla antygenu nowotworowego, globalne wzorce ekspresji genów i analiza funkcjonalna pokazują, że te pozatonimicznie zregenerowane komórki SP CD8 różnią się od naiwnych limfocytów T (Figura 4). W tym miejscu opisujemy system hodowli grasicy 3D, który może generować emigrantów grasicy pochodzących z iPSC (iTE) z wysoką wiernością i jednorodnością z mysiego T-iPSC. iTE przypominają naiwne limfocyty T pod względem globalnego wzorca ekspresji genów i funkcjonalności, takiej jak tworzenie pamięci i działanie przeciwnowotworowe in vivo przeciwko ustalonemu nowotworowi15.
Klasyczny system FTOC jest sposobem na podsumowanie selekcji grasicy in vitro. Był on używany do badania rozwoju wewnątrzgrasicowego tymocytów23 i istnieje kilka doniesień o wykorzystaniu FTOC do generowania RTE24. System FTOC ma jednak kilka ograniczeń. Aby poradzić sobie z brakiem tlenu w hodowli sztucznych narządów, kilka grup wykorzystało albo półsuchą hodowlę membranową23, albo systemy hodowli zanurzeniowej o wysokiej zawartości tlenu25. Jednak żadne obecne metody nie są w stanie stale generować jednorodnej populacji post-grasiczych limfocytów T. Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznego systemu FTOC, zaprojektowaliśmy system hodowli grasicy 3D, który zapewnia ulepszenia techniczne w porównaniu z konwencjonalnymi metodami15. Na przykład, korzystając z naszej metody hodowli grasicy 3D, maksymalna wymiana tlenu i brak naprężeń mechanicznych w płacie powierzchniowym utrzymują płaty grasicy w bardziej fizjologicznym środowisku. Ponadto długotrwała hodowla pozwala dojrzałym limfocytom T na naturalne wydostanie się z płatów grasicy. Wreszcie, obserwacja w czasie rzeczywistym i mikromanipulacja umożliwiają wymianę pożywek i ciągłe gromadzenie iTE bez fizycznego zakłócania płatów grasicy. W związku z tym metoda hodowli grasicy 3D zapewnia znaczące ulepszenia techniczne, a także możliwość badania tymicznie wybranych naiwnych limfocytów T, która nie była wcześniej dostępna.
Istnieje kilka kluczowych punktów dla udanego generowania iTE przy użyciu tego systemu hodowli grasicy 3D. Jakość FBS i warunków hodowli ma kluczowe znaczenie dla utrzymania ekspansji komórek OP9/DLL1 bez utraty ich zdolności do wspierania różnicowania iPSC. Dlatego zalecamy wstępną ocenę partii FBS, a także konsekwentne przechodzenie przy 80% zbiegu, aby zapobiec różnicowaniu się i starzeniu komórek. Dodatkowo, do różnicowania iPSC in vitro w niedojrzałe limfocyty T wymagana jest zlewająca się hodowla OP9/DLL1, ponieważ różnice w konfluencji mogą wpływać na ich skuteczność. Wreszcie, wiek embrionalny płatów grasicy ma kluczowe znaczenie dla wytwarzania iTE. Zalecamy stosowanie płatów grasicy E14,5 - 15,5.
Podobnie jak w przypadku każdego nowego protokołu, ta metoda ma ograniczenia i może być ulepszana. Przedstawiona tutaj technika hodowli generuje około 1000 iTE na płat grasicy dziennie przez okres dwóch tygodni. Zwiększona generacja iTE może być możliwa dzięki dalszym modyfikacjom, w tym optymalizacji stężenia tlenu, objętości pożywki i rodzaju płytki hodowlanej 3D. Dodanie lub usunięcie cytokin, a także zmiany w stężeniu cytokin mogą również przyczynić się do poprawy wydajności ite.
Biorąc pod uwagę, że przedstawiony tutaj system hodowli grasicy 3D może generować emigrantów grasicy w systemie całkowicie ex vivo , technika ta może być stosowana w różnych immunologicznych i adoptywnych projektach badawczych dotyczących transferu komórek, w tym między innymi różnicowania limfocytów T, dojrzewania limfocytów T po grasicy i wytwarzaniu limfocytów T specyficznych dla antygenu z krwiotwórczych komórek progenitorowych lub macierzystych. Chociaż metoda ta nie ma bezpośredniego zastosowania do próbek ludzkich, iTE i system hodowli grasicy 3D mają ogromny potencjał w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów selekcji pozytywnej i negatywnej oraz mogą ułatwić stworzenie systemu hodowli, który umożliwia generowanie klinicznie istotnych naiwnych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego dla ACT.

Adoptywna terapia limfocytami T (ACT) może być skuteczną metodą leczenia niektórych pacjentów z zaawansowanym rakiem. Niestety, wielu pacjentów nie doświadcza regresji guza, a przeniesione komórki nie utrzymują się po infuzji. Może to wynikać z jakości podawanych limfocytów T. Mysi model ACT wykazał, że w porównaniu z naiwnymi lub mniej zróżnicowanymi komórkami T pamięci centralnej, kończnie zróżnicowane komórki efektorowe są słabsze ze względu na słabą trwałość in vivo1, obserwacja ta jest również poparta danymi klinicznymi2,3.
W celu poprawy skuteczności obecnego ACT, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z limfocytów T (T-iPSC) zostały szeroko przebadane4,5. Kiedy limfocyty T są przeprogramowywane w T-iPSC i ponownie różnicowane w limfocyty T, przegrupowana konfiguracja genów TCR jest dziedziczona przez T-iPSC, a następnie przez ponownie zróżnicowane limfocyty T. W związku z tym zdolność T-iPSC do nieograniczonej ekspansji in vitro pozwala na wydajną reprodukcję niedojrzałych limfocytów T przenoszących receptory limfocytów T specyficznych dla neoantygenu (TCR), gdy takie komórki są modyfikowane z limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego6,7. Jednak dokładna metoda różnicowania T-iPSC w dojrzałe limfocyty T, która pozwoliłaby na produkcję limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego o mniej zróżnicowanym fenotypie i lepszej sile przeciwnowotworowej, pozostaje do wyjaśnienia.
Różnicowanie T-iPSC wykorzystujące kokulturę mysich komórek zrębowych OP9 z nadmierną ekspresją ludzkiego ligandu Notch DLL1 jest dobrze znaną metodą produkcji limfocytów T in vitro6,7. U myszy i ludzi ten system kohodowli może konsekwentnie różnicować iPSC, rekapitulując w ten sposób zdarzenia rozwojowe od stadium blastocysty do etapu niedojrzałej linii limfocytów T6,7. Pomimo tych postępów biotechnologicznych, fizjologiczne różnicowanie po podwójnie dodatnim (DP) etapie CD4 + CD8 + jest nadal trudne do osiągnięcia. Jednym z powodów jest to, że in vivo pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD4 + CD8 i CD4-CD8 + są generowane w grasicy, narządzie odpowiedzialnym za dojrzewanie i selekcję limfocytów T, które mają obcą swoistość antygenową, ale nie autoreaktywność8. Te selektywne procesy są definiowane odpowiednio jako selekcja pozytywna i negatywna. Jednak większość mechanizmów molekularnych niezbędnych do dojrzewania limfocytów T w grasicy wciąż nie jest w pełni poznana, co utrudnia rekonstrukcję tego procesu in vitro. Próbując pokonać tę fizjologiczną przeszkodę, kilka grup stymulowało kompleks TCR za pomocą przeciwciał anty-CD3 lub peptydów agonistycznych. Te techniki in vitro generują produkty komórkowe, które wyrażają kluczowe markery limfocytów T, takie jak CD3, CD8αβ, TCRαβ i CD62L, zachowując przy tym specyficzność antygenu nowotworowego. Niestety, limfocyty T generowane tymi metodami pozagrasickim stanowią szeroką heterogeniczną populację komórek charakteryzujących się niekompletną selekcją pozytywną, cechami wrodzopodobnymi, niespecyficznym zabijaniem TCR, niezdolnością do tworzenia pamięci i nietrwałym działaniem przeciwnowotworowym in vivo8,9,10,11. Nieprawidłowości te wzbudziły obawy, że takie komórki mogą wywoływać różne skutki uboczne, w tym chłoniaka oraz nieprawidłowości zarówno skóry, jak i kości, jeśli są używane do zastosowań terapeutycznych12,13,14.
Aby odtworzyć sygnały fizjologiczne, których brakuje w obecnych systemach różnicowania in vitro, specyficzne dla antygenu nowotworowego T-iPSC zostały zróżnicowane za pomocą pobranej grasicy. Klasyczny system hodowli narządów grasicy płodu (FTOC), który został zaprojektowany do badania rozwoju wewnątrzgrasiczego limfocytów T, został ulepszony dzięki zastosowaniu systemu hodowli 3D, który z powodzeniem wyprodukował limfocyty T, które uzupełniły edukację grasicy. Te post-grasicze limfocyty T, które zostały oznaczone jako emigranci grasicy pochodzący z iPSC (iTE), wykazywały właściwości podobne do naiwnych15. iTE wykazał proliferację, tworzenie pamięci i odpowiednie działanie przeciwnowotworowe w modelu mysim przeciwko ustalonym guzom czerniaka B16. Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół tego nowatorskiego systemu FTOC wykorzystującego system hodowli 3D (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-deoksyguanozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>312693-72-4</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (1,000x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor lizujący</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligand</td><td>R& D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>hgp100</td><td>Genscript</td><td>282077-1, KVPRNQDWL</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-2</td><td>R& D Systems</td><td>402-ML</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-7</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM w proszku</td><td>Gibco</td><td>61100061</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6145</td><td></td></tr><tr><td>Globalne peptydy</td><td>nukleoproteinowe</td><td>ASNENMETM</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik komórek macierzystych (SCF)</td><td>R& D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Stemfactor LIF, Mysz Rekombinowana</td><td>STEMGENT</td><td>03-0011-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Vessel i inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm talerz</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Strzykawka 12 ml</td><td>Covidien&nbsp; Monoject</td><td>22-652-090</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning/Coster</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>DUMONT</td><td>0108-5PO</td><td></td></tr><tr><td>Mata laboratoryjna do namaczania</td><td>Versi-Dry</td><td>Cat. EF2175CX 74018-00</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe ( 0,8 &mu; m, 47diam)&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>WHA7408004&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D Wisząca płytka kroplowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HDP1096</td><td></td></tr><tr><td>U Bottom 96 dołków</td><td>Corning/Coster</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Eksperymentalne linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3-iPSC</td><td>Vizcardo i wsp., Raport komórkowy 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEF-iPSC</td><td>Vizcardo i wsp., Raport komórkowy 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td><td></td></tr><tr><td>OP9/N-DLL1</td><td>Centrum zasobów biologicznych Riken</td><td>Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td><td></td></tr><tr><td>Pmel-iPSC</td><td>Vizcardo i wsp., Cell Report 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Eksperymentalne modele myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&nbsp;</td>Kod szczepu <td>Charles River</td><td>564; RRID:IMSR_CRL:564</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>NCI/Charles River</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Pmel-1</td><td>Overwijk i wsp.</td><td>J Exp Med 198(4):569-80</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-aTCR</td><td>Biolegend</td><td>109202; RRID:AB_313425</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD3</td><td>abcam</td><td>ab11089; RRID:AB_369097</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD4</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>553730; RRID:AB_395014</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>559250; RRID:AB_398661</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553775; RRID:AB_395043</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45.2</td><td>BD Biosciences</td><td>553772; RRID:AB_395041</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>560516; RRID:AB_1645257</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>552879; RRID:AB_394508</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>557959; RRID:AB_396959</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD8b</td><td>BD Biosciences</td><td>550798; RRID:AB_393887</td><td></td></tr><tr><td>Anty-H-2Kb</td><td>BD Biosciences</td><td>553570; RRID:AB_394928</td><td></td></tr><tr><td>Anty-IFN-g&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>557998; RRID:AB_396979</td><td></td></tr><tr><td>Anty-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554428; RRID:AB_395386</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TCRb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-5961-81; RRID:AB_469741</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TCRVb13</td><td>BD Biosciences</td><td>553204; RRID:AB_394706</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TNFa</td><td>BD Biosciences</td><td>557644; RRID:AB_396761</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Dziedziczenie wstępnie przegrupowanych receptorów limfocytów T (TCR) i ich epigenetyczne odmłodzenie sprawia, że indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są obiecującym źródłem dla adoptywnej terapii limfocytami T (ACT). Jednak klasyczne metody in vitro do wytwarzania zregenerowanych limfocytów T z iPSC prowadzą do powstania komórek T podobnych do wrodzonych lub terminalnie zróżnicowanych, które różnią się fenotypowo i funkcjonalnie od naiwnych limfocytów T. Niedawno opracowano nowatorski trójwymiarowy (3D) system hodowli grasicy w celu wygenerowania jednorodnego podzbioru limfocytów T specyficznych dla antygenu CD8αβ + z naiwnym fenotypem funkcjonalnym podobnym do limfocytów T, w tym zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza in vivo. Protokół ten pozwala uniknąć nieprawidłowych losów rozwojowych, umożliwiając wytwarzanie klinicznie istotnych limfocytów T pochodzących z iPSC, oznaczonych jako emigranci grasicy pochodzących z iPSC (iTE), zapewniając jednocześnie potężne narzędzie do wyjaśnienia kolejnych funkcji niezbędnych do dojrzewania limfocytów T po selekcji grasicy.

Współhodowane grasice płodowe poddano sekcjonowaniu, aby przeanalizować, czy komórki linii T pochodzące z iPSC mogą migrować do płatów grasicy. Kontrolne płaty bez zasiewu charakteryzowały się architekturą tkankową z siecią nabłonkową grasicy przypominającą astrocyty17, pozbawioną endogennych komórek CD3+. Z kolei płaty grasicy zasiane niedojrzałymi komórkami T pochodzącymi z iPSC zostały ponownie zasiedlone przez mononuklearne komórki CD3+, co wskazuje na migrację niedojrzałych komórek T pochodzących z iPSC do płatów (Rycina 2A).
Limfocyty T, które migrowały do mikrośrodowiska grasicy i w nim dojrzewały, następnie opuściły ją jako iTE. W celu zweryfikowania ich charakterystyki fenotypowej przeprowadzono analizę cytometryczną tymocytów myszy C57BL6, niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC Pmel (pozagrasiczych) oraz komórek, które opuściły płaty grasicy (iTE). Pozagrasicze limfocyty T na komórkach OP9/DLL1 wykazały obecność limfocytów T CD4+CD8+ (DP) oraz limfocytów T CD8αSP bez ekspresji markera selekcji pozytywnej MHC-I, podczas gdy iTE posiadały wyraźną populację o fenotypie limfocytów T CD8αSP MHC-I+, co wskazuje na ich pomyślne przejście przez selekcję pozytywną przed opuszczeniem płatów grasicy. iTE konsekwentnie wykazują ekspresję MHC-I i CD62L, które są markerami związanymi z wysoką zdolnością do proliferacji, produkcją cytokin, przeżywalnością obwodową oraz homingiem do tkanek limfatycznych18,19,20. Fenotyp ten jest zgodny z tymocytami M2 SP, które stanowią najbardziej dojrzałą populację limfocytów T pojedynczo pozytywnych w grasicy20, co sugeruje, że iTE przeszły przez prawidłowy program rozwojowy w grasicy (Rycina 3). Aby monitorować wydajność generowania iTE, wyizolowano komórki, które opuściły poszczególne płaty grasicy. W 7. dniu płaty grasicy generowały średnio 1 x 103 żywych iTE CD8SP CD45.1+ CD3+ na dobę (Rycina 3B). Podobne tempo produkcji iTE obserwuje się od 6. do 12. dnia 3D kokultury grasicy.
Analizowano zależną od antygenu aktywację i sekrecję cytokin, aby zaobserwować właściwości funkcjonalne niedojrzałych komórek T pochodzących z iPSC, które przeszły edukację w grasicy. W obecności nieistotnego peptydu (nukleoproteiny), komórki Pmel-iTE nie uwalniały znaczących ilości TNF-α, IL-2 ani IFN-γ. Po stymulacji peptydem swoistym dla komórek T Pmel (hgp100), komórki Pmel-iTE uwalniały znaczne ilości TNF-α i IL-2, produkując jednocześnie niewielkie ilości IFN-γ (Rysunek 4), co wskazuje, że komórki iTE poddane edukacji w grasicy potrafią rozpoznawać swój swoisty peptyd i wydzielać cytokiny efektorowe o profilu przypominającym naturalne niedawne emigranty grasicowe (RTE).
Aby zbadać różnice transkrypcyjne między komórkami linii T pochodzącymi z iPSC, zróżnicowanymi na OP9/DLL1 z edukacją grasiczą lub bez niej (tj. iTE versus pozagrasicze komórki T), przeprowadzono analizę RNA-seq tych dwóch populacji i porównano ją z wynikami dla komórek linii T DP zróżnicowanych przy użyciu OP9/DLL1 (DP) oraz pierwotnych naiwnych komórek T CD8+ Pmel. Przeanalizowano ekspresję 102 genów, które odgrywają kluczową rolę w ontogenezie limfocytów T, aktywacji tymocytów i tworzeniu pamięci immunologicznej15,20,21,22. Analiza głównych składowych tych czterech badanych populacji wykazała, że komórki T DP i CD8SP generowane pozagrasicznie grupowały się razem, podczas gdy iTE grupowały się bliżej naiwnych limfocytów T (Rysunek 5). Łącznie dane te wykazują, że iTE mają fenotyp bliższy naiwnym limfocytom T niż komórki linii T generowane metodami pozagrasicznymi.
<img alt="Schemat osi czasu różnicowania komórek macierzystych; proces przejścia od iPSC do hodowli grasiczkowej z użyciem komórek OP9/DLL1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd różnicowania iPSC do iTE z wykorzystaniem OP9/DLL1 i trójwymiarowej (3D) hodowli grasiczkowej. Protokół obejmuje trzy oddzielne etapy różnicowania; (lewo) od komórek iPSC do komórek linii krwiotwórczej na OP9/DLL1 (dzień 0 do 6), (środek) od komórek linii krwiotwórczej do niedojrzałych limfocytów T na OP9/DLL1 z dodatkiem cytokin (dzień 6 do 16–21) oraz (prawo) od niedojrzałych limfocytów T (dzień 16–21) do iTE z użyciem trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasiczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia grasicy, barwienie DAPI CD3; różnicowanie limfocytów T z iPSC; porównanie obrazowania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Immunohistochemia płatów grasicy zasianych niedojrzałymi limfocytami T pochodzącymi z iPSC. Góra: barwienie H&amp;E płata grasicy z zasianymi i bez zasianych niedojrzałymi limfocytami T pochodzącymi z iPSC. Od drugiej od góry w dół: obrazy konfokalne przekrojów płatów barwionych DAPI (jądro), CD3 (limfocyt T) oraz obraz scalony. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej tymocytów i limfocytów T; markery CD8, CD4, MHC-I; bramkowane wykresy kropkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: iTE wykazują fenotyp limfocytów T po przejściu przez grasicę. (A) Analizy FACS tymocytów, pozagrasiczych limfocytów T (system kokultury OP9/DLL1) oraz Pmel-iTE. Żywe komórki zostały bramkowane na kongeniczne CD45+. Populacje CD8 SP poddano dalszej analizie pod kątem ekspresji CD62L i MHC-I. (B) Średnia liczba CD8SP CD45.1 iTE wytworzonych w ciągu nocy na jeden płat grasicy 7 dni po wysianiu. Dane zebrały z 12 niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej; analiza cytokin nukleoproteiny; peptyd hgp100; wykresy TNFα, IL-2, IFNγ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Komórki iTE produkują różne cytokiny w wyniku stymulacji swoistej dla antygenu.Analizy FACS wewnątrzkomórkowej produkcji cytokin przez iTE. Komórki iTE współhodowano przez trzy dni z APC uprzednio obciążonymi peptydem nieistotnym (nukleoproteiną) lub pokrewnym (hgp100). Liczby przedstawione w prawych górnych kwadrantach wskazują procenty iTE produkujących cytokiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat różnicowania limfocytów T; metoda hodowli 3D; pokazuje proces przejścia komórek DP w naiwne limfocyty T na wykresie PCA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza całego transkryptomu ujawnia przesunięcie ekspresji genów iTE w stronę programu naiwnych limfocytów T CD8+. Analiza głównych składowych (PCA) danych RNA-seq z komórek DP, pozatymicznych CD8 SP, iTE oraz naiwnych limfocytów T. (Analiza 102 genów związanych z różnicowaniem grasiczym z wykorzystaniem publicznej bazy danych GSE105110)15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Pokolenie emigrantów grasicy pochodzących z iPSC za pomocą hodowli 3D narządów grasicy jest pierwszą metodą in vivo regenerującą jednorodną populację naiwnopodobnych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Główną zaletą jest to, że iTE są bardziej istotne fizjologicznie, a ta metoda jest silniejsza niż jakakolwiek inna metoda różnicowa in vivo do ciągłego wytwarzania określonych limfocytów T. iTE jest jednorodnym zaburzeniem specyficznych antygenowych limfocytów T CD8 alfa-beta z naiwnym fenotypem funkcjonalnym podobnym do limfocytów T, w tym zdolnością do proliferacji, remodyfikacji i supresji guza in vivo.Procedurę zademonstruje doktor Rafiqul Islam, doktor habilitowany w moim laboratorium. Aby rozpocząć hodowlę komórek OP9/DLL1 w pożywce OP9 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną 80 do 95 procent zbieżności, umyj je raz jednym PBS wolnym od magnezu, wapnia i czerwieni fenolowej.Dodaj cztery mililitry pięcioprocentowej trypsyny w punkcie zerowym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i odpipetuj w celu odłączenia warstwy komórek i uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.Wirować w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odessać ropienie i ponownie zawiesić komórki w 12 mililitrach pożywki OP9. Następnie umieść dwa mililitry zawiesiny komórek OP9 / DLL1 na nowej 10-centymetrowej szalce Petriego do hodowli komórkowej.Dodaj dodatkowe osiem mililitrów pożywki OP9. Powtarzaj ten fragment co dwa do trzech dni. W dniu zerowym należy zebrać indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w postaci zawiesiny pojedynczej komórki przez trypsynizację.Zebrać komórki i odwirować w temperaturze 300 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić IPC o gęstości 100 000 komórek na 10 mililitrów pożywki OP9. Następnie umieść 100 000 komórek na 10-centymetrowej naczyniu OP9/DLL1.Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Trzeciego dnia odessaj stare podłoże i zastąp je 10 mililitrami świeżego podłoża OP9. Szóstego dnia umyj każde 10-centymetrowe zlewiające się naczynie OP9 10 mililitrami PBS.Dodaj trzy mililitry pięcioprocentowej trypsyny punktu zerowego do każdego dania. I inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i delikatnie pipetuj, aby zebrać komórki.Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odwirować w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki różnicowej.Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Dziewiątego dnia odessaj stare podłoże i zastąp je 10 mililitrami świeżych pożywek różnicujących.Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. W 11 dniu, kiedy obserwuje się kardiomiocyty w koloniach iPSC, użyj pipety, aby mechanicznie odłączyć nieprzylegające komórki. Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odwirować w temperaturze 300 G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 24 mililitrach pożywki różnicowej. Umieść iPSC w zlewającej się sześciodołkowej płytce OP9/DLL1. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.W 15 dniu zbierz wszystkie nieprzylegające komórki i przefiltruj je przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Wirować w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Kontynuuj pasażowanie nieprzylegających komórek co trzy do czterech dni, jak opisano wcześniej.W siódmym dniu kuracji DGWO wyjmij cztery nowe 10-centymetrowe szalki. Napełnij każde naczynie 20 mililitrami kompletnego podłoża. Przenieś wszystkie membrany nitrocelulozowe z płatkami grasicy do jednego 10-centymetrowego naczynia.Za pomocą kleszczy odłącz poszczególne płaty od błony, umożliwiając ich zanurzenie w mediach. Inkubuj płaty przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś płaty grasicy do nowej 10-centymetrowej naczynia z kompletną pożywką.I inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten transfer i inkubację dodatkowo dwa razy. Za pomocą kleszczy przymocuj płaty grasicy do naczynia, drugą ręką wykonując nacięcie o głębokości od 100 do 200 mikrometrów w środku i przedłużając połowę średnicy płata, aby ułatwić migrację progenitorów limfocytów T do płata.Przenieś płaty grasicy do nowego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego kompletnymi pożywkami różnicującymi. Jeśli używasz płytek hodowlanych 3D z siatkami dolnego i górnego poziomu, wypełnij obie siatki sterylnym PPS, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu wiszących kropli. Następnie przenieś 30 mikrolitrów kompletnej pożywki zawierającej jeden płat grasicy poddany działaniu DGWO do każdego dołka płytki hodowlanej 3D.Zbierz nieprzylegające komórki linii T z kokultury OP9 / DLL1. I ponownie zawiesić komórki w gęstości od 2 000 do 5 000 komórek linii limfocytów T na 20 mikrolitrów pożywki. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek linii T do każdego płata grasicy na płytce hodowlanej 3D.Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Następnego dnia ustaw pipetę P200 na 30 mikrolitrów. Odpipetuj pożywkę w każdej studzience w górę iw dół kilka razy, aby usunąć wszystkie komórki otaczające płaty grasicy.Następnie odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 30 mikrolitrami kompletnego podłoża. Powtórz ten proces, pipetując, usuwając i wymieniając pożywkę pięć do siedmiu razy, aby usunąć wszelkie dodatkowe niedojrzałe limfocyty T, które nie migrują do płatów. Kontynuuj inkubację płatów, upewniając się, że codziennie zmieniasz od 25 do 30 mikrolitrów pożywki.W czwartym lub piątym dniu użyj mikroskopii świetlnej, aby potwierdzić tworzenie się aureoli emigrantów grasicy pochodzących z iPSC wokół płatów. Zbieraj iTE codziennie, pipetując media bez zakłóceń w kształcie listka. Zmieniaj nośniki codziennie i kontynuuj zbieranie do około 12 dni.Pobrane iTE są gotowe do użycia do analizy molekularnej lub eksperymentów transplantacyjnych in vivo. W tym badaniu współhodowane grzybice płodowe są dzielone na sekcje w celu przeanalizowania, czy komórki linii limfocytów T pochodzące z iPSC mogą migrować do płatów grasicy. Nieobsiane płaty kontrolne mają architekturę tkankową charakteryzującą się podobną do astrocytów siecią nabłonkową grasicy, rozmieszczoną przez endogenne komórki CD3-dodatnie.Jednak płaty grasicy wysiane niedojrzałymi limfocytami T pochodzącymi z iPSC są ponownie zasiedlane komórkami jednojądrzastymi CD3-dodatnimi, co wskazuje na migrację niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC do płatów. Limfocyty T, które migrują i dojrzewają w mikrośrodowisku grasicy, następnie wychodzą jako iTE. Analiza cytometrii przepływowej jest następnie wykorzystywana do zbadania charakterystyki fenotypowej różnych komórek.Dodatkowe limfocyty T grasicy wykazują podwójnie dodatnie limfocyty T CD4, CD8 i pojedyncze dodatnie limfocyty T CD8 alfa bez ekspresji markera selekcji pozytywnej, MHC klasy pierwszej, podczas gdy iTE są jednorodną populacją pojedynczego dodatniego fenotypu limfocytów T klasy pierwszej CD8 alfa, co wskazuje na ich pomyślne przejście przez selekcję pozytywną przed wyjściem z płata grasicy. iTE mają swoistość antygenową w stosunku do pokrewnego peptydu. iTE współhodowany z komórkami prezentującymi antygen Nieistotny peptyd jako nukleoproteina nie wykazuje się w komórkowej produkcji cytokin.Jednak komórki prezentujące antygen kohodowlany iTE, wstępnie pulsowane pokrewnym peptydem GP100, wytwarzają wewnątrzkomórkowo TNF alfa interleukinę ii i interferon gamma. Należy pamiętać, że hodowla komórkowa na linii otwartej jest silnie zależna od szczeliny ABS. Wygenerowany iTE może być wykorzystany w dowolnym innym teście pracującym z konwencjonalnymi limfocytami T.Na przykład test oczyszczania limfocytów T, test produkcji cytokin, próby regresji guza in vivo, badanie różnicowania komórek T i tak dalej. Technologia ta może być stosowana w wielu projektach immunologicznych lub podobnych. W tym różnicowanie limfocytów T, dojrzewanie limfocytów T w czasie impulsów oraz wytwarzanie komórek T specyficznych dla antygenu z progenitora hematokrytu lub komórki macierzystej.Po obejrzeniu tego filmu widz powinien zrozumieć, jak generować indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych, specyficznych dla antygenu nowotworowego za pomocą systemu hodowli narządów grasicy 3D.

a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Poznaj metodę generowania antygenowo specyficznych emigrantów grasicy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w trójwymiarowym systemie hodowli. Technika ta umożliwia uzyskanie homogennej populacji komórek T o fenotypie naiwnym, zdolnych do proliferacji i supresji nowotworów.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Przeglądaj więcej filmów