Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych dotyczące funkcjonalności i reakcji zapalnych indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona szczegółowy opis konfiguracji eksperymentalnej i analizy danych do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych. W celu powlekania chipa mikroprzepływowego umieść sterylny biochip na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów i za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów wstrzyknij 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego fibronektyny do każdego kanału biochipa.

Przykryj szalkę Petriego i umieść ją na noc w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka podgrzej biochip w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ponownie zawieś indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki śródbłonka pochodzące z komórek macierzystych pobranych z hodowli komórek zlewających się w 80 do 100% w pożądanym stężeniu w świeżym podłożu wolnym od surowicy komórek śródbłonka. Następnie odessaj roztwór fibronektyny ze wszystkich kanałów chipa mikroprzepływowego i dokładnie wymieszaj komórki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek, a następnie użyj końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby wstrzyknąć sześć mikrolitrów komórek do każdego kanału.

Zbadaj biochip pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki są równomiernie rozmieszczone z dużą gęstością komórek. Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj 40 mikrolitrów pożywki FULL bez surowicy komórek śródbłonka do zbiorników pożywki po obu stronach każdego kanału. I włóż biochip do inkubatora na godzinę.

Następnie dodaj kolejne 50 mikrolitrów pożywki FULL bez surowicy komórek śródbłonka do zbiorników po obu stronach każdego kanału. W przypadku obrazowania na żywo zasianych komórek upewnij się, że zestawy mikroprzepływowe są gotowe, że komora obrazowania na żywo jest zrównoważona do 37 stopni Celsjusza i że poziom CO2 osiągnął 5%Umieść biochip w uchwycie chipa mikroskopu i zamontuj uchwyt chipa na stoliku do obrazowania mikroskopu. Aby podłączyć biochip do pompy za pośrednictwem kolektora, należy umieścić ośmiopinowy adapter w pobliżu zbiorników wylotowych chipa i pogłębić wszystkie piny w medium bez całkowitego łączenia pinów.

W oprogramowaniu pompy mikroprzepływowej wybierz opcję Washout/Connect to chip (Wymywanie/Podłącz do chipa) i kliknij przycisk Uruchom krok testowania, aby dozować 30 mikrolitrów pożywki RPMI przez każdy pin. Następnie włóż ośmiopinowy adapter do gniazda biochipa. Użyj pipety, aby ręcznie zassać pożywkę ze wszystkich zbiorników wlotowych biochipa, a następnie wybierz Washout/Chip Washout i Run Assay Step, aby perfować jeden kanał na raz za pomocą 40 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy komórek śródbłonka Pełna, aby usunąć wszelkie martwe komórki i zanieczyszczenia.

Gdy wszystkie kanały zostaną przepłukane, zastąp pożywkę ze zbiornika wlotowego kanału będącego przedmiotem zainteresowania 100 mikrolitrami ludzkich leukocytów rozcieńczonych do 2,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr stężenia w pożywce RPMI. Kliknij opcję Cell Assay/Step description (Opis próby) i Set Current Channel/Step description (Bieżący kanał/krok description), a następnie ustaw interesujący nas kanał na On (Wł.), a pozostałe siedem kanałów (Off Off). Wybierz opcję Cell Assay Step description (Opis kroku testu komórkowego) i kliknij przycisk Run Assay Step (Uruchom krok testu).

Zastąp pozostałe leukocyty w zbiorniku wlotowym 100 mikrolitrami kompletnej pożywki RPMI. I kliknij Opis kroku testu komórkowego i Uruchom krok testu, aby perfuzjować kanał przez pięć minut pożywką RPMI w celu usunięcia wszelkich nieprzylegających leukocytów. Następnie uzyskaj obrazy z co najmniej trzech do czterech różnych pozycji w kanale, aby uwidocznić przylegające leukocyty.

Aby określić ilościowo przylegające leukocyty, otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów CellProfiler i zaimportuj plik Count Leukocytes Pipeline. W obszarze Moduły wejściowe wybierz Obrazy i przeciągnij i upuść folder z surowymi obrazami przylegających leukocytów do okna Lista plików. W obszarze Moduły analizy wybierz opcję Zidentyfikuj obiekty podstawowe i wskaż minimalne i maksymalne średnice przylegających leukocytów w pikselach.

W obszarze Moduły analizy wybierz pozycję FilterObjects. Następnie wybierz kryteria filtrowania i wprowadź minimalnie akceptowany obszar obiektów w pikselach i kliknij przycisk Analizuj obrazy, aby rozpocząć analizę. Optymalna indopodobna indocja komórek śródbłonka pochodząca z pluripotencjalnych komórek macierzystych powinna skutkować zawiesiną pojedynczej komórki wolną od grudek komórkowych.

Zazwyczaj 15 minut po wstrzyknięciu komórki śródbłonka przyczepiają się do dna kanału i zaczynają się rozprzestrzeniać. W ciągu godziny od wstrzyknięcia komórki śródbłonka powinny utworzyć dobrze rozłożoną monowarstwę w kanale, po czym są gotowe do użycia w teście przepływowym. Korzystanie z bezpłatnego oprogramowania do przetwarzania obrazów typu open source, jak pokazano, umożliwia filtrowanie zidentyfikowanych obiektów na podstawie minimalnego obszaru i wykluczanie błędnie zidentyfikowanych obiektów, takich jak szczątki komórek, autofluorescencja lub dowolny inny niespecyficzny sygnał fluorescencyjny.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o optymalizacji stymulacji cytokinami prozapalnymi oraz o włączeniu pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej jako kontroli pozytywnej. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi komórkami ssaków i liniami komórkowymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawic i ochrony oczu.