Name: Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę oceny funkcji mięśni zginaczy grzbietowych u myszy, umożliwiającą powtarzalne pomiary w czasie. Technika ta pozwala śledzić przebieg chorób neuromięśniowych i oceniać skuteczność terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie z tego projektu pochodziło ze Szkoły Ćwiczeń i Nauk o Żywieniu, Uniwersytetu Deakin. Autorzy pragną podziękować Panu Andrew Howarthowi za jego obszerną pracę nad optymalizacją urządzenia elektrodowego.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Deakin (Projekt #G19/2014).
1. Ustawienia sprzętu
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie maszyny są prawidłowo podłączone.</li>
	<li>Włącz komputer, dwufazowy stymulator o dużej mocy i system dźwigni w dwóch trybach.</li>
	<li>Ustaw zacisk kolanowy myszy na platformie, a także stopkę myszy na przetworniku.</li>
	<li>Włączyć platformę grzewczą do 37 °C.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni na pulpicie. 
	nuta: Jest to oprogramowanie potrzebne do przeprowadzenia testów funkcjonalnych.</li>
</ol>
2. Ustawienia oprogramowania i modelu
<ol>
	<li>Po otwarciu programu (Rysunek 1), skalibruj przetwornik i wybierz Setup | Moje instrumenty | Kalibracja.</li>
	<li>Na przycisku "Setup" wybierz InstantStim i zmień parametry "Run Time" na 120 s (Figure 1A). 
	nuta: Optymalne napięcie można również osiągnąć, wykonując pojedyncze drgania, ręcznie ustawiając lub uruchamiając InstantStim tyle razy, ile potrzeba.</li>
	<li>W oknie z możliwością pisania oznaczonym "Autosave Base" wprowadź nazwę lokalizacji pliku automatycznego zapisu (np. mouse1-date-timepoint1). Kliknij pole wyboru po lewej stronie okna "Baza autozapisu" i zmień je na Włącz autozapis.</li>
	<li>W górnej części ekranu sterowania DMC przejdź do Sekwencera, który otworzy nowe wyskakujące okienko. Wybierz opcję Otwórz sekwencję i wybierz gotowy protokół, który ma być używany (Rysunek 1B). Kliknij opcję Załaduj sekwencję | Zamknij okno Window. 
	nuta: Ten etap służy do wygenerowania testu krzywej siły i częstotliwości (FFC) (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).</li>
	<li>Ustaw pokrętło "RANGE" na 10 mA na stymulatorze dwufazowym. 
	nuta: Upewnij się, że pokrętło "ADJUST" (po prawej stronie u dołu) jest ustawione na zero. Ta precyzyjna regulacja umożliwia ustawienie elektrod.</li>
</ol>
3. Ustawienia myszy
UWAGA: Wszystkie pomiary siły zostały przeprowadzone na samcach myszy typu dzikiego (C57BI/6) w wieku 12 tygodni.
<ol>
	<li>Umieść każdą mysz w komorze anestezjologicznej o natężeniu przepływu tlenu 1 l/min z 5% izofluranem (poprzez inhalację z nosa), aż mysz straci przytomność. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez utratę odruchu stopy.</li>
	<li>Usuń wszystkie włosy z prawej nogi myszy, goląc się elektrycznymi maszynkami do strzyżenia włosów.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na podgrzewanej platformie i wyczyść prawą nogę (można użyć dowolnej strony) 70% alkoholem i jodem. W tym momencie należy wyregulować izofluran do 2% (przy przepływie tlenu na poziomie 1 l/min) i nałożyć żel przewodzący na skórę, na której zostaną umieszczone elektrody. 
	nuta: Użyj sondy temperatury doodbytniczej, aby monitorować temperaturę ciała podczas zabiegu i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu i/lub uszkodzeniu oka.</li>
	<li>Umieść stopę na podnóżku i przymocuj za pomocą taśmy medycznej. Zacisnąć kolano, aby ustabilizować i unieruchomić nogę podczas zabiegu. 
	nuta: Niektóre badania opisywały użycie bardzo cienkiej szpilki wprowadzanej przez bliższą kość piszczelową (tylną w stosunku do mięśni zginaczy grzbietowych)12 w celu zapewnienia stabilizacji. W tym protokole zdecydowano się na zacisk, ponieważ zapewnia on wystarczającą stabilizację bez zbędnej kompresji/uszkodzenia kolana. Zacisk pozwala również uniknąć potencjalnego stanu zapalnego, który może wywołać szpilka transkostna, jednocześnie umożliwiając dokładną ocenę kurczliwości mięśni. Ponadto z powodzeniem zastosowano zacisk kolanowy myszy14.</li>
	<li>W tym momencie użyj pokręteł na platformie, aby ustawić tylną kończynę myszy tak, aby kostka była pod kątem 90° (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Optymalizacja położenia elektrod
<ol>
	<li>Po umieszczeniu myszy na platformie umieść elektrody pod skórą (podskórnie) w prawej nodze. 
	nuta: Jest to kluczowy krok i może być konieczna pewna zmiana położenia, aby uzyskać żądaną pozycję podczas konfiguracji w kroku 4.4.</li>
	<li>Umieść elektrody po bocznej stronie prawej nogi; umieść jedną elektrodę w pobliżu głowy kości strzałkowej, a drugą elektrodę bardziej dystalnie po bocznej stronie nogi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	nuta: Wykonany na zamówienie system elektrod został zaprojektowany w celu optymalizacji tego etapu. Jednak test ten można wykonać za pomocą igieł elektrod dostarczonych przez producenta w tym systemie.</li>
	<li>Po wykonaniu tych kroków, na stymulatorze dwufazowym o dużej mocy wyreguluj pokrętło oznaczone "ADJUST" zgodnie z potrzebami, aby uzyskać stymulację nerwu strzałkowego, która skutkuje maksymalnym momentem zgięcia grzbietowego. 
	nuta: W przypadku dorosłych myszy typu dzikiego zakres ten jest mniejszy niż 2 mA; Może to jednak zależeć od wielkości, wieku i płci zwierzęcia. Wytwarzanie siły (szczyty krzywych) należy zwiększać powoli, aż do osiągnięcia maksymalnej siły.</li>
	<li>Podczas stymulacji obróć przetwornik zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać wartości ujemne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3), które są ważne, aby upewnić się, że elektrody stymulują tylko mięśnie zginaczy grzbietowych przez nerw strzałkowy. Po wykonaniu tego kroku należy ustabilizować elektrody za pomocą zacisku, zapobiegając wszelkim ruchom podczas zabiegu. 
	nuta: Szczyty będą powoli zwiększać swoją wielkość, a maksymalne natężenie prądu określa się jako poziom, przy którym trzy lub więcej kolejnych stymulacji powoduje identyczną kurczliwość. Oprzyj się obracaniu natężenia prądu wyżej niż to konieczne; Maksymalne natężenie prądu pobudzi sąsiednie i potencjalnie antagonistyczne mięśnie do skurczu, powodując współskurcz, który może generować szczyty wartości dodatnich.</li>
	<li>Zatrzymaj Instant Stim w oprogramowaniu.</li>
	<li>Na ekranie głównym włącz przycisk oznaczony "Rozpocznij sekwencję", aby rozpocząć poprzednią sekwencję konfiguracji (zgodnie z opisem w kroku 2.4).</li>
</ol>
5. Zakończenie procedury
<ol>
	<li>Po zakończeniu pomiarów siły wyjmij elektrody, zwolnij zacisk kolanowy i usuń taśmę na stopę.</li>
	<li>Wyłącz izofluran i utrzymuj dopływ tlenu przez kilka minut, wspomagając powrót zwierzęcia do zdrowia. Gdy mysz zacznie się poruszać i/lub odzyska przytomność i będzie w stanie samodzielnie się wyprostować, przywróć mysz do klatki. 
	nuta: Niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) może być wstrzykiwany podskórnie (1 mg/kg meloksykamu), aby zapobiec dyskomfortowi i/lub bolesności po zabiegu.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Wysoka przepływność (w lewym górnym rogu ekranu). Wybierz opcję Wymuś częstotliwość, aby przeanalizować opisaną powyżej sekwencję ustawień.</li>
	<li>Wybierz opcję Manual (Ręcznie) i zmień wartość "End Cursor" (Koniec kursora) na 3. Wybierz również opcję Usuń linię bazową.</li>
	<li>Kliknij Wybierz pliki, aby uzyskać dostęp do poprzednio wykonanej procedury, a następnie kliknij przycisk Analizuj. W tym momencie wynik można uzyskać do wglądu na ekranie lub wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i/lub obliczeń. 
	nuta: Dane zostały zmierzone w mN; Moment obrotowy można jednak obliczyć, mnożąc wartość siły przez długość ramienia dźwigni (siła bezwzględna). Jeśli wymagana jest normalizacja (siła właściwa), moment obrotowy można znormalizować do masy ciała lub przeprowadzić eksperymenty końcowe w celu zebrania masy mięśniowej dopasowanej do wieku.</li>
</ol>

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+beta-hydroxy-beta-methylbutyrate+%28HMB%29+on+the+expression+of+ubiquitin+ligases%2C+protein+synthesis+pathways+and+contractile+function+in+extensor+digitorum+longus+%28EDL%29+of+fed+and+fasting+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats.</a> The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).</li>
<li>Pinheiro, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+effects+of+beta-hydroxy-beta-methylbutyrate+%28HMB%29+supplementation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle.</a> European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).</li>
<li>Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+strength+as+a+predictor+of+all-cause+mortality+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).</li>
<li>Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+regulation+of+MAFbx%2Fatrogin-1+and+MuRF1+in+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).</li>
<li>Zacharewicz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+linked+to+regulators+of+muscle+protein+synthesis+and+regeneration+in+young+and+old+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle.</a> PLoS One. 9 (12), e114009(2014).</li>
<li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+oxidative+stress+by+resveratrol+after+isometric+contractions+in+gastrocnemius+muscles+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).</li>
<li>Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Assessment+of+Muscle+Contractility+in+Animal+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).</li>
<li>Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+In+Vivo+Functional+Testing+of+the+Rat+Tibialis+Anterior+for+Evaluating+Tissue+Engineered+Skeletal+Muscle+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).</li>
<li>Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+muscle+function+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+ex+vivo+and+tibialis+anterior+muscle+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50183(2013).</li>
<li>Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+and+eccentric+force+generation+assessment+of+skeletal+muscles+isolated+from+murine+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies.</a> Journal of Visualized Experiments. 71, e50036(2013).</li>
<li>Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+rodent+model+of+contraction-induced+injury+and+non-invasive+monitoring+of+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e50036(2011).</li>
<li>Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+in+vitro+tissue+engineered+muscle+repair+constructs+and+bladder+acellular+matrices+partially+restore+in+vivo+skeletal+muscle+function+in+a+rat+model+of+volumetric+muscle+loss+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).</li>
<li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+estrogen+receptor+alpha+in+skeletal+muscle+results+in+impaired+contractility+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Vitzel, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Electrical+Stimulation+for+the+Assessment+of+Skeletal+Muscle+Contractile+Function+in+Murine+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).</li>
<li>Jackman, R. W., Kandarian, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of skeletal muscle atrophy.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar maksymalnej funkcji kurczliwości mięśni w dokładny i powtarzalny sposób ma kluczowe znaczenie dla postępowej oceny warunków genetycznych, metabolicznych i mięśniowych17. Podobnie, funkcja kurczliwości mięśni in vivo pozwala na ocenę nowych metod leczenia i terapii wyniszczających schorzeń mięśni. Pokazujemy tutaj pomiar siły wytwarzanej przez mięśnie zginaczy grzbietowych dolnej kończyny tylnej myszy za pomocą procedury in vivo.
Komercyjne aparaty są wydajne i pomocne w wykonywaniu tego nieinwazyjnego zabiegu. Test ten zapewnia ważne korzyści związane z oceną funkcji skurczu mięśni przy jednoczesnym zachowaniu rodzimego środowiska fizjologicznego, w którym dopływ krwi i unerwienie pozostają nienaruszone. Z drugiej strony jego wady są związane z normalizacją siły na jednostkę pola przekroju poprzecznego mięśnia (siły właściwej), którą można ustalić tylko w izolowanym mięśniu, który jest zbierany po eksperymentach. Jednak test nieinwazyjny pozwala na wielokrotne pomiary funkcji skurczu mięśni zginaczy u tego samego zwierzęcia w czasie, co skutkuje zmniejszeniem liczby zwierząt doświadczalnych, zwłaszcza jeśli celem jest ocena zmian względnych (zmian siły bezwzględnej w czasie).
Istnieją ważne kroki, które należy wziąć pod uwagę podczas tej procedury, aby uzyskać spójne dane w punktach czasowych. Po pierwsze, należy starać się ujednolicić rozmieszczenie zwierząt, gdy tylko jest to możliwe. Po drugie, podczas ustawiania ważne jest, aby być konsekwentnym w ustawianiu elektrod, aby można było osiągnąć optymalną stymulację poprzez stymulację nerwu strzałkowego. Elektrody powinny znajdować się po bocznej stronie (w tym przypadku prawej) nogi, blisko głowy kości strzałkowej i inne dalej po bocznej stronie nogi (ryc. 2). Na tej podstawie elektrody wykonane na zamówienie są zaprojektowane w taki sposób, że obie można za każdym razem umieścić w tej samej pozycji. Jednak wystarczającą stymulację można również osiągnąć za pomocą igieł elektrod dostarczonych z dostępnymi w sprzedaży urządzeniami. Po trzecie, ważne jest, aby osiągnąć ujemne piki podczas ustawiania napięcia poprzez obrócenie zgodnie z ruchem wskazówek zegara przetwornika podłączonego do podstawy. Prawidłowe ustawienie elektrod nóg myszy przy ustawieniu maksymalnego napięcia okazało się techniką, którą można wykonać na tej samej myszy w miarę upływu czasu.
Zdolność do oceny i śledzenia funkcji mięśni w różnych punktach czasowych u tego samego zwierzęcia jest ważną oceną charakteryzującą różne choroby mięśni, a także ich postęp. Co więcej, ten pomiar zgięcia grzbietowego mięśni u myszy może być narzędziem do oceny skuteczności potencjalnych terapii w natywnym środowisku fizjologicznym, przy minimalnym stresie metabolicznym12. W ten sposób zapewnia technikę oceny choroby mięśni, jej progresji i potencjalnego leczenia.

Mięśnie szkieletowe to ważna tkanka metaboliczna, która stanowi około 40% całkowitej masy ciała. Odgrywa kluczową rolę w kontroli metabolizmu energetycznego i homeostazy1. Masa mięśni szkieletowych jest utrzymywana przez delikatną równowagę między szybkością syntezy i degradacji białek1. Liczne stany chorobowe wpływają na te procesy w mięśniach szkieletowych, prowadząc do utraty masy mięśniowej netto (atrofii). Należą do nich między innymi rak, AIDS, starzenie się, post i unieruchomienie kończyn2,3. W starzejącej się populacji utrata siły wiąże się z utratą masy mięśniowej i jest predyktorem śmiertelności we wszystkich przypadkach4. W tym kontekście ocena funkcji mięśni stanowi ważną miarę przy określaniu skuteczności strategii terapeutycznych mających na celu zwalczanie i/lub zapobieganie zanikowi mięśni szkieletowych i utracie funkcji.
Badacze wykorzystali wiele różnych podejść i modeli zwierzęcych, aby zrozumieć molekularne szlaki zaniku mięśni5,6 oraz implikacje tych mechanizmów dla funkcji kurczliwości mięśni2,3,7. Dlatego korelacja zmian na poziomie molekularnym z różnicami w funkcjonowaniu mięśni jest niezbędna do zrozumienia, w jaki sposób zmiany na poziomie molekularnym mogą wpływać na funkcjonalność mięśni.
Funkcja mięśni szkieletowych, szczególnie u małych gryzoni, jest zazwyczaj wykonywana za pomocą trzech dobrze opisanych procedur8,9 do wykrywania upośledzonej produkcji siły i/lub monitorowania postępu choroby. 1) ex vivo; gdzie mięśnie są usuwane ze zwierzęcia i inkubowane w roztworze kąpieli Ringera w celu oceny funkcji mięśni za pomocą stymulacji pola10. (2) In situ; gdzie proksymalne przyczepienie mięśnia pozostaje w zwierzęciu, a dystalne ścięgno jest połączone z przetwornikiem siły, co pozwala na realizację funkcji mięśni poprzez bezpośrednią stymulację nerwów11. (3) In vivo; gdzie elektrody są umieszczane podskórnie w celu uzyskania wywołanej przez nerwy siły mięśniowej9,12. Chociaż te trzy procedury są wykorzystywane do różnych celów, każda z nich ma zalety i wady. Dlatego ważne jest, aby dobrać odpowiednią metodę w oparciu o cel badania. Głównym ograniczeniem w eksperymentach ex vivo jest usunięcie mięśni z ich normalnego środowiska i zastosowanie stymulacji polowej. Metoda in situ utrzymuje normalny dopływ krwi i wykorzystuje stymulację przez nerw, ale normalna anatomia jest zmieniona, a charakter eksperymentu jest nieuleczalny; W związku z tym uniemożliwia to dalsze pomiary funkcji mięśni. Opisana tutaj metoda in vivo najściślej naśladuje normalną fizjologię, w której anatomia jest niezakłócona, pęczek nerwowo-mięśniowy pozostaje nienaruszony, a eksperyment nie jest terminalny, co pozwala na dalsze działania w obrębie tego samego zwierzęcia w czasie8.
Tutaj opisujemy procedurę in vivo, która pozwala na wielokrotne pomiary funkcji mięśni u tego samego zwierzęcia w czasie. Procedura ta polega na ocenie mięśni przedniego przedziału podudzia - w tym mięśni piszczelowych przednich (TA), prostowników długich palców (EDL) i prostowników palców długich (EHL), odpowiedzialnych za zgięcie grzbietowe - w nieinwazyjnej procedurze poprzez stymulację nerwu strzałkowego (znanego również jako strzałkowy). TA zapewnia większość siły potrzebnej do zgięcia grzbietowego kostki13, przy minimalnym udziale EDL i EHL, które kontrolują ruch palców. Ten nieterminalny protokół zapewnia zachowanie dopływu nerwów i krwi. Pozwala to na badanie ewolucji choroby i skuteczności leczenia w czasie w najbardziej fizjologicznym środowisku dostępnym obecnie w modelu zwierzęcym.

<table><tbody><tr><td>1300A: System 3 w 1 dla całych zwierząt &ndash; Mysz</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>305C-LR: Dwutrybowa płyta podnóżka; 605A: System dynamicznej akwizycji i analizy danych mięśniowych; 701C: Stymulator elektryczny i 809C:&nbsp; na miejscu&nbsp; Aparat mysi</td><td>Kompletny system funkcji mięśni&nbsp;</td></tr><tr><td>Żel przewodzący&nbsp;</td><td>Livingstone</td><td>ECGEL250</td><td>żel przewodzący stosowany u myszy</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Alcon</td><td>Poly Visc</td><td>produkt farmaceutyczny (do stosowania okulistycznego)</td></tr><tr><td>niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ)&nbsp;</td>Lek weterynaryjny <td>Ilium</td><td>Metacam</td><td>(do wstrzykiwań 5mg/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp;</td><td>Zoetis</td><td>Isoflo</td><td>inhalacja weterynaryjna Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Ocena funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych jest ważnym pomiarem zarówno dla celów klinicznych, jak i badawczych. Wiele schorzeń może negatywnie wpływać na mięśnie szkieletowe. Może to spowodować utratę masy mięśniowej (atrofię) i/lub utratę jakości mięśni (zmniejszona siła na jednostkę masy mięśniowej), które są powszechne w chorobach przewlekłych, chorobach specyficznych dla mięśni, unieruchomieniu i starzeniu się (sarkopenia). Funkcję mięśni szkieletowych u zwierząt można ocenić za pomocą szeregu różnych testów. Wszystkie testy mają ograniczenia związane z fizjologicznym środowiskiem testowym, a wybór konkretnego testu często zależy od charakteru eksperymentów. W tym miejscu opisujemy nieinwazyjną technikę in vivo, polegającą na pomocnej i łatwej ocenie krzywej częstotliwości siły (FFC) u myszy, którą można przeprowadzić na tym samym zwierzęciu w czasie. Pozwala to na monitorowanie postępu choroby i/lub skuteczności potencjalnego leczenia terapeutycznego.

Krzywa siła-częstotliwość jest użytecznym testem, w którym mięśnie można stymulować częstotliwościami niskimi i wysokimi, aby odróżnić suboptymalne i optymalne odpowiedzi siłowe15. Stymulacja niskimi częstotliwościami może wywołać pojedyncze skurcze, aktywując mniej i mniejsze jednostki motoryczne, natomiast przy wysokich częstotliwościach osiągany jest stabilny szczyt, w którym izolowane skurcze ulegają zlewaniu (tężec), osiągając maksymalną siłę poprzez aktywację wszystkich jednostek motorycznych16. W przedstawionym teście krzywa tężcowa rozpoczyna się przy ~60 Hz, gdzie można zaobserwować potencjację (Rysunek 4A), a siła maksymalna zostaje określona przy ~150 Hz (Rysunek 4B), gdy osiągnięty zostaje plateau z całkowicie zlaną krzywą9,16.
Wszelkie odchylenia od tych wyników mogą wskazywać, że mięśnie nie są odpowiednio stymulowane przez elektrody. Rozmieszczenie elektrod jest kluczowym etapem przygotowania tej procedury, ponieważ stymulacja elektryczna musi być prawidłowo zlokalizowana, aby unerwić nerw strzałkowy i tym samym w pełni aktywować zaopatrywane przez niego mięśnie zginacze grzbietowe (TA, EDL i EHL). Prawidłowe rozmieszczenie elektrod skutkuje generowaniem ujemnych pików (Rysunek 3>) podczas tego procesu, natomiast niewłaściwe ustawienie elektrod lub zastosowanie wyższego natężenia prądu może prowadzić do stymulacji okolicznych mięśni, powodując współskurcz mięśni sąsiadujących i antagonistycznych, co z kolei generuje piki o wartościach dodatnich.
Rysunek 5A przedstawia reprezentatywne dane krzywej siła-częstotliwość u myszy w czasie, gdzie procedurę powtarzano raz w tygodniu aż do uzyskania 5 punktów czasowych. Obserwacje te wykazały spójne wartości generowanej siły we wszystkich punktach czasowych i/lub dokonanych pomiarach. Procedura ta okazała się również spójna w pomiarach między różnymi myszami, co obrazuje Rysunek 5B, przedstawiający reprezentatywny obszar pod krzywą FFC stymulowanej podczas 5 różnych obserwacji u 6 myszy badanych raz w tygodniu.
<img alt="Pomiar wzbudzenia optycznego; interfejs oprogramowania spektroskopowego; schemat konfiguracji danych; analiza przejściowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58696/58696fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: System oprogramowania. (A) Ilustracja oprogramowania sterującego przedstawiająca kroki konfiguracji parametrów „Instant Stim”. Na zdjęciu w tle należy kliknąć Setup | Instant Stim. W małym wyskakującym oknie (zdjęcie z przodu) należy ustawić parametry. (B) Ilustracja widoku konfiguracji „Sequencer”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58696/58696fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie eksperymentu neuronaukowego do badania mózgu szczura z wykorzystaniem sprzętu optycznego do transmisji sygnałów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58696/58696fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ustawienie myszy. Przegląd pozycji znieczulonego zwierzęcia. Prawy zacisk kolanowy jest umieszczony tak, aby kolano znajdowało się pod kątem 90° oraz aby stopa i kostka tworzyły kąty 90° (biała przerywana linia). Skurcz mięśni zginaczy grzbietowych uzyskuje się poprzez stymulację nerwu strzałkowego, który znajduje się tuż pod (dystalnie od) głową kości strzałkowej. Stosujemy elektrody wykonane na zamówienie (wstawka); jednak elektrody igłowe dołączone do urządzenia lub zakupione oddzielnie są również wystarczające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58696/58696fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres pomiaru siły, przedstawiający fluktuacje i piki; dane do analizy naprężeń mechanicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58696/58696fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wynik rozmieszczenia elektrod. Po umieszczeniu elektrod pod skórą i zainicjowaniu napięcia obserwuje się piki o wartościach ujemnych. W tym momencie osiągnięcie wartości ujemnych (zielone linie) jest kluczowym krokiem w celu upewnienia się, że stymulacja odbywa się wyłącznie w mięśniach zginaczach grzbietowych (TA, EDL i EHL). Pomiar w czasie rzeczywistym jest wskazany pomiędzy dwiema czerwonymi liniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58696/58696fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres widm absorpcji przejściowej porównujący sygnał oscylacyjny (A) i stabilny (B) w badaniu fotonicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58696/58696fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne krzywe. (A) Przykład krzywej siły przy 60 Hz (mysz #06). (B) Przykład krzywej tężcowej przy 150 Hz (mysz #03). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58696/58696fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres i wykres słupkowy regeneracji funkcji motorycznych; regeneracja nerwu w ciągu 5 tygodni; siła mięśniowa (mN) w funkcji Hz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58696/58696fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywna krzywa zależności siły od częstotliwości (FFC) oraz dane dotyczące pola pod krzywą. (A) FFC (oś x) w 5 różnych punktach czasowych (tygodnie 1, 2, 3, 4 i 5) u przykładowej myszy (#05). (B) Pole pod krzywą (AU, oś y) FFC w 5 różnych punktach czasowych (odpowiednio myszy nr 01, 02, 03, 04, 05 i 06; oś x). Wyniki przedstawiono jako średnia ± standardowy błąd pomiaru (SEM) dla pięciu punktów czasowych (testów) u 6 myszy; analizę przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58696/58696fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Model ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie funkcji skurczu mięśni. Takich jak mechanizm wytwarzania siły, podczas progresji choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura ta jest nieinwazyjna, którą można wykonać na tym samym zwierzęciu w różnych punktach czasowych, w celu monitorowania postępu choroby i leczenia.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ zmiana któregokolwiek z tych kroków może prowadzić do zwiększenia zmienności wyników. Dlatego praktyka może pozwolić Ci uzyskać bardziej spójne wyniki. Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw zacisk kolanowy myszy na platformie, a także stopkę myszy na przetworniku.Następnie włącz platformę grzewczą do 37 stopni Celsjusza. Otwórz oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni na pulpicie. Z listy rozwijanej konfiguracji wybierz pozycję Trzpień natychmiastowy i zmień parametry czasu pracy na 120 sekund.W oknie oznaczonym baza autozapisu wprowadź nazwę lokalizacji pliku autozapisu. Kliknij pole wyboru po lewej stronie okna bazy automatycznego zapisywania i zmień je, aby włączyć automatyczne zapisywanie. W górnej części ekranu sterowania DMC kliknij sekwencer, co spowoduje otwarcie nowego wyskakującego okienka.Wybierz otwartą sekwencję i wybierz protokół, który ma być używany. Następnie kliknij załaduj sekwencję i zamknij okno. Aby przygotować zwierzę do eksperymentu, usuń włosy z prawej nogi myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów.Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na podgrzewanej platformie i wyczyść prawą nogę 70% alkoholem i jodem. W tym momencie dostosuj izofluran do 2% z przepływem tlenu na poziomie jednego litra na minutę. Umieść stopę na podnóżku i zabezpiecz ją taśmą medyczną.Następnie nałóż żel przewodzący na skórę, na którą zostaną umieszczone elektrody. Następnie zaciśnij kolano, aby ustabilizować nogę podczas zabiegu. Użyj pokręteł na platformie, aby ustawić tylną kończynę tak, aby utworzyć kąt 90 stopni w kostce.Gdy mysz zostanie zamocowana na platformie, umieść elektrody pod skórą prawej nogi, jedną w pobliżu głowy kości strzałkowej, a drugą elektrodę bardziej dystalnie po bocznej stronie nogi. Elektrody są ustawione ostrożnie, aby uzyskać wystarczającą stymulację nerwu strzałkowego. Również tę pozycję można dostosować, aby osiągnąć stabilny szczyt, wizualizowany na ekranie.Po wykonaniu tych kroków wyreguluj dwufazowy stymulator o dużej mocy, aby uzyskać stymulację nerwu strzałkowego, która skutkuje maksymalnym momentem zgięcia grzbietowego. Podczas stymulacji obróć przetwornik zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać wartości ujemne, które są ważne, aby upewnić się, że elektrody stymulują tylko mięśnie zginaczy grzbietu przez nerw strzałkowy. Po wykonaniu tego kroku należy ustabilizować elektrody za pomocą zacisku, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas zabiegu.Osiąganie ujemnego piku powoli i stopniowo jest ważne, aby sprawdzić, czy elektrody są umieszczone we właściwej pozycji, a napięcie jest wystarczające do osiągnięcia maksymalnej siły. Następnie zatrzymaj natychmiastowy trzpień w oprogramowaniu. Na ekranie głównym włącz przycisk oznaczony sekwencją startową", aby rozpocząć poprzednią sekwencję konfiguracji.Po zakończeniu pomiarów siły wyjmij elektrody, usuń taśmę na stopę i zwolnij zacisk kolanowy. Wyłącz izofluran i utrzymuj dopływ tlenu przez kilka minut, aby wspomóc powrót zwierzęcia do zdrowia. Gdy mysz zacznie się poruszać i odzyska przytomność, załóż ją z powrotem do klatki.Ten wykres przedstawia reprezentatywne dane krzywej częstotliwości siły z myszy w czasie, gdzie procedura była powtarzana raz w tygodniu, aż do zakończenia pięciu punktów czasowych. Obserwacje te wykazały stałe wartości wytwarzania siły we wszystkich punktach czasowych. Procedura ta wykazała również, że jest spójna między różnymi myszami, jak wskazano w reprezentatywnym obszarze, pod krzywą stymulacji FFC, w ciągu pięciu różnych obserwacji u sześciu myszy testowanych raz w tygodniu.Po opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom zajmującym się chorobami nerwowo-mięśniowymi badać czasowe zmiany w funkcjonowaniu mięśni w lustrzanych modelach choroby.

non-invasive-assessment-of-dorsiflexor-muscle-function-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano model zwierzęcy urazu in vivo. Metoda wykorzystuje podskórne położenie nerwu strzałkowego. Prędkość, czas aktywacji mięśni oraz łuk ruchu są wcześniej określone i zsynchronizowane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Zmiany po urazie są monitorowane in vivo za pomocą obrazowania/spektroskopii MR.

Model gryzoni in vivo w urazie wywołanym przykurczem i nieinwazyjne monitorowanie powrotu do sprawności

Zmiany w kurczliwości mięśni kończyn i pasywnych właściwościach mechanicznych są ważnymi biomarkerami chorób mięśni.  W tym manuskrypcie opisano testy fizjologiczne do pomiaru tych właściwości w mysich mięśniach prostownika długiego palca długiego i piszczelowych przednich.

Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Pomiary właściwości przewodnictwa nerwowego in vivo są przykładem potężnego narzędzia do charakteryzowania różnych zwierzęcych modeli chorób nerwowo-mięśniowych. Tutaj przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół, za pomocą którego można przeprowadzić analizę elektrofizjologiczną nerwów kulszowych znieczulonych myszy.

In vivo (in vivo) Pomiary elektrofizjologiczne nerwów kulszowych myszy

Inhibicyjne presynaptyczne GABAergiczne jest potężnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym, ważnym dla integracji sygnałów motorycznych i czuciowych w sieciach rdzenia kręgowego. Podstawową pierwotną depolaryzację aferentną można zmierzyć poprzez rejestrację potencjałów korzenia grzbietowego (DRP). Tutaj demonstrujemy metodę rejestracji in vivo DRP u myszy.

Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Precyzyjna ocena reakcji na ból w neuropatycznym modelu zwierzęcym jest kluczowa dla zbadania patofizjologii chorób bólowych i opracowania nowych leków przeciwbólowych. Przedstawiamy czułą i obiektywną metodę określania funkcji sensorycznej tylnej łapy gryzonia za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy chodu.

Zautomatyzowana analiza chodu u myszy z przewlekłym urazem zwężenia

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.

Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy

Kliniczna ocena spastyczności oparta na odruchu Hoffmanna (H-odruch) i wykorzystująca elektryczną stymulację nerwów obwodowych jest uznaną metodą. W tym miejscu przedstawiamy protokół końcowej i bezpośredniej stymulacji nerwów w celu ilościowego określenia odruchu H w przedniej łapie myszy.

Końcowe pomiary H-refleksu u myszy

Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.

Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy

Obecny protokół opisuje unikalną technikę zwaną treningiem oporowym dostosowanym do dawki (DART), która może być włączona do precyzyjnych badań rehabilitacyjnych przeprowadzanych na małych zwierzętach, takich jak myszy.

Trening oporowy dostosowany do dawki u myszy ze zmniejszonym ryzykiem uszkodzenia mięśni

Poznaj nieinwazyjną metodę oceny funkcji mięśni zginaczy grzbietowych u myszy, umożliwiającą powtarzalne pomiary w czasie. Technika ta pozwala śledzić przebieg chorób neuromięśniowych i oceniać skuteczność terapii.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów