Name: Ustalenie linii komórkowych z nadekspresją DR3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj metodę tworzenia stabilnych linii komórkowych z nadekspresją DR3 poprzez infekcję retrowirusową. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów apoptozy indukowanej przez leki antymitotyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty 53110000117 (dla G.W.) i 043222019 (dla X.W.) z Uniwersytetu Tsinghua.

Proszę zauważyć, że wszystkie opisane tutaj eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Tsinghua.
1. Generowanie linii komórkowych nadekspresji DR3
<ol>
	<li>Skonstruuj plazmid do ekspresji DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG), wprowadzając cDNA DR3 o pełnej długości z 3x FLAG na końcu C do wektora retrowirusowego pMXs-IRES-Blasticidyna w miejscach restrykcyjnych BamHI / XhoI.</li>
	<li>Hoduj komórki Plat-A w 60-milimetrowych szalkach z 4 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 80% - 90% konfluencji, należy przetransfekować komórki 2 μg plazmidu pMXs-IRES-DR3-FLAG za pomocą odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją producenta20.</li>
	<li>Po 72 godzinach zebrać supernatant, przefiltrować pożywkę za pomocą sterylnego filtra 0,45 μm i utrzymać zawiesinę wirusa w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Hodować komórki HT29 w DMEM w naczyniu o średnicy 60 mm i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia, gdy komórki osiągną 30% - 50% zbiegu, należy zainfekować komórki 2 ml zawiesiny wirusa w obecności 8 μg polimetabromidu 1,5-dimetylo-1,5-diazaundekametylomylu na mililitr zawiesiny wirusa. Po 4-6 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C odessać zawiesinę wirusa, dodać 4 ml świeżego DMEM i włożyć szalkę z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę z naczyń 24 godziny po zakażeniu i ostrożnie umyj komórki 2 ml podgrzanego PBS. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, że większość komórek odłączyła się, przerwij trypsynizację za pomocą 2 ml kompletnego DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Rozcieńczyć komórki przez czynniki 30, 100 i 300. Zasiać komórki w szalkach o średnicy 150 mm z 20 ml DMEM zawierającego 1 μg/ml blasticydyny. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez ~1 - 2 tygodnie.</li>
	<li>W tym okresie obserwuj kolonie codziennie za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu. Zaznacz dobrze odizolowane kolonie na dnie naczynia, gdy średnica kolonii wynosi około 1 - 2 mm.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki 3 ml wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj 2 mililitry trypsyny-EDTA do naczynia o średnicy 60 mm. Użyj sterylnych kleszczyków, aby podnieść autoklawowane sterylne cylindry do klonowania i umieść je w naczyniu o średnicy 60 mm. Podnieś butelki zawierające trypsynę-EDTA i delikatnie umieść je na zaznaczonych koloniach. Upewnij się, że każdy cylinder do klonowania zawiera tylko jedną kolonię i unikaj zanieczyszczenia pobliskimi koloniami.</li>
	<li>Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 3 minuty.</li>
	<li>Po 3 minutach sprawdź komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu, aby zobaczyć, czy się odczepiły. Gdy komórki się podniosą, dodaj 70 μl pożywki hodowlanej do każdego cylindra, aby dezaktywować trypsynę. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Upewnij się, że nie przesuwasz cylindra podczas tego procesu.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową z każdej kolonii na dwie 24-dołkowe płytki zawierające 1 ml DMEM na studzienkę. Dodać 30 μl zawiesiny komórek na dołek na płytce A i 70 μl do odpowiednich dołków w płytce B. Odpowiednio oznaczyć płytki i umieścić je z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
2. Weryfikacja linii komórkowej nadekspresji DR3
<ol>
	<li>Gdy komórki na płytce B osiągną 90% zbieżności, usuń pożywkę i ostrożnie umyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS i zlicz komórki za pomocą 50 μl bufora ładującego 1x SDS-PAGE. Przenieść lizaty komórkowe z płytki 24-dołkowej do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i gotować próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C.</li>
	<li>Próbki należy uruchomić na 10% żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS) przy stałym napięciu 80 V przez 15 minut, a następnie przy napięciu 120 V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieść białko do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą transferu na mokro przy stałym prądzie 400 mA przez 2 godziny.</li>
	<li>Przetestuj ekspresję DR3 w różnych klonach z przeciwciałem anty-FLAG, używając komórek HT29 typu dzikiego jako kontroli negatywnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe 5 000 razy w 5% beztłuszczowym mleku, które rozpuszcza się w TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem zawierająca 0,1% Tween-20). Inkubować błonę z przeciwciałem FLAG w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj membranę TBST, potrząsając nią na wytrząsarce odbarwiającej z prędkością 200 obr./min przy RT. Odświeżaj TBST co 5 minut, aby uzyskać łączny czas prania 15 minut.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszom rozcieńczonym 10 000 razy w 5% beztłuszczowym mleku w temperaturze 4 °C przez 5-6 godzin.</li>
	<li>Ponownie umyj membranę zgodnie z opisem w kroku 2.5.</li>
	<li>Wykryj ekspresję FLAG za pomocą substratu zachodniej wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i zobrazuj membranę za pomocą systemu dokumentacji żelu (patrz tabela materiałów). Zidentyfikuj klony wykazujące ekspresję DR3 jako klony dodatnie.</li>
	<li>Przenieś klony z płytki A, które odpowiadają dodatnim klonom z płytki B, na płytkę 6-dołkową i kontynuuj amplifikację komórek, aż wyhodują je na 10-centymetrowych szalkach. Przygotować zamrożone zapasy komórek wyrastających z dodatnich klonów i przechowywać je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Ocena odpowiedzi apoptotycznej komórek na środki antymitotyczne
UWAGA: Diazonamid to nowa klasa naturalnych produktów morskich, która wykazuje niezwykłą aktywność w hamowaniu wzrostu komórek rakowych, co odzwierciedla inne czynniki destabilizujące tubulinę21. Jednak jego sposób działania pozostaje niejasny. Aby przetestować odpowiedź komórkową komórek na środki antymitotyczne, paklitaksel i diazonamid zastosowano w leczeniu komórek HT29 typu dzikiego i komórek HT29-DR3. Leki rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu wytworzenia 10 mM zapasów, a następnie rozcieńczono do różnych stężeń: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3000 nM i 10 000 nM w DMSO.
<ol>
	<li>Zbierz komórki HT29 i HT29-DR3 przez trypsynizację. Zmierz gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie zasiej komórki na 12-dołkowych płytkach w DMEM o gęstości 3 x 104 komórki na dołek. Następnego dnia dodaj 10 nM diazonamidu i użyj 1% DMSO jako kontroli negatywnej. Po 48 godzinach leczenia zobrazuj komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Komórki HT29 i HT29-DR3 należy zasiać na płytkach 96-dołkowych w DMEM o gęstości 3 x 103 komórek na dołek i pozostawić do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie dodać zwiększające dawkę stężenia diazonamidu 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM i 100 nM do każdego dołka, używając 1% DMSO jako kontroli ujemnej.</li>
	<li>Po 48 godzinach leczenia należy zmierzyć żywotność komórek za pomocą zestawu do oznaczania żywotności komórek na bazie luminescencji zgodnie z instrukcją producenta.
	<ol>
		<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i odstawić ją w temperaturze pokojowej na około 30 minut. Następnie dodać 50 μl odczynników do oznaczania do każdej studzienki, wstrząsnąć płytką w temperaturze pokojowej przez 2 minuty w celu lizy komórek i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut. Określ luminescencję każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Żywotność komórek reprezentuje względną intensywność luminescencji każdej studzienki w stosunku do intensywności dobrze potraktowanej 1% DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sześciotygodniowych samic nagich myszy BALB/c do badania in vivo14. 
	UWAGA: Myszy utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów.
	<ol>
		<li>Trypsynizować komórki HT29 i HT29-DR3, a następnie zatrzymać trypsynizację za pomocą DMEM wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki z prędkością 1,000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM bez FBS. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i rozcieńcz komórki do stężenia 2,5 x 107 komórek/ml za pomocą PBS. Wygeneruj guzy poprzez podskórne wstrzyknięcie 200 μl zawiesiny komórek HT29 lub HT29-DR3 w prawą flankę każdej myszy (5 x 106 komórek/mysz)22.</li>
		<li>Mierz objętość guza (TV) za pomocą suwmiarki co 2 dni po przeszczepie. Oblicz telewizor za pomocą następującego wzoru: TV = 1/2L x W x W (tutaj W: szerokość guza, L: długość guza). Gdy średnia objętość guza osiągnie około 100 mm3, losowo przydziel myszy do grupy kontrolnej lub leczonej (n = 6 na grupę) i rozpocznij leczenie.</li>
		<li>Przygotować roztwór paklitakselu w następujący sposób. Najpierw całkowicie rozpuścić paklitaksel w etanolu w stężeniu 5% całkowitej objętości, a następnie dodać 5% końcowej objętości uwodornionego oleju rycynowego polioksylo-35. Na koniec uzupełnić pozostałe 90% objętości za pomocą D5W (5% dekstrozy w wodzie, pH 7,4).</li>
		<li>Paklitaksel należy wstrzykiwać dożylnie w dawce 20 mg/kg mc. 3 razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Mierz objętość guza i masę ciała 3 razy w tygodniu14. Zakończ eksperyment i poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli masa ciała zmniejszy się o 20% lub objętość guza osiągnie około 2000 mm3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+BCR%2FABL-induced+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
<li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation%2C+self-inactivating+gp91%28phox%29+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD%2FSCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34%2B+cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li>
<li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry+-+Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+agents%3A+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li>
<li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li>
<li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destabilising+agents%3A+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li>
<li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apo-3%2C+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family%2C+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li>
<li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+DR3%2C+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li>
<li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li>
<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li>
<li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Model%3A+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li>
<li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li>
<li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

W tym manuskrypcie opisujemy metodę generowania stabilnych linii komórkowych HT29-DR3. Komórki HT29-DR3 stanowią model do badania mechanizmów molekularnych, za pomocą których DR3 przyczynia się do apoptozy indukowanej przez środki antymitotyczne. Takie podejście jest wszechstronne i powtarzalne. Aby zapewnić powodzenie procedury, należy wziąć pod uwagę cztery kluczowe etapy protokołu. Po pierwsze, w celu wytworzenia wystarczająco wysokiego miana wirusa, zaleca się wykonanie transfekcji DNA, gdy komórki Plat-A znajdują si...

Heterologiczna ekspresja genów jest często wykorzystywana do badania funkcji genów będących przedmiotem zainteresowania. Dwie metody, transfekcja przejściowa i stabilna, są powszechnie stosowane w komórkach i biologii molekularnej do wstawiania segmentu DNA lub RNA do komórki gospodarza1,2. Przejściowo transfekowane DNA lub RNA nie mogą być przekazywane komórkom potomnym, więc zmiana genetyczna może zostać zachowana tylko przez krótki okres czasu. Z drugiej strony, w stabilnie transfekowanych komórkach egzogenne geny są zintegrowane z genomem komórki gospodarza, podtrzymując jej ekspresję w linii komórkowej. Tak więc stabilna transfekcja jest metodą, która jest zwykle zarezerwowana dla badań nad długoterminową regulacją genetyczną. Stabilna linia komórkowa może być również przeszczepiona w postaci ksenoprzeszczepów do modeli mysich do badania in vivo3. Stabilną transfekcję można podzielić na dwie kategorie: wirusową i niewirusową. W porównaniu z transfekcją niewirusową, infekcja wirusowa może przenosić geny do szerszej gamy komórek ludzkich z większą wydajnością4,5,6,7. Co więcej, stabilna linia komórkowa z pojedynczego klonu oferuje zaletę jednorodności i czystości klonalnej.
Niekontrolowany wzrost i podział komórek to najbardziej charakterystyczne cechy raka. W warunkach klinicznych leki przeciwmitotyczne są podstawowym sposobem leczenia wielu typów nowotworów8. Nie można jednak ignorować pewnych istotnych ograniczeń środków antymitotycznych. Po pierwsze, te chemioterapie mogą również zabijać normalne komórki wraz z niepożądanymi komórkami rakowymi, a tym samym mogą powodować poważne skutki uboczne8. Po drugie, leki antytubulinowe nie są skuteczne przeciwko wszystkim typom nowotworów, pomimo wszechobecnej ekspresji tubuliny w wielu różnych tkankach jako białko cytoszkieletu9,10. Nie jest jasne, dlaczego leki antytubulinowe wykazały obiecującą skuteczność przeciwko rakowi jajnika, płuc i nowotworom hematologicznym w leczeniu klinicznym, ale nie w raku nerki, okrężnicy lub trzustki11. Wreszcie, nawet pacjenci z tym samym typem guza mogą reagować na leki przeciwmitotyczne w różny sposób w nieprzewidywalny sposób. Może istnieć kluczowa cząsteczka efektorowa, która wpływa na wrażliwość różnych pacjentów na środki antymitotyczne, co skutkuje różnorodnymi wynikami obserwowanymi w leczeniu klinicznym12. W związku z tym należy wziąć pod uwagę potencjalną różnicę wrażliwości pacjentów na leczenie antymitotyczne w celu optymalizacji interwencji terapeutycznych13.
Wysokoprzepustowe badanie biblioteki siRNA całego genomu wykazało, że knockdown DR3 może uczynić wrażliwe komórki odpornymi na leki antymitotyczne, co sugeruje rolę DR3 w apoptozie wywołanej chemioterapią14. Jako członek nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNFR), DR3 pośredniczy w apoptozie komórek w różnych układach15,16,17,18. Dlatego postanowiliśmy ustalić stabilne linie komórkowe z nadekspresją DR3, aby zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których leki antymitotyczne indukują apoptozę. Odpowiedni model komórkowy do badania nadekspresji DR3 może dostarczyć ludzka linia komórkowa raka jelita grubego HT29, u której stwierdzono niedobór DR3. Dodatkowo, w klinice, rak jelita grubego jest niewrażliwy na leki antymitotyczne19.
W tym artykule opisujemy metodę, która pozwala na wytworzenie stabilnej linii komórkowej HT29-DR3 poprzez infekcję retrowirusową. Ponadto pokazujemy, jak zwalidować ekspresję DR3 w tych komórkach za pomocą western blotting i jak ocenić wrażliwość na środki antymitotyczne za pomocą testu żywotności komórek i obserwacji morfologicznej. Komórki są amplifikowane z pojedynczych klonów, a zatem mają przewagę w postaci jednorodnego tła genetycznego. Ponadto znacznik FLAG na DR3 pozwolił na wizualizację komórkowego DR3 za pomocą mikroskopii oraz analizę ekspresji genów i interakcji białek za pomocą podejść biochemicznych. Co więcej, komórki mogą być ksenoprzeszczepowane u myszy w celu dalszej analizy progresji guza w odpowiedzi na leki antymitotyczne in vivo14.
Prezentowany tutaj system komórkowy HT29-DR3 oferuje skuteczne narzędzie do badania molekularnych mechanizmów zabijania komórek nowotworowych przez antymitotyki14. Ponieważ nadekspresja i knockdown linie komórkowe są powszechnymi narzędziami do badania funkcji genów, protokół ten można łatwo dostosować do innych interesujących genów lub innych linii komórkowych, a tym samym przekształcić w szeroko stosowane podejście.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>uzupełniony o 10% FBS i 1% penicyny/streptomycyny</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek luminescencyjnych</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-dimetylo-1,5-diazaundekametylopolimethobromide</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Odczynnik do transfekcji</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Flag</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HT29 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A</td><td>Komórka Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder klonujący</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik wielomodowy do obrazowania komórek</td><td></td><td></td> Mikroskop odwrócony Biotek BTCYT3MV <td></td></tr><tr><td>CKX53</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Gniazdo</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 60 mm</td><td>Gniazdo</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Gniazdo</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0,22 &mu; m filtr sterylny</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Biała mikropłytka polistyrenowa&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western Podłoże ECL</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare ImageQuant</td><td>LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka odbarwiająca&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Obniżona surowica</td><td>Medium Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie linii komórkowych z nadekspresją dr3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Badanie funkcji interesującego genu można osiągnąć poprzez manipulowanie jego poziomem ekspresji, na przykład zmniejszając jego ekspresję za pomocą linii komórkowych knockdown lub zwiększając jego ekspresję za pomocą linii komórkowych z nadekspresją. Transfekcja przejściowa i stabilna to dwie metody, które są często stosowane do egzogennej ekspresji genów. Transfekcja przejściowa jest przydatna tylko do krótkotrwałej ekspresji, podczas gdy transfekcja stabilna umożliwia integrację genów egzogennych z genomem komórki gospodarza, gdzie będzie ona ulegać ciągłej ekspresji. W rezultacie, stabilna transfekcja jest zwykle stosowana do badań nad długoterminową regulacją genetyczną. Tutaj opisujemy prosty protokół generowania stabilnej linii komórkowej z nadekspresją znakowanego receptora śmierci 3 (DR3) w celu zbadania funkcji DR3. Wybraliśmy pojedyncze klony po infekcji retrowirusowej, aby zachować jednorodność i czystość stabilnych linii komórkowych. Stabilne linie komórkowe wygenerowane przy użyciu tego protokołu sprawiają, że komórki HT29 z niedoborem DR3 są wrażliwe na leki antymitotyczne, odtwarzając w ten sposób odpowiedź apoptotyczną w komórkach HT29. Co więcej, znacznik FLAG na DR3 kompensuje niedostępność dobrego przeciwciała DR3 i ułatwia biochemiczne badanie mechanizmu molekularnego, za pomocą którego środki antymitotyczne indukują apoptozę.

Charakterystyka komórek HT29 stabilnie eksponujących DR3 została przedstawiona na Rysunku 1. Klony wykazują zróżnicowane poziomy ekspresji DR3, podczas gdy komórki typu dzikiego, służące jako kontrola negatywna, nie wykazują ekspresji egzogennego genu. Przedstawiono tutaj tylko pięć klonów, spośród których klon 1 i 5 wykazują najwyższy poziom ekspresji DR3. Do dalszych eksperymentów wybrano klon 1 i 5.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Ustanowienie stabilnej linii komórkowej z nadekspresją interesującego genu do badania funkcji genu może być przeprowadzone przez stabilną transfekcję i selekcję pojedynczych klonów po ich transfekcji poprzez infekcję retrowirusową. Tutaj pokazujemy, że wygenerowane w ten sposób linie komórkowe HT29-DR3 wyjaśniają mechanizmy, za pomocą których receptor śmierci 3 (DR3) przyczynia się do apoptozy wywołanej antymitozą.

Ustalenie linii komórkowych z nadekspresją DR3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Nadekspresja genów w komórkach jest ważnym sposobem badania funkcji genów. Stabilna transfekcja z retrowirusem pozwala na integrację endogennych genów z genomem gospodarza i ciągłą ekspresję. Wychwyciliśmy pojedyncze kolonie infekcji retrowirusowej i wygenerowaliśmy stabilne linie komórkowe z nadekspresją DR3 znakowanego FLAG.Linie komórkowe kompensowały niedostępność dobrego przeciwciała DR3 i dostarczyły doskonałych narzędzi do badania funkcji DR3 po warunkach in vitro i in vivo. Wygenerowaliśmy linie komórkowe nadekspresji DR3, wychwytując pojedynczą kolonię infekcji retrowirusowej. Linie komórkowe z pojedynczej kolonii mogą zachować jednorodność i czystość.Ponadto protokół jest łatwy i prosty w obsłudze. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj komórki plat-A przez noc w 60-milimetrowych naczyniach z czterema mililitrami DMEM. Gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji, użyj odczynnika do transfekcji, aby transfekować je dwoma mikrogramami skonstruowanego plazmidu, jak opisano w instrukcji producenta.Po 72 godzinach zebrać supernatant. Używając sterylnego filtra 0,45 mikrometra, przefiltruj pożywkę i utrzymuj zawiesinę wirusa w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie hoduj komórki HT29 przez noc w 60-milimetrowym naczyniu z DMEM, inkubując komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Gdy komórki osiągną zbieg od 30 do 50%, należy je zainfekować dwoma mililitrami zawiesiny wirusa w obecności ośmiu mikrogramów polibrenu na mililitr zawiesiny wirusa. Inkubuj zainfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin. Następnie odessać zawiesinę wirusa.Dodaj cztery mililitry świeżego DMEM i włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach od zakażenia usuń pożywkę z naczyń i ostrożnie umyj komórki dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Używając mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu, obserwuj komórki, aby upewnić się, że większość z nich się odłączyła. Następnie dodaj dwa mililitry DMEM zawierającego 10% FBS, aby zatrzymać trypsynizację i zbierz zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce. Wirować 200 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach DMEM i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie rozcieńczyć komórki przez czynniki 30, 100 i 300. Zasiew komórek to 150-milimetrowe szalki, z których każda zawiera 20 mililitrów DMEM zawierającego blastycydynę w stężeniu jednego mikrograma na mililitr.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez około jeden do dwóch tygodni. W tym okresie używaj odwróconego mikroskopu o 10-krotnym powiększeniu, aby obserwować kolonie każdego dnia. Zaznacz dobrze odizolowane kolonie na dnie naczynia, gdy średnica kolonii wynosi około jednego do dwóch milimetrów.Po zakończeniu okresu inkubacji odessać pożywkę i umyć komórki trzema mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj dwa mililitry trypsyny EDTA do 60-milimetrowego naczynia. Użyj sterylnych kleszczyków, aby podnieść autoklawowane sterylne cylindry do klonowania i umieścić je w naczyniu.Następnie podnieś butle, z których każdy będzie zawierał około 30 mikrolitrów trypsyny EDTA i delikatnie umieść je na zaznaczonych koloniach. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na trzy minuty. Następnie sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że się odłączyły.Gdy komórki podniosą się, w 70 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego cylindra, aby dezaktywować trypsynę. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie wymieszać zawiesinę komórek, uważając, aby nie przesuwać cylindra podczas mieszania. Ustaw dwie płytki 24-dołkowe i oznacz je płytką A i płytką B. Dodaj jeden mililitr DMEM do każdej studzienki.Dodać 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki A i dodać 70 mikrolitrów do odpowiednich dołków płytki B. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Gdy komórki na płytce B osiągną 90% zbieżności, usuń pożywkę i ostrożnie umyj komórki jednym mililitrem PBS. Całkowicie usunięto PBS i dodano 50 mikrolitrów bufora ładującego 1X SDS-PAGE w celu lizy komórek.Po pięciu minutach przenieś lizat komórkowy z 24-dołkowej płytki do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Gotuj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Uruchom próbki na żelu 10% SDS przy stałym napięciu 80 V przez 15 minut, a następnie przy 120 V przez jedną godzinę.Następnie przenieś białko do membrany z polifluorku winylidenu przez transfer na mokro przy stałym prądzie 400 miliamperów przez dwie godziny. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe przez współczynnik 5 000 w 5% beztłuszczowym mleku, które rozpuszcza się w TBST. Dodaj przeciwciało FLAG do błony i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Za pomocą wytrząsarki odbarwiającej ustawionej na 200 obr./min myj membranę TBST przez 15 minut, odświeżając TBST co pięć minut. Następnie rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało anty-mysie przez współczynnik 10 000 w 5% mleku beztłuszczowym. Inkubować błonę z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.Ponownie umyj membranę na wytrząsarce odbarwiającej, jak opisano wcześniej. Następnie użyj zachodniej wzmocnionej chemiluminescencji i systemu dokumentacji żelu, aby zobrazować membranę i wykryć ekspresję FLAG. Najpierw zbierz zarówno komórki HT29, jak i HT29-DR3 przez trypsynizację i użyj automatycznego licznika komórek do pomiaru gęstości komórek.Wysiewaj komórki do dołków 12-dołkowych płytek z DMEM o gęstości 30 000 komórek na dołek i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj 10 nanomolowych diazonamidów do każdej studzienki, która zawiera komórki, używając 1% DMSO jako kontroli ujemnej i przenieś płytki do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 48 godzinach od zabiegu zobrazuj komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu.Następnie zasiej zarówno komórki HT29, jak i HT29-DR3 w dołkach 96-dołkowej płytki z DMEM o gęstości 3 000 komórek na dołek i pozwól im rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy dodać stężenie diazonamidu zwiększające dawkę, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po 48 godzinach od leczenia użyj zestawu do oznaczania żywotności komórek na podstawie luminescencji, aby zmierzyć żywotność komórek.Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i odstawić w temperaturze pokojowej na około 30 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynników do każdego dołka i potrząsaj płytką przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zlizować komórki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie użyć czytnika mikropłytek, aby określić luminescencję każdej studzienki.Charakterystyka komórek HT29 stabilnie eksprymujących DR3 ujawnia, że klony wyrażają różne poziomy DR3, podczas gdy komórki typu dzikiego nie wykazują egzogennej ekspresji genów. Stwierdzono, że geny pierwszy i piąty wyrażają najwyższe poziomy DR3 i dlatego są wybierane do dalszych eksperymentów. Morfologię komórek HT29 i HT29-DR3 obserwuje się po 48-godzinnym leczeniu diazonamidem.Komórki HT29-DR3 wykazują wyraźną apoptozę z pękniętą błoną komórkową i resztkami komórek. Jednak komórki HT29 wykazują tylko zatrzymanie mitotyczne z nienaruszonymi komórkami, które wykazują zaokrąglony kształt komórki. Żywotność tych typów komórek jest następnie określana po traktowaniu przez 48 godzin trzema nanomolami diazonamidu.Obserwuje się, że komórki HT29-DR3 mają śmierć komórkową ponad 80%, podczas gdy rodzicielskie komórki HT29 wykazują tylko niewielką odpowiedź w postaci zatrzymania mitotyki. Wskazuje to, że nadekspresja DR3 odtworzyła indukowany diazonamidem szlak apoptotyczny w tych komórkach. Odpowiednie seryjne rozcieńczenia są ważne, aby uzyskać optymalną gęstość pojedynczych klonów.Ważne jest również, aby upewnić się, że każdy cylinder klonu zawiera tylko jedną kolonię i unikać zanieczyszczenia pobliskich kolonii. Linie komórkowe z nadekspresją DR3 ułatwiły biochemiczne badania mechanizmów molekularnych in vitro. Uzyskaliśmy ksenoprzeszczepy HT29-DR3 poprzez podskórne wstrzyknięcie komórek HT29-DR3, co pomogło opracować mechanizmy apoptozy indukowanej środkami antymitozowymi in vivo.Protokół ten może być wykorzystany do badania genów będących przedmiotem zainteresowania w innych liniach komórkowych. Ponadto nokaut genowy jest kolejnym sposobem badania funkcjonalnego, a nasz protokół może być dostosowany do systemów knockdown genów. W związku z tym ma ogólne zastosowanie do wyjaśnienia funkcji genów.Pamiętaj, aby wyrzucić przekaźnik wirusa do śmieci do określonych pojemników w celu bezpiecznej utylizacji.

establishing-cell-lines-overexpressing-dr3-to-assess-apoptotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy sposób przeprowadzania infekcji retrowirusowych lub lentiwirusowych konstruktami do nadekspresji lub zawierającymi shRNA w ludzkiej linii komórek B Ramos oraz metodę pomiaru hipermutacji somatycznej w tych komórkach.

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Protokół szczegółowo opisuje model raka mysiego in vitro o niegenetycznym wadliwym wydłużeniu transkrypcji. W tym przypadku przewlekłe hamowanie CDK9 jest wykorzystywane do tłumienia produktywnego wydłużania RNA Pol II wzdłuż genów odpowiedzi prozapalnej w celu naśladowania i badania klinicznie obserwowanego zjawiska zdecydowanie TE, obecnego w około 20% wszystkich typów raka.

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach

Prezentowany tutaj jest protokół generowania kontrolnych osadów komórkowych z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie dla immunohistochemii.

Standaryzowane przetwarzanie kontroli immunohistochemicznych osadów komórkowych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę tworzenia stabilnych linii komórkowych z nadekspresją DR3 poprzez infekcję retrowirusową. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów apoptozy indukowanej przez leki antymitotyczne.

Ustalenie linii komórkowych z nadekspresją DR3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne

Przeglądaj więcej filmów