Name: Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę obrazowania o wysokiej zawartości do analizy transportu rodopsyny w komórkach. Technika ta umożliwia szybką ocenę farmakodynamiki leków i przyspiesza rozwój terapii retinitis pigmentosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Markowi E. Schurdakowi i University of Pittsburgh Drug Discovery Institute za dostarczenie wysokiej jakości imagera i wstępne szkolenia. Dr Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) hojnie podzielił się przeciwciałami anty-rodopsyny 1D4 i B630. Plazmid zawierający cDNA mysiego konstruktu rodopsyny-Wenus został udostępniony przez dr Nevina Lamberta (Augusta University). Prace te były wspierane przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia EY024992 dla YC oraz P30EY008098 z grantu University of Pittsburgh Vision Research Core.

UWAGA: Test transportu rodopsyny. 
1. Przygotowanie i hodowla komórek
<ol>
	<li>Ożyw kriokonserwowane stabilne komórki U2OS z ekspresją białek fuzyjnych typu dzikiego (WT) lub zmutowanych mysich białek fuzyjnych rodopsyny i Wenus. Rozmrozić komórki w temperaturze 37 °C do momentu, aż w fiolce pozostaną tylko małe kryształki lodu. 
	UWAGA: Komórki U2OS są używane w tym protokole, ponieważ nie ma dostępnej linii komórek fotoreceptorowych do badań in vitro, a biosynteza przedrzęskowa rodopsyny jest regulowana przez podobne mechanizmy molekularne w komórkach ssaków. Dodatkowo komórki U2OS ściśle przylegają do dna płytki i mają duże korpusy komórek, dzięki czemu idealnie nadają się do testu transportu rodopsyny. Siedem stabilnych komórek U2OS wykazujących ekspresję mutantów rodopsyny WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N i P267L jest tutaj używanych jako przykład w celu pokazania jakości i wiarygodności testu. W zależności od celu testu można użyć stabilnych komórek wykazujących ekspresję innych mutantów rodopsyny lub innych białek błonowych. W tym teście można użyć stabilnych komórek wykazujących ekspresję rodopsyny ludzkiej, jeśli są dostępne. Zastosowano tutaj rodopsynę mysią, ponieważ białka rodopsyny myszy i ludzi mają 95% homologię, a związki zidentyfikowane w tym teście zostaną przetestowane in vivo przy użyciu mysiego modelu adRP z mutacją rodopsyny P23H<klasa sup="xref">8. Stabilne komórki zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem19. Transkrypty WT i zmutowanej rodopsyny oznaczono ilościowo za pomocą q-PCR, a do tego testu wybrano klony stabilnych komórek wyrażających podobne poziomy transkryptów WT i zmutowanej rodopsyny. Ekspresję białek rodopsyny potwierdzono za pomocą immunoblot i barwienia immunologicznego. Pasaż komórek użytych w tym teście powinien być mniejszy niż 20.</li>
	<li>Przenieś każdą linię komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle's o wysokiej zawartości glukozy (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 5 μg/ml plazmocyny).</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml pożywki do wzrostu komórek dla każdej linii komórkowej. Przenieść każdą linię zawiesiny komórkowej do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Subkulturuj komórki, gdy szalka do hodowli tkankowej osiągnie 90% konfluencji, jak opisano w reference12.</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek po 5 000 komórek na studnię
UWAGA: Wykonaj następujące procedury w kapturze do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Potraktuj płytkę polilizyną.
	<ol>
		<li>Na jeden dzień przed wysiewem komórek należy potraktować 384-dołkową płytkę o czarnych ściankach i przezroczystym dnie 20 μl/dołek roztworu polilizyny przez 30 minut.</li>
		<li>Zassać płyn i pozostawić wszystkie studzienki do wyschnięcia na 1 godzinę. Założyć pokrywkę płytki i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez noc w celu wysiewu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową.
	<ol>
		<li>Hoduj każdą linię komórkową w pożywce wzrostowej w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, aż do 90% zbieżności.</li>
		<li>Umyj każde naczynie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odłącz komórki 1 ml 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić każdą linię komórek w 10 ml pożywki testowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).</li>
		<li>Policz komórki i rozcieńcz każdą linię komórek do 1,25 x 105 komórek/ml za pomocą pożywki testowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiej komórki.
	<ol>
		<li>Użyj elektronicznej pipety wielokanałowej lub automatycznego dozownika odczynników, aby dozować 40 μl/dołek zawiesiny komórek do trzech kolumn na linię komórkową i napełnić kolumny 1-21 płytki 384-dołkowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Dodać 40 μl/basenik U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) do kolumn 22-23 i 40 μl/basenik U2OS (Rhodopsin-Venus) do kolumny 24, jako kontrole.</li>
		<li>Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 30 s, aby wszystkie komórki opadły na dno płytki 384-dołkowej. 
		UWAGA: Unikaj fizycznego wstrząsu na płytce po wysianiu komórek. W przeciwnym razie komórki zostaną zmiażdżone do jednego rogu każdej studzienki, a płytka nie będzie nadawała się do obrazowania o wysokiej zawartości.</li>
		<li>Inkubować 384-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny, aby komórki przyłączyły się do dna płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Traktowanie komórek związkami
<ol>
	<li>Wygeneruj mapę tablicy z warunkami leczenia, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Przygotuj 300 μl 5x roztworów roboczych do 15 związków na płytce 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć cps od 1 do 15 pożywką testową do pięciu razy w stosunku do ich końcowych stężeń w studzienkach od A1 do G2 96-dołkowej płytki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Dodać 300 μl pożywki do oznaczania w studzience H2, 
		UWAGA: Końcowe stężenie każdego związku jest używane w najbardziej efektywnym stężeniu do ratowania transportu rodopsyny P23H przez klasę HTS<sup="xref">12,13.</li>
		<li>Dodać 100 μl na studzienkę 2% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 25 μM 9-cis-retinalu, które rozcieńcza się w pożywce do oznaczania, odpowiednio do kolumn 11 i 12. Dodaj 9-cis-retinal w słabym świetle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie 10 μL na studzienkę 5x roztworów roboczych do płytki 384-dołkowej hodowanej z komórkami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Użyj elektronicznej pipety wielokanałowej, aby dodać związki 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 i 15 do rzędów A, C, E, G, I, K, M i O od kolumn od 1 do 21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Dodaj związki 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 i M do wierszy B, D, F, H, J, L, N i P z kolumn od 1 do 21.</li>
		<li>Dodać 10 μl na studzienkę 2% DMSO do kolumn 22 i 24. Dodać 10 μl na studzienkę 25 μM 9-cis-retinalu do kolumny 23, 
		UWAGA: DMSO jest używany jako kontrola nośnika, ponieważ wszystkie związki są początkowo rozpuszczone w DMSO w postaci zapasów. Kolumna 22 zawierająca komórki poddane działaniu DMSO wykazujące ekspresję rodopsyny P23H jest używana jako kontrola 0%. Komórki traktowane 9-Cis-siatkówką eksprymujące rodopsynę P23H są używane jako 100% kontrola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryć płytkę 384-dołkową folią aluminiową i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne bez przenikania błony do barwienia białka rodopsyny na powierzchni komórki.
UWAGA: Unikaj jakiegokolwiek detergentu w całym procesie barwienia immunologicznego, aby zachować nienaruszoną błonę komórkową.
<ol>
	<li>Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA), rozcieńczając 16% PFA z PBS w stosunku objętościowym 1:4 w dygestoriach chemicznych. Przenieś 4% PFA do zbiornika odczynnika.</li>
	<li>Wyjmij płytkę 384-dołkową w ciemnym pomieszczeniu o słabym czerwonym świetle. Użyj 8-kanałowego aspiratora podłączonego do butelki próżniowej, aby delikatnie zassać pożywkę. Za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej dodaj 20 μl na studzienkę świeżo przygotowanego 4% PFA do całej płytki 384-dołkowej i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć oderwania komórek, podczas aspiracji zawsze kieruj końcówki aspiratora na tę samą stronę każdej studzienki. Nie dotykaj środkowej dolnej części każdej studzienki. Podczas robienia zdjęć wybieraj pola, aby uniknąć obszaru dotykanego przez aspirator. W przypadku inkubacji dłuższej niż 10 minut, przykryj płytkę 384-dołkową pokrywką, aby uniknąć parowania. 
	UWAGA: Komórki są utrwalane w ciemnym pomieszczeniu, aby uniknąć fotowybielania zregenerowanej izorydopesty, które wpłynie na wynik 100% kontroli. Po utrwaleniu płytkę 384-dołkową można wyjąć w normalnym świetle.</li>
	<li>Użyj 8-kanałowego aspiratora, aby zassać PFA w każdym dołku i użyj elektronicznej pipety wielokanałowej, aby dodać 50 μl na studzienkę PBS. Powtórz jeszcze dwa razy, aby wykonać trzy prania za pomocą PBS. 
	UWAGA: Odpady płynne zawierające PFA są zbierane w zakorkowanej butelce i po doświadczeniu należy je zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
	<li>Zablokuj komórki, dodając 20 μl na studzienkę 5% koziej surowicy do całej 384-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Odessać 5% surowicę kozią i dodać 15 μl na studzienkę 20 μg przeciwciała anty-rodopsynowego mL-1 B6-30 w 1% surowicy koziej do rzędów od A do O. Dodać 15 μl na studzienkę 1% surowicy koziej do wiersza P dla grupy kontrolnej zawierającej tylko przeciwciała drugorzędowe.</li>
	<li>Inkubować 384-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej przez 90 minut lub w temperaturze 4 °C przez noc. Przykryj płytkę 384-dołkową folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania fluoroforów.</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy 50 μl na dołek PBS.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 15 μl na studzienkę 5 μg mL-1 Cy3-sprzężonego z kozim przeciwciała anty-mysiego IgG. Przykryć płytkę 384-dołkową folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy 50 μl na dołek PBS. Dodać 50 μl na studzienkę PBS zawierającej 1 μg mL-1 Hoechst 33342 do barwienia jąder w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Przed obrazowaniem należy uszczelnić płytkę 384-dołkową przezroczystą folią. Przykryć płytkę 384-dołkową folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, jeśli zdjęcia są wykonywane natychmiast.</li>
</ol>
5. Obrazowanie.
UWAGA: Ta procedura obrazowania o wysokiej zawartości jest dostosowana do systemu obrazowania wymienionego w Tabeli Materiałów. Procedury mogą się różnić w przypadku korzystania z innych systemów obrazowania o wysokiej zawartości.
<ol>
	<li>Zdejmij pokrywkę i włóż płytkę 384-dołkową do imagera o wysokiej zawartości z A1 umieszczonym w lewym górnym rogu płytki.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu, aby skonfigurować parametry akwizycji obrazu.
	<ol>
		<li>Otwórz okno Ustawienia akwizycji blachy i utwórz nowe ustawienie lub wczytaj istniejący plik instalacyjny.</li>
		<li>Wybierz obiektyw 20x i ustaw grupowanie pikseli jako 2, tak aby skalibrowany rozmiar piksela wynosił 0,80 x 0,80 μm. Ustaw linie skanowania na 2 000, a rozmiar obrazu (szer. x wys.) na 1 000 x 1 000 pikseli (800,00 x 800,00 μm) na witrynę.</li>
		<li>Wybierz typ płyty, która ma zostać zobrazowana. Skorzystaj z informacji dostarczonych przez producenta płytki 384-dołkowej, aby wypełnić wymiary płytki.</li>
		<li>Wybierz dołki, które mają zostać zobrazowane dla płytki 384-dołkowej.</li>
		<li>Wybierz cztery miejsca, które mają zostać zobrazowane dla każdego dołka. Unikaj strony studni, której dotykają końcówki do aspiracji.</li>
		<li>Wybierz lasery wzbudzające o długości fali 405, 488 i 561 nm. Wybierz filtry emisji dla kanałów DAPI, FITC i Texas Red. Zoptymalizuj moc lasera i wzmocnienia każdego kanału, aby upewnić się, że jasność obrazów wykonanych ze studzienek kontroli pozytywnej jest mniejsza niż próg nasycenia.</li>
		<li>Wybierz dobrą lub dobrą ostrość dla autofokusa. Wybierz pierwszy nabyty studzienek jako początkowy dołek do znalezienia próbek. Ustaw autofokus witryny na wszystkie witryny.</li>
		<li>Wybierz cztery średnie na wiersz dla każdego kanału. Zoptymalizuj wartość przesunięcia Z dla każdego kanału.</li>
		<li>Przetestuj 2-3 dołki w ukośnych rogach płytki 384 dołków, aby upewnić się, że obrazy są ostre dla wszystkich testowanych studzienek, obrazy ze wszystkich miejsc na studzienkę mają komórki o ponad 40% konfluencji, a intensywność fluorescencji wszystkich kanałów jest około połowy nasycona w studzienkach kontrolnych 100%.</li>
		<li>Zapisz metodę pozyskiwania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom całą płytę. Obserwuj wywoływarkę, aż zakończy przechwytywanie obrazów z pierwszej kolumny płyty, aby dokładnie sprawdzić jakość obrazu przed opuszczeniem wyczuwalnika. Wyjąć płytkę 384-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: W zależności od liczby wybranych miejsc na studzienkę i pobranych kanałów, zakończenie obrazowania jednej płytki 384-dołkowej zajmuje od 40 minut do 3 godzin.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu.
<ol>
	<li>Wyciągnij dane obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu o wysokiej zawartości. Wybierz jedną z studzienek kontrolnych 100% (kolumna 23), aby ustawić parametry.</li>
	<li>Wybierz Punktację komórek o wielu długościach fali jako metodę analizy i rozpocznij konfigurowanie ustawień.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj jądra za pomocą obrazów z kanału DAPI. Wykonaj podgląd, aby upewnić się, że zdefiniowane kształty jąder w wybranym studzience dobrze pasują do obrazów jąder.</li>
		<li>Określ kształt komórki w kanale FITC, w którym obrazowana jest rodopsyna-Wenus.</li>
		<li>Zdefiniuj obszary barwienia powierzchni komórki rodopsyny w kanale czerwieni teksańskiej.</li>
		<li>Przetestuj obecny algorytm w 5 dołkach, aby określić, czy ustawienia są zoptymalizowane. Zapisz ustawienia i zamknij okno Konfiguracja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom wszystkie odwierty za pomocą zoptymalizowanej metody analizy.</li>
	<li>Eksportuj numer obiektu jako nienaruszony numer komórki. Wyeksportuj średnią intensywność kanału FITC jako intensywność rodopsyny-Wenus (Rhodopsin-Venus INT). Eksportuj średnią intensywność kanału Texas Red jako intensywność rodopsyny na powierzchni komórki (Rhodopsin INT na powierzchni komórki).</li>
	<li>Otwórz wyeksportowane dane w arkuszu kalkulacyjnym. Podziel intensywność rodopsyny na powierzchni komórki przez RHODOPSIN-Venus INT jako stosunek MEM do całkowitego. Obliczyć współczynniki Z' dla każdego parametru, aby ocenić jakość testu. Z′=1−3X(STD 100% kontroli+STD0% kontroli)/|Średnia100% kontroli−Średnia0% kontroli|. 
	UWAGA: Współczynnik Z' wyższy niż 0 oznacza umiarkowany test wystarczający dla badania przesiewowego o wysokiej zawartości, a współczynnik Z' między 0,5 a 1 sugeruje znakomity test wymagany dla badania przesiewowego o wysokiej przepustowości<klasa SUP="xref">20,<klasa SUP="xref">21.</li>
	<li>Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby wygenerować dwukolorową mapę cieplną dla każdego parametru. Ułóż nazwy linii komórkowych na osi X i związków na osi Y.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu pokazaliśmy test obrazowania o wysokiej zawartości używany do charakteryzowania trafień zidentyfikowanych na podstawie HTS. Jedyną automatyzacją związaną z tymi protokołami jest imager o wysokiej zawartości. Barwienie immunologiczne i obrazowanie fluorescencyjne rodopsyny były powszechnie stosowane do scharakteryzowania lokalizacji rodopsyny 5,14,15,16. Jednak kwantyfikacja obrazó...

Nieprawidłowe fałdowanie białek jest związane z dystrofią mięśniową, zwyrodnieniami neuronów, a także chorobami powodującymi ślepotę, w tym barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki (RP)1. RP to dziedziczne i postępujące zwyrodnienie siatkówki związane z mutacjami w ponad 60 genach wpływających na funkcję i homeostazę fotoreceptorów pręcików lub nabłonków barwnikowych siatkówki (RPE)2,3. Obecnie nie jest dostępne skuteczne leczenie RP. Mutacje rodopsyny stanowią około 25-30% przypadków RP autosomalnie dominujących (ad). Spośród ponad 150 mutacji rodopsyny4 (Human Gene Mutation Database, http:/www.hgmd.cf.ac.uk/), mutacje klasy II powodują niestabilność strukturalną białka rodopsyny, która przyczynia się do śmierci fotoreceptora pręcików i utraty wzroku5,6,7,8. P23H jest najczęstszą mutacją rodopsyny w Ameryce Północnej, która jest również typowym przykładem mutacji rodopsyny klasy II9,10. Ze względu na swoją nieodłączną niestabilność strukturalną, nieprawidłowo sfałdowana rodopsyna jest gromadzona w retikulum endoplazmatycznym (ER) w komórkach ssaków, podczas gdy rodopsyna typu dzikiego znajduje się na błonie komórkowej5. Nieprawidłowo sfałdowany mutant rodopsyny P23H wykazuje dominującą ujemną cytotoksyczność, która nie jest spowodowana haploinsuficjencją, ale jest związana z aktywacją szlaku degradacji białka związanego z ER i przerwaną organizacją zewnętrznego segmentu pręcika. Aby złagodzić stres komórek fotoreceptorów pręcików, jedną ze strategii jest stabilizacja natywnego fałdowania zmutowanej rodopsyny za pomocą farmakologicznego białka opiekuńczego.
Aby osiągnąć ten cel, przeprowadziliśmy wysokoprzepustowe badanie przesiewowe (HTSs) oparte na komórkach11,12,13 za pomocą testu komplementacji fragmentów β-galaktozydazy, aby określić ilościowo mutanta rodopsyny P23H transportowanego przez błonę plazmatyczną. Solidny i prosty protokół tego testu HTS umożliwił nam zbadanie aktywności około 79 000 małych cząsteczek dla każdego badania. Ponieważ jednak ten test HTS odczytuje sygnały luminescencji, wyniki fałszywie dodatnie, w tym inhibitory β-gal, związki kolorowe lub cytotoksyczne, są włączane do listy trafień w oczekiwaniu na identyfikację za pomocą testu wtórnego.
Tradycyjne metody barwienia immunologicznego i obrazowania fluorescencyjnego są używane od lat do badania transportu rodopsyny w komórkach ssaków5,14,15,16. Jednak te konwencjonalne metody nie mogą być stosowane do ilościowego określania skutków farmakologicznych więcej niż 10 związków w kierunku transportu rodopsyny, ponieważ wiarygodna analiza obrazowa wymaga dużej liczby obrazów wykonanych w wysoce spójnych warunkach, których nie można zmienić konwencjonalnymi metodami obrazowania. W tym miejscu opracowaliśmy protokół obrazowania o wysokiej zawartości oparty na barwieniu immunologicznym jako test wtórny do ilościowego określenia transportu powierzchniowego komórek nieprawidłowo sfałdowanych mutantów rodopsyny11,13,17. Aby oznaczyć rodopsynę na błonie plazmatycznej, pominęliśmy etap przenikania błony komórkowej i wybarwiliśmy immunologicznie mutanty rodopsyny za pomocą monoklonalnej (B6-30) anty-rodopsyny, rozpoznając N-końcowy epitop rodopsyny po zewnątrzkomórkowej stronie błony komórkowej18. Aby uwidocznić zmutowaną rodopsynę w całej komórce, połączyliśmy rodopsynę z białkiem fluorescencji Wenus. Poprzez ilościowe określenie intensywności fluorescencji w różnych kanałach fluorescencyjnych jesteśmy w stanie uzyskać wiele parametrów z jednego eksperymentu, w tym całkowitą intensywność rodopsyny w całej komórce, na powierzchni komórki oraz stosunek fluorescencji rodopsyny na powierzchni komórki do fluorescencji w całej komórce. Stosując tę metodę do stabilnych komórek wyrażających łącznie sześć nieprawidłowo sfałdowanych mutantów rodopsyny, możemy wygenerować profil farmakologiczny wielu małocząsteczkowych białek opiekuńczych w stosunku do tych mutantów. W tym protokole wszystkie komórki są barwione immunologicznie na 384-dołkowej płytce i obrazowane za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania w wysoce spójnych warunkach obrazowania. Do każdego dołka przeprowadzana jest analiza obrazu, zawierająca obrazy ponad 600 komórek w celu zmniejszenia zmienności spowodowanej niejednorodnością komórek o różnym kształcie komórki i poziomie ekspresji białka. Przebieg pracy tego protokołu jest podsumowany w Rysunek 1. Zaletą tej metody jest to, że z analizy obrazowej uzyskujemy obrazy o wysokiej rozdzielczości, a także wieloparametrowe kwantyfikacje. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być modyfikowany i stosowany do ilościowego określania transportu dowolnego nieprawidłowo sfałdowanego białka błonowego, które jest przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Komórki U2OS (rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Stabilne komórki wygenerowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (T4R-rodopsyna-Wenus)</td><td>komórki NA</td><td></td><td>NA Stabilne komórki wygenerowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (P23H-rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabilne komórki wygenerowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (P53R-rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabilne komórki wygenerowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (C110Y-rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabilne komórki generowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (D190N-rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Stabilne komórki generowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>Komórki U2OS (P267L-rodopsyna-Wenus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stabilne komórki generowane z komórek U2OS</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej stężeniu glukozy</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Z L-glutaminą, sodem pirogronian</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Plazmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Odczynnik do eliminacji mykoplazmy</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X skoncentrowane roztwory antybiotyków zapobiegające zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0,25%, 1mM EDTA w HBSS bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70,000-150,000, 0,01%, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384-dołkowe mikropłytki tkankowe poddane działaniu kulutre z czarnymi ściankami dołka i optycznie przezroczystym cyklicznym dnem olefinowym do obrazowania komórek w analizie</td></tr> <tr><td>o wysokiej zawartościSterylna 96-dołkowa płytka</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Hodowla tkankowa poddana działaniu płaskiego dna pokrywy, sterylna, wolna od wykrywalnych pirogenów, Rnazy, DNazy i DNA. Niecytotoksyczna</td></tr><tr><td>balonowa balonowa sailine (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x bufor PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99,5%, testowana hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>testowane związki</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Niestandardowe syntetyzowane</td> związki <td>NA</td><td>zostały zakupione od różni dostawcy lub niestandardowo syntetyzowane</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw rodopsynom B6-30</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Prezent od dr Krzysztofa Palczewskiego</td></tr><tr><td>Cy3-sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko mysi</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td> Bez <td>metanolu</td></tr><tr><td>10% Normalne kozie serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Bufor blokujący</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Roztwór do barwienia jądrowego</td></tr><tr><td>Imager o wysokiej zawartości</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; Mikrokonfokalny system obrazowania o wysokiej zawartości</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów o wysokiej zawartości MetaXpress</td><td>Urządzenia molekularne Oprogramowanie</td><td>MetaXpress</td><td>do akwizycji i analizy obrazów o wysokiej zawartości</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (0,5-10 i mikro; L)</td><td></td><td></td><td>Ręczna pipeta 8-kanałowa Rainin 17013802, 0,5-10 i mikro; L</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (0,5-10c</td><td>Ręczna</td><td></td><td>pipeta 8-kanałowa Rainin 17013805, 20-200 &mikro; L</td></tr><tr><td>Elektroniczna pipeta wielokanałowa (10-200 &mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>Elektroniczna pipeta multichanenelowa do zadań pipetowania mikropłytek 96- i 384-dołkowych</td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki Rezerwator odczynników</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>do wielokanałowego dozowania pippte</td></tr><tr><td>8-kanałowy aspirator</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>8-kanałowy adapter ze stali nierdzewnej do zasysania cieczy z płytek 96- lub 384-dołkowych</td></tr><tr><td>Excel oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych do analizy danych i generowania map cieplnych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych naukowych i wykresów Origin2018</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>Oprogramowanie do analizy danych do generowania krzywych odpowiedzi na dawkę</td></tr></tbody></table>

test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Mutacje powodujące nieprawidłowe fałdowanie rodopsyny prowadzą do śmierci fotoreceptora pręcikowego, która objawia się autosomalnym dominującym barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki (RP), postępującą chorobą powodującą ślepotę, która nie jest skutecznie leczona. Stawiamy hipotezę, że cytotoksyczność nieprawidłowo sfałdowanego mutanta rodopsyny może być złagodzona poprzez farmakologiczną stabilizację zmutowanego białka rodopsyny. Mutacja P23H, wśród innych mutacji rodopsyny klasy II, koduje strukturalnie niestabilne zmutowane białko rodopsyny, które gromadzi się w retikulum endoplazmatycznym (ER), podczas gdy rodopsyna typu dzikiego jest transportowana do błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Wcześniej przeprowadziliśmy wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na luminescencji (HTS) i zidentyfikowaliśmy grupę farmakologicznych opiekunów, które uratowały transport rodopsyny P23H z ER do błony plazmatycznej. Tutaj, stosując metodę barwienia immunologicznego, a następnie analizę obrazową o wysokiej zawartości, określiliśmy ilościowo ilość zmutowanego białka rodopsyny w całej komórce i na błonie plazmatycznej. Ta metoda jest pouczająca i skuteczna w identyfikowaniu prawdziwych trafień na podstawie wyników fałszywie dodatnich po HTS. Ponadto analiza obrazu o wysokiej zawartości umożliwiła nam ilościowe określenie wielu parametrów z jednego eksperymentu w celu oceny właściwości farmakologicznych każdego związku. Korzystając z tego testu, przeanalizowaliśmy wpływ 11 różnych związków na sześć mutantów rodopsyny związanych z RP, uzyskując 2-wymiarowy profil farmakologiczny w celu ilościowego i jakościowego zrozumienia stabilności strukturalnej tych mutantów rodopsyny i skuteczności różnych związków wobec tych mutantów.

Przetransportowanie rodopsyny scharakteryzowano za pomocą trzech parametrów: intensywności rodopsyny-Venus w całej komórce (Rhodopsin-Venus INT), intensywności immunostainingu rodopsyny na błonie plazmatycznej (Rhodopsin INT on the cell surface) oraz stosunku barwienia rodopsyny na powierzchni komórki do intensywności rodopsyny-Venus w całej komórce (MEM-Total Ratio). Reprezentatywny wynik testu transportu rodopsyny przedstawiono na Rysunku 3 i <strong class=...

Tutaj opisaliśmy metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia transportu mutantów rodopsyny związanych z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Do ilościowego określenia białka rodopsyny na powierzchni komórki lub w całej komórce wykorzystano analizę punktacji na wielu długościach fali.

Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Nieprawidłowe fałdowanie rodopsyny powoduje postępujące zwyrodnienie siatkówki zwane barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Podczas gdy tradycyjna metoda obrazowania ma ograniczone możliwości ilościowego określenia transportu rodopsyny, ten nowo opracowany test oparty na obrazie pozwala na badania przesiewowe o wysokiej przepustowości, eliminując wyniki fałszywie dodatnie. Technika ta pozwala na szybką ocenę farmakodynamiki leku.W oku ratowania fałdowania chorobotwórczej rodopsyny, przyspieszając w ten sposób potencjał leczenia cicho nieuleczalnej i oślepiającej choroby, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki. Lokalizacja komórkowa białka błonowego jest bardzo ważna dla jego funkcji. Metodę tę można łatwo zmodyfikować i zastosować do ilościowego określenia transportu dowolnego innego białka błonowego będącego przedmiotem zainteresowania.Upewnij się, że przygotowałeś mapę płytki i delikatnie dodaj i zassaj płyn z każdej studzienki płytki, aby utrzymać liczbę komórek i warunki stanu immunologicznego spójne między komórkami. Zapewni to wysoki współczynnik Z i wiarygodne wyniki. Na początek wysiej 5000 komórek na studzienkę na czarną ściankę, przezroczyste dno, 384-dołkową płytkę potraktowaną polilizyną.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2 przez trzy godziny, aby komórki przyczepiły się do dna płytki. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 10 mikrolitrów do studzienki 5-krotnie roztworów roboczych, zgodnie z wcześniej ustaloną mapą płytkową, taką jak ta pokazana tutaj. Teraz dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę 2% DMSO do kolumn 22 i 24.Dodaj również 10 mikrolitrów na studzienkę 25 mikromolowych 9-cis-retinalu do kolumny 23 w ciemnym pomieszczeniu w słabym czerwonym świetle. Po zakończeniu ładowania wszystkich różnych badanych związków, przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Wyjmij płytkę 384-dołkową w ciemnym pomieszczeniu ze słabym czerwonym światłem.Tutaj, za pomocą 8-kanałowego aspiratora, podłączonego do butelki próżniowej, aby delikatnie zassać pożywkę z dołków płytki. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 mikrolitrów na studzienkę świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu do całej płytki 384-dołkowej i utrwal komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu umieść płytkę w normalnym świetle.Tam użyj 8-kanałowego aspiratora, aby odessać paraformaldehyd w każdym dołku i użyj wielokanałowej pipety, aby dodać 50 mikrolitrów na studzienkę PBS. Zassać i wymienić PBS na łącznie trzy cykle prania. Następnie dodaj 20 mikrolitrów na studzienkę 5% koziej surowicy do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po inkubacji odessać studzienki i dodać 15 mikrolitrów 20 mikrogramów na mililitr przeciwciała anty-rodopsynowego B630 w 1% surowicy koziej do studzienek w rzędach od A do O. Następnie dodaj 15 mikrolitrów na studzienkę 1% surowicy koziej do rzędu P dla grupy kontrolnej zawierającej tylko przeciwciała wtórne. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 90 minut lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przykryj płytkę folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania fluoroforów.Następnie umyj płytkę trzykrotnie 50 mikrolitrami na studzienkę PBS. Po ostatnim płukaniu odessać PBS i dodać 15 mikrolitrów na studzienkę pięciu mikrogramów na mililitr koziego przeciwciała anty-mysiego IgG sprzężonego z Cy3. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez godzinę.Po inkubacji umyć płytkę trzy razy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę PBS, zawierającą jeden mikrogram na mililitr barwnika Hoechst w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Na koniec uszczelnij płytkę studzienki przezroczystą folią, przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do tygodnia.Usuń folię i umieść płytkę z próbką w imagerze o wysokiej zawartości, z formatem A1 umieszczonym w lewym górnym rogu płyty. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu, aby skonfigurować parametry akwizycji obrazu. Otwórz okno ustawień akwizycji blach i utwórz nowe ustawienie lub załaduj istniejący plik instalacyjny.Wybierz obiektyw 20X i ustaw grupowanie pikseli jako dwa, tak aby skalibrowany rozmiar piksela wynosił 0,80 na 0,80 mikrona. Następnie ustaw linie skanowania na 2000, a rozmiar obrazu na 1000 na 1000 pikseli na witrynę. Następnie wybierz typ płyty, która ma zostać zobrazowana.Skorzystaj z informacji dostarczonych przez producenta, aby wypełnić wymiary płyty. Teraz wybierz studnie, które mają być obrazowane, wraz z czterema miejscami, które mają być obrazowane dla każdego dołka. Unikaj boków studni, które są dotknięte końcówkami aspiracyjnymi.Do obrazowania wybierz lasery wzbudzające o długości 405, 488 i 461 nanometrów. Następnie wybierz filtry emisji dla kanałów DAPI, FITC i Texas Red. Zoptymalizuj moc lasera i wzmocnienia każdego kanału, aby upewnić się, że studzienki kontroli pozytywnej nie są nasycone.Wybierz dobrze, aby dobrze ustawić ostrość dla automatycznego ustawiania ostrości. Następnie wybierz początkową studnię, która ma zostać uzyskana, i ustaw automatyczne ustawianie ostrości witryny dla wszystkich witryn. Wybierz także cztery średnie na wiersz dla każdego kanału i zoptymalizuj wartość przesunięcia Z dla każdego kanału.Sprawdź, czy wszystko jest prawidłowo ustawione, najpierw testując dwa do trzech dołków w rogach płyty, aby upewnić się, że obrazy są ostre dla wszystkich testowanych dołków. Następnie sprawdź, czy obrazy ze wszystkich witryn na studnię mają komórki z ponad 40% konfluencją. Na koniec sprawdź, czy intensywność fluorescencji we wszystkich kanałach jest około w połowie nasycona w studzienkach 100% kontrolnych.Następnie zapisz metodę akwizycji obrazu i uruchom całą płytę. Obserwuj wywoływarkę, aż zakończy przechwytywanie obrazów z pierwszej kolumny płyty, aby dokładnie sprawdzić jakość obrazu przed opuszczeniem wyczuwalnika. Po zakończeniu wyjmij płytkę i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Wyciągaj dane obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazów o wysokiej zawartości. Wybierz jedną z studzienek 100%kontrolnych w kolumnie 23, aby skonfigurować parametry. Najpierw wybierz punktację komórek o wielu długościach fali jako metodę analizy i rozpocznij konfigurację dodatkowych ustawień.Zdefiniuj jądra za pomocą obrazów z kanału DAPI. Podgląd, aby upewnić się, że zdefiniowane kształty jąder w wybranym studzience dobrze pasują do obrazów jąder. Następnie zdefiniuj kształt komórki w kanale FITC, w którym obrazowana jest Wenus z rodopsyny.Aby to osiągnąć, ustaw minimalną i maksymalną średnicę każdej komórki, minimalną intensywność fluorescencji nad tłem, a także minimalną powierzchnię każdej komórki. Teraz zdefiniuj obszary barwienia powierzchni komórki rodopsyny w kanale czerwieni teksańskiej, ustawiając minimalne i maksymalne średnice kształtu komórki, minimalną intensywność fluorescencji nad tłem, a także minimalną powierzchnię każdej barwionej komórki. Przetestuj obecny algorytm w pięciu dołkach, aby określić, czy ustawienia są zoptymalizowane.Następnie zapisz ustawienia i zamknij okno konfiguracji. Uruchom wszystkie odwierty za pomocą zoptymalizowanej metody analizy. Po zakończeniu wyeksportuj numer obiektu jako nienaruszony numer komórki.Wyeksportuj średnią intensywność kanału FITC jako intensywność rodopsyny Wenus i wyeksportuj średnią intensywność kanału czerwonego Teksasu jako intensywność rodopsyny na powierzchni komórki. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby wygenerować dwukolorową mapę cieplną dla każdego parametru. Ułóż nazwy linii komórkowych na osi x i związki na osi y.Tutaj nasze obrazy rodopsyny P23H Wenus traktowane komórkami U2OS, wyrażając fluorescencję Wenus na zielono i barwienie immunologiczne powierzchni komórek na czerwono. Komórki były albo traktowane DMSO, albo pięcioma mikromolowymi 9-cis-retinalem. Test transportu rodopsyny, porównujący ilość rodopsyny w całej komórce w różnych warunkach, wykazuje znaczne odzyskanie w linii komórek zmutowanych P23H po leczeniu 9-cis-retinalem.Ponadto intensywność rodopsyny na powierzchni komórki oraz stosunek barwienia rodopsyny na powierzchni komórki do intensywności rodopsyny Wenus w całej komórce nie są istotnie niższe dla mutanta P23H w porównaniu z rodopsyną typu dzikiego leczoną DMSO. Mapa cieplna to skuteczny sposób na porównanie średniej ilości rodopsyny i lokalizacji na komórkę w wielu mutantach. Tutaj kontrole typu dzikiego i sześć mutantów rodopsyny są wymienione poziomo, a efekty leczenia złożonego są porównywane w pionie.Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, intensywność rodopsyny na powierzchni komórki i stosunek barwienia rodopsyny na powierzchni komórki do intensywności rodopsyny Venus są niższe dla sześciu mutantów w porównaniu z typem dzikim leczonym DMSO. Związki pierwszy, drugi, szósty i dziewiąty znacznie zwiększyły stosunek barwienia rodopsyny na powierzchni komórki do intensywności rodopsyny na Wenus w mutantach rodopsyny T4R, P23H, D190N i P267L, co sugeruje, że związki te ratują transport tych mutantów rodopsyny do błony plazmatycznej. Należy pamiętać, że komórki muszą być zlewające się w od 50 do 70% przed fiksacją, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla analizy obrazu.Pokazaliśmy również zdjęcia studni na całej płycie. Upewnij się, że obrazy są ostre, a fluorescencja, która nie wychodzi, ma wszystkie wartości progowe dla dowolnego kanału. Aż do wybrania związków, które ratują nieprawidłowo sfałdowany transport rodopsyny, możemy zwalidować proces, a następnie ocenić skuteczność tych związków in vivo, używając mysiego modelu wyrażającego mutanta rodopsyny P23H.Ta metoda pozwala nam określić ilościowo ilość białka błonowego i jego lokalizację. Dlatego jest to świetne narzędzie do mikro błędów rozpoczętych na białku błonowym na asystę oszczędzania i degradacji. Paraformaldehyd, podobnie jak w tym eksperymencie, ma procedury obejmujące obchodzenie się z tym odczynnikiem.Zostanie to zrobione pod maską. Odpady, w tym ten odczynnik, należy odpowiednio zutylizować jako niebezpieczną substancję chemiczną.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy metodologię łączącą zautomatyzowaną hodowlę komórek z obrazowaniem wysokotreściowym w celu wizualizacji i kwantyfikacji wielu procesów oraz struktur komórkowych w sposób wysokoprzepustowy. Takie metody mogą wspomagać dalszą adnotację funkcjonalną genomów, a także identyfikację sieci genów związanych z chorobami i potencjalnych punktów uchwytu dla leków.

Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Konstrukt kodujący TMEM184A ze znacznikiem GFP na końcu karboksylowym, przeznaczony do ekspresji eukariotycznej, został wykorzystany w testach mających na celu potwierdzenie identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych.

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Tutaj opisujemy dwie ilościowe metody badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A i opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi fizjologicznymi ligandami.

Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu

Poznaj metodę obrazowania o wysokiej zawartości do analizy transportu rodopsyny w komórkach. Technika ta umożliwia szybką ocenę farmakodynamiki leków i przyspiesza rozwój terapii retinitis pigmentosa.

Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów