Name: In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanej ekspresji białek optogenetycznych w mózgu ssaków przy użyciu folii jedwabiu/AAV. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie aktywności neuronalnej bez konieczności osobnych iniekcji wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować J. Vazquezowi za ilustracje, D. Kaplanowi i C. Predzie za odczynniki i pomocne wskazówki, a laboratoriom B. Sabatini i C. Harvey za obrazowanie in vivo. Mikroskopia była możliwa dzięki M. Ocana i Centrum Obrazowania Neurobiologii, wspieranemu częściowo przez Centrum Obrazowania Neuronalnego w ramach grantu National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) P30 Core Center (NS072030). Praca ta była wspierana przez fundację GVR Khodadad Family, fundację Nancy Lurie Marks oraz przez granty NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 i NINDS R35NS097284 dla WG.R, a także przez stypendium podoktorskie NIH F32NS101889 dla C.H.C.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Stały Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Harvardu, zgodnie z wytycznymi opisanymi w Przewodniku US NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6 obu płci (w wieku 6-15 tygodni).
1. Otrzymaj włókninę z wodnego jedwabiu
<ol>
	<li>Przygotuj lub kup wodną fibroinę jedwabiu (5-7,5% w/v).</li>
</ol>
2. Mieszanie wodnego jedwabiu z wektorami ekspresji AAV
<ol>
	<li>Wybierz wektor ekspresji AAV, aby sterować wybranym białkiem optogenetycznym lub wskaźnikiem fluorescencyjnym. 
	Uwaga: Aby zminimalizować objętość jedwabiu/AAV, którą należy nałożyć na implanty, jednocześnie zapewniając solidną ekspresję, zaleca się miano standardowe AAV (miana standardowe zwykle uzyskiwane z rdzeni wektorowych wynoszą około ~1013 gc / ml).</li>
	<li>Bezpośrednio przed nałożeniem powłoki na implanty należy rozmrozić porcję AAV i połączyć z 5-7,5% wodną fibroiną jedwabiu (mieszanina ta będzie określana jako jedwab/AAV). W probówce do PCR o pojemności 200 μl wymieszaj wodnistą fibroinę i AAV w stosunku 1:1 (w przypadku okien czaszkowych należy użyć 1:4) bezpośrednio przed aplikacją. Delikatnie odpipetuj roztwór kilka razy, aby dokładnie wymieszać fibroinę i AAV.</li>
	<li>Przed użyciem trzymaj mieszaninę jedwabiu i AAV na lodzie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu do produkcji i przechowywania urządzeń pokrytych jedwabiem/AAV
<ol>
	<li>Zakup sprzętu do powlekania światłowodów i soczewek o indeksie gradientu (GRIN) (rysunki 1, 2).
	<ol>
		<li>Zbuduj stabilny uchwyt tulejki. Aby przytrzymać tuleje ceramiczne, wywierć otwory 1.25 mm w bloku z arkusza akrylu 1/4". Gwintować otwory, aby włożyć ustalające z boku, aby utrzymać tulejki na miejscu. 
		Uwaga: Do tego celu można użyć dowolnego zacisku.</li>
		<li>Ustaw manipulator z precyzją submilimetrową, aby przesunąć światłowody (aparat stereotaktyczny lub inny precyzyjny mikromanipulator).</li>
		<li>Zamontuj stabilny uchwyt, aby ustawić mikrowtryskiwacz.</li>
		<li>Użyj stereoskopu, aby uwidocznić światłowody i krople jedwabiu.</li>
		<li>Ustaw źródło światła, aby oświetlić światłowody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sprzęt do powlekania okien czaszkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Wybierz dowolny pipetor P10.</li>
		<li>Zaopatrz się w pojemnik z pokrywką. 
		Uwaga: Sugerowany jest każdy pojemnik z silikonowym dnem - miękkie dno ułatwia podnoszenie okien czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sprzęt do przechowywania gotowych implantów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w małą (1-5 l) komorę próżniową.</li>
		<li>Upewnij się, że jest miejsce do przechowywania implantów w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zastosuj folię jedwabną/AAV do urządzeń
<ol>
	<li>Powlekanie światłowodów w celu sterowania ekspresją ogniskową na końcówce światłowodu
	<ol>
		<li>Przygotuj implanty przewlekłych włókien zgodnie z wcześniejszym opisem4.</li>
		<li>Przed użyciem przepłucz implanty etanolem, a następnie ultraczystą wodą, aby upewnić się, że światłowody są czyste. 
		Uwaga: Folie jedwabne bardziej niezawodnie przylegają do czystych powierzchni szklanych.</li>
		<li>Przygotuj urządzenie do przytrzymywania tulejek światłowodowych. W przypadku typowych okuć o średnicy 1,25 mm użyj bloku przezroczystego akrylu 1/4 cala z otworami ~1,3 mm i gwintowanymi dociskowymi wchodzącymi z boku, aby mocno osadzić implanty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Zamontuj uchwyt tulejki w aparacie stereotaktycznym (lub dowolnym roztworze manipulacyjnym z submilimetrową precyzją) wyposażonym w mikrowtryskiwacz. Umieść uchwyt tulejki nad mikrowtryskiwaczem i nałóż mieszaninę jedwabiu i AAV od dołu. 
		Uwaga: Dzieje się tak, ponieważ aplikacje dużych objętości od góry skutkowały jedwabiem/AAV, który nie był ograniczony do końcówki. Jednak nakładanie wielu małych sekwencyjnych objętości od góry lub od dołu może powodować powstawanie osadów AAV/jedwabiu, które są ograniczone do końcówki (chociaż wolimy nakładać od dołu).</li>
		<li>Wyciągnąć standardową pipetę do wstrzykiwań wewnątrzczaszkowych z kapilary ze szkła borokrzemianowego.
		<ol>
			<li>Aby ułatwić</li>
			<li>Aby uzyskać końcówkę iniekcyjną z czystą, płaską końcówką o pożądanej średnicy, należy trzymać po jednej pipecie w każdej ręce i użyć grubszej części stożka na jednej pipecie, aby naciąć drugą pipetę w żądanym miejscu pęknięcia.</li>
			<li>Delikatnie pocieraj w przód iw tył ruchem piłowania (metoda nacinania szkło na szkle).</li>
			<li>Po nacięciu pipety delikatnie dociśnij końcówkę naciętej pipety korpusem drugiej pipety, aby uzyskać czyste pęknięcie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw stereoskop tak, aby zapewnić wyraźny widok powierzchni światłowodu. 
		Uwaga: Powiększenie powinno być wystarczające, aby dokładnie ustawić pipetę iniekcyjną nad powierzchnią światłowodów.</li>
		<li>Włóż implanty światłowodowe do uchwytu stroną mózgową światłowodu skierowaną w dół.</li>
		<li>Napełnij pipetę iniekcyjną roztworem jedwabiu/AAV, tak jak w przypadku każdego standardowego wstrzykiwania wewnątrzczaszkowego5. Załaduj ilość wymaganą do liczby wykonywanych implantów plus ~30% więcej, aby zrekompensować straty spowodowane zatkaniem pipet. Na przykład, jeśli wykonywanych jest 10 implantów, załaduj depozyty o wartości 100 nL i wypłać ~1,3 μL. 
		Uwaga: Jedwab/AAV może wyschnąć na końcówce pipety pomiędzy wyrzutami, co może spowodować zatkanie pipety. Pipety o dużej średnicy (50-100 μm) są mniej podatne na zatkanie. Zatkane chodaki można usunąć, delikatnie szczotkując końcówkę pipety wilgotną chusteczką papierową lub wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
		<li>Manewruj pipetą iniekcyjną tak, aż dotknie lub prawie dotknie środka powierzchni światłowodu. Wyrzuć 10-20 nl roztworu jedwabiu/AAV. Wyjmij pipetę. 
		Uwaga: Szybkość dostarczania nie jest krytyczna, ale typowe dawki to 5-20 nL/s.</li>
		<li>Obserwuj bolus jedwabiu/AAV na płaskiej powierzchni, która wygląda jak płynna kopuła, która wysycha do płaskiego filmu w ciągu ~1 minuty (ryc. 1B).</li>
		<li>Powtarzaj kroki 4.1.9-4.1.10, aż do momentu nałożenia żądanej ilości jedwabiu/AAV (łącznie 20-200 nL dla większości zastosowań). Przygotowując wiele implantów, nałóż jedwab/AAV na jeden implant, a następnie przejdź do pokrycia innych implantów, zanim powrócisz do pierwszego.</li>
		<li>Odczekaj 1 godzinę do wyschnięcia przed przeniesieniem implantów.</li>
		<li>Odkurz osuszacz przez noc przy ~125 Torr (-25 cali). Hg), 4 °C. W tym celu należy umieścić cały uchwyt tulejki w komorze próżniowej.</li>
		<li>Oceń kształt i położenie powstałej warstwy jedwabiu pod mikroskopem o dużej mocy. Upewnij się, że folie są ograniczone do końcówki powierzchni światłowodu, są stosunkowo cienkie (>100 μm) i symetryczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		Uwaga: Duże lub asymetryczne folie jedwabne/AAV mogą odklejać się od włókna podczas implantacji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D). Najczęstszą przyczyną problemów jest stosowanie pojedynczych dużych woluminów, a nie sekwencyjne stosowanie wielu małych woluminów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie stożkowych światłowodów w celu sterowania ekspresją wzdłuż osi światłowodu
	<ol>
		<li>Uzyskać stożkowe implanty światłowodowe i wykonać kroki 4.1.2-4.1.8, z wyjątkiem tego, że stożkowe włókno jest ustawione bocznie tak, aby było prostopadłe do wtryskiwacza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Umieść wtryskiwacz nad stożkowym włóknem. 
		Uwaga: Ładowanie kropelek cieczy na stożkowe włókna stanowi dodatkowe wyzwanie, ponieważ napięcie powierzchniowe ma tendencję do powodowania, że kropelki przeskakują z powrotem na pipetę iniekcyjną lub migrują w górę stożkowego włókna. Mniejsze pipety iniekcyjne (o średnicy 30-50 μm) pomagają przezwyciężyć ten problem, ale zwiększają ryzyko zatkania pipety iniekcyjnej. Ze względu na napięcie powierzchniowe kropelki mają tendencję do przylegania do obszaru o największej powierzchni, więc optymalny rozmiar pipety iniekcyjnej zależy od wielkości stożkowego włókna i tolerancji na sporadyczne zatkanie.</li>
		<li>Umieść pipetę iniekcyjną jedwabiu/AAV przy boku światłowodu na początku stożka. Upewnij się, że pipeta iniekcyjna dotyka światłowodu.</li>
		<li>Wyrzuć 20 nL jedwabiu/AAV, aby rozpocząć proces powlekania. Upewnij się, że kropla przylega do światłowodu i pozostaje na granicy światłowodu/pipety. Delikatnie odchodź kropelkę w kierunku końca końcówki z włókna, gdy jedwab/AAV wyschnie (~45 s). Pipetę do wstrzykiwania należy utrzymywać w kontakcie z wysychającą kropelką, aby uniknąć zatkania końcówki pipety. 
		Uwaga: Każda osada powinna pokryć około 400 μm stożkowego włókna (<klasa wytrzymałości = "xfig" >rysunek 2B).</li>
		<li>Gdy pierwszy bolus wyschnie prawie całkowicie, wyrzuć kolejne 20 nL i kontynuuj odprowadzanie kropli wzdłuż stożka. 
		Uwaga: Płynny jedwab przylega do wysuszonego jedwabiu, zakotwiczając jeden koniec kropli, gdy pipeta porusza się wzdłuż stożka.</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.2.4, wyrzucając niewielkie ilości jedwabiu/AAV i stopniowo wciągając roztwór w górę zwężacza. 5-6 wyrzutów wystarczy, aby przejść przez powierzchnię stożka 2,5 mm.</li>
		<li>Aby uzyskać bardziej jednolitą ekspresję ze wszystkich stron włókna, obróć włókno i powtarzaj kroki 4.2.2-4.2.5, aż do nałożenia żądanej ilości jedwabiu/AAV.</li>
		<li>Jeśli zwisające pasmo suszonego jedwabiu/AAV wystaje poza końcówkę włókna, ostrożnie odetnij pasmo nożyczkami lub użyj pipety wyrzutowej, aby zgiąć pasmo z powrotem i przykleić je do stożka włókna.</li>
		<li>Odczekaj 1 godzinę do wyschnięcia przed przeniesieniem implantów.</li>
		<li>Osuszać próżniowo przez noc w temperaturze 4 °C. Cały uchwyt tulejki można umieścić w komorze próżniowej.</li>
		<li>Oceń kształt i położenie powstałej warstwy jedwabiu pod mikroskopem o dużej mocy. 
		Uwaga: Folie nie muszą być całkowicie jednolite, ale nie powinny mieć wybrzuszeń, które wystają poza powierzchnię włókna na więcej niż 100 μm, aby zminimalizować uszkodzenia otaczającej tkanki podczas implantacji (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3C). Aby zminimalizować rozmiar folii, bardzo ważne jest, aby każda kropla była całkowicie sucha przed powstaniem kolejnych osadów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie implantów soczewek GRIN
	<ol>
		<li>Pobierz soczewki GRIN 6,7 i powtórz kroki 4.1.2-4.1.8. Wtryskiwacz może być zamontowany powyżej.</li>
		<li>Osadzanie jedwabiu/AAV w jednym wyrzucie (1 μl dla soczewki o średnicy 1,0 mm). 
		Uwaga: W ten sposób powstanie kopuła płynu, która przylega do powierzchni soczewki i wysycha, tworząc jednolity film (o grubości 100-200 μm). Jednak w przypadku, gdy pojedynczy duży wyrzut wysycha nierównomiernie i tworzy film, który jest grubszy w pobliżu krawędzi soczewki GRIN, spróbuj umieścić wiele mniejszych kropel (100-200 nL) na środku powierzchni soczewki (pozwalając każdej kropli wyschnąć przed złożeniem następnej), aby upewnić się, że film będzie napędzał ekspresję w środku pola widzenia.</li>
		<li>Odczekaj 1 godzinę do wyschnięcia przed przeniesieniem implantów.</li>
		<li>Oceń kształt i położenie powstałej jedwabnej warstwy pod mikroskopem o dużej mocy, aby upewnić się, że folia pokrywa powierzchnię soczewki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie szklanych okien czaszkowych
	<ol>
		<li>Przygotuj szklane okna czaszkowe, przyklejając dwa okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 3 mm (grubość nr 1) do jednego okna o średnicy 5 mm za pomocą kleju optycznego (szczegóły patrz Goldey et al. 20148).</li>
		<li>Wymieszaj jedwab: wirus w stosunku 1:4, aby zmniejszyć całkowitą ilość jedwabiu w folii. Nadmierne ilości jedwabiu nie rozpuszczają się pod oknami czaszki po implantacji. Eksperymenty z miareczkowaniem mogą być wymagane w celu określenia proporcji i objętości, które dają pożądany profil ekspresji.</li>
		<li>Ręcznie odpipetować kroplę o pojemności 5 μl na powierzchnię szkiełka nakrywkowego o średnicy 3 mm (skierowanego w stronę mózgu). Kropla powinna rozciągnąć się na całą powierzchnię szkła (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Odczekaj 2-3 godziny do wyschnięcia przed przesunięciem okien.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przechowywanie implantów pokrytych jedwabiem/AAV
<ol>
	<li>Światłowody pokryte jedwabiem/AAV należy przechowywać w chłodzonym eksykatorze próżniowym (~125 Torr, 4 °C) przed użyciem (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
	<li>Nie przechowuj okien czaszkowych i soczewek GRIN w próżni, ponieważ duże folie jedwabne przechowywane w próżni nie rozpuszczają się całkowicie po implantacji. Okienka czaszkowe i soczewki GRIN należy wszczepić natychmiast po wyschnięciu lub w ciągu jednego dnia od produkcji, jeśli są przechowywane pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Wszczepianie urządzeń
<ol>
	<li>Przygotuj zwierzęta do operacji wszczepienia implantu zgodnie z wcześniejszym opisem4.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, znieczulij myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy/ksylazyny (100/10 mg/kg) i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą delikatnego uszczypnięcia palca u nogi. Ogol czaszkę w okolicy implantu i oczyść skórę głowy jodem i alkoholem.</li>
		<li>Zamontuj zwierzęta w urządzeniu stereotaktycznym i uzupełnij znieczulenie mieszaniną tlenu i izofluranu (1-2%). Wykonaj nacięcie w skórze głowy w obszarze zainteresowania i wykonaj kraniotomię wystarczająco dużą, aby pomieścić implant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implanty światłowodowe9 i soczewki mikroendoskopowe10 zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami. Z implantami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ osad jedwabiu/AAV może zostać strącony przez niedoskonałą kraniotomię lub przez zaczepienie się implantu o krawędź czaszki. Powoli zanurz implant w mózgu (~2 mm/min).</li>
	<li>Implant okien czaszki zgodnie z wcześniejszym opisem8. Nie dotykaj powlekanej strony okna i unikaj spłukiwania szyby płynem podczas wykonywania zgłębnika, ponieważ może to zmyć wirusa. Aby osiągnąć maksymalną ekspresję, wykonaj durotomię.</li>
</ol>
7. Ocena wyrażenia i rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Aby ocenić ekspresję białek ulegających ekspresji wirusa, odczekaj ~2-3 tygodnie, aby wirus kierował ekspresją, a następnie wykonaj perfuzję wewnątrzsercową z 4% paraformaldehydem w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej11 i przetwórz tkankę mózgową do mikroskopii fluorescencyjnej12.</li>
	<li>Oceń ekspresję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do zobrazowania wzorca ekspresji białek optogenetycznych znakowanych fluoroforem.</li>
	<li>Jeżeli poziom ekspresji jest niewystarczający, należy zwiększyć ilość wirusa w powłokach, zwiększając całkowitą objętość powłoki jedwabiu/AAV lub najlepiej stosując wirusa o wyższym mianie.</li>
</ol>

<ol><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004(2012).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194(2007).</li>
<li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+silk+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li>
<li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li>
<li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A%2FR+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie jedwabiu/AAV do ukierunkowanej ekspresji białek optogennych pozwala przezwyciężyć ograniczenia obecnie stosowanych podejść. Chociaż w wielu badaniach z powodzeniem stosuje się zastrzyki AAV do ekspresji białek optogenetycznych, trudno jest dostosować ekspresję do końcówki światłowodów, do obszarów wokół długości zwężających się włókien oraz do obszaru widzenia soczewki GRIN. Ze względu na niewspółosiowość między komponentami optycznymi i ekspresją optogenetyczną, zastrzyki stereotaktyczne mogą być zawodne, a...

Ostatnia dekada przyniosła eksplozję zmodyfikowanych białek światłoczułych do monitorowania i manipulowania aktywnością neuronalną1. Wirusy oferują niezrównaną elastyczność w wyrażaniu tych narzędzi optogenetycznych w mózgu. W porównaniu ze zwierzętami transgenicznymi, wirusy są znacznie łatwiejsze w produkcji, transporcie i przechowywaniu, co pozwala na szybkie wdrożenie najnowszych narzędzi optogenetycznych. Ekspresja może być genetycznie ukierunkowana na różne populacje neuronów, a wirusy zaprojektowane do transportu wstecznego mogą być nawet używane do celowania w ekspresję w oparciu o łączność neuronalną2.
Wirusy są zazwyczaj wprowadzane za pomocą zastrzyków stereotaktycznych, co może być czasochłonne i trudne. Precyzyjne ukierunkowanie na małe obszary może być trudne, podczas gdy kierowanie ekspresją na szerokich obszarach często wymaga wielu wstrzyknięć. Co więcej, gdy urządzenie optyczne jest następnie wszczepiane do mózgu w celu dostarczania światła in vivo, implant musi być odpowiednio ustawiony w stosunku do wstrzyknięcia wirusa. W tym miejscu opisujemy łatwą do wdrożenia metodę dostarczania wektorów wirusowych do tkanki wokół wszczepionego urządzenia za pomocą jedwabnych folii fibroinowych3. Fibroina jedwabiu jest dostępna na rynku, dobrze tolerowana przez tkanki nerwowe i może być wykorzystywana do produkcji materiałów o różnych właściwościach. Folie jedwabne można nakładać na implanty za pomocą zwykłego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak pipety do mikroiniekcji lub pipety ręczne. Folie jedwabne/AAV eliminują konieczność wykonywania dwóch zabiegów chirurgicznych i zapewniają, że ekspresja za pośrednictwem wirusa jest prawidłowo dopasowana do implantu optycznego. Wynikowa ekspresja jest ograniczona do końcówki włókien i powoduje mniej niepożądanej ekspresji wzdłuż ścieżki włókien niż wstrzyknięcia stereotaktyczne.
Oprócz wytwarzania ukierunkowanej ekspresji na czubku małych włókien, folie jedwabne/AAV mogą być używane do napędzania szeroko rozpowszechnionej (>3 mm średnicy) ekspresji korowej pod oknami czaszki. >Obrazowanie in vivo 2-fotonowe czujników aktywności fluorescencyjnej stało się nieodzownym narzędziem do oceny roli aktywności neuronalnej w sterowaniu przetwarzaniem sensorycznym i poznawczym. Jednak, aby uzyskać jednolitą ekspresję w szerokich obszarach kory mózgowej, eksperymentatorzy często wykonują wiele zastrzyków. Iniekcje te mogą być niezwykle czasochłonne i mogą prowadzić do niespójnego wyrażania w całym polu widzenia. W przeciwieństwie do tego, okna czaszkowe pokryte jedwabiem/AAV są niezwykle łatwe do wyprodukowania, znacznie skracają czas potrzebny na operacje, a przede wszystkim napędzają ekspresję setek mikronów poniżej powierzchni kory mózgowej.

<table><tbody><tr><td>Włóknina wodnego jedwabiu</td><td>Sigma</td><td>5154-20ML</td><td>Wodny jedwab fibroina (5% w/v) do wytwarzania folii</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz do osadzania jedwabiu/AAV</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td>Nanoject III nanolitrowy wtryskiwacz</td></tr><tr><td>Manipulator do trzymania implantów</td><td>Narashige</td><td>MM-33</td><td>Mikromanipulator</td></tr><tr><td>stereoskopowy do wizualizacji osadów jedwabiu</td><td>AmScope</td><td>SM-6TX-FRL</td><td>3,5X-45X Trójokularowy przegubowy mikroskop zmiennoogniskowy ze światłem pierścieniowym</td></tr><tr><td>Komora próżniowa do przechowywania implantów</td><td>Ablaze</td><td>N/A</td><td>3,5-litrowa komora odgazowywania próżniowego</td></tr><tr><td>Opcjonalnie, uchwyt implantu do przechowywania</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>Aby przechowywać gotowe światłowody, wywierć siatkę otworów o głębokości ~ 4 mm o średnicy nieco większej niż średnica tulejki w plastikowym bloku.</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>&Oslash; 200 i mikro; m Rdzeń Światłowód wielomodowy do implantów światłowodowych</td></tr><tr><td>Okucia</td><td>Kientec</td><td>FZI-LC-230</td><td>LC Tuleja cyrkonowa do implantów światłowodowych</td></tr><tr><td>Różne materiały do produkcji implantów z włókien przewlekłych</td><td>Różne</td><td>Nie</td><td>dotyczy Aby uzyskać szczegółowe procedury, patrz Ung K, Arenkiel BR. Implantacja światłowodowa do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej. Dziennik eksperymentów wizualizowanych: JoVE. 2012(68).</td></tr><tr><td>Implanty z włóknami stożkowymi</td><td>Optogenix</td><td>Lambda-B</td><td>Implanty z włóknami stożkowymi</td></tr><tr><td>Soczewki GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td><td>Soczewki GRIN Małe</td></tr><tr><td>szklane okna czaszkowe</td><td>Warner</td><td>64-0726 (CS-3R-0)</td><td>Małe okrągłe szkło nakrywkowe, grubość #0</td></tr><tr><td>Duże szklane okna czaszkowe</td><td>Warner</td><td>64-0731 (CS-5R-0)</td><td>Małe okrągłe szkło nakrywkowe, grubość</td></tr> <tr><td>#0Różne materiały do produkcji okien czaszkowych</td><td>Różne</td><td>nie</td> dotyczy <td>Aby uzyskać szczegółową procedurę, zobacz Goldey GJ i in. Zdejmowane okna czaszkowe do długoterminowego obrazowania u obudzonych myszy. Protokoły przyrodnicze. 2014 listopad; 9(11):2515.</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/aav

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Dążenie do zrozumienia, w jaki sposób obwody neuronowe przetwarzają informacje w celu kierowania wynikami behawioralnymi, zostało znacznie ułatwione przez niedawno opracowane metody optyczne do manipulowania i monitorowania aktywności neuronów in vivo. Tego typu eksperymenty opierają się na dwóch głównych elementach: 1) wszczepialnych urządzeniach, które zapewniają optyczny dostęp do mózgu, oraz 2) białkach wrażliwych na światło, które zmieniają pobudliwość neuronów lub zapewniają odczyt aktywności neuronalnej. Istnieje wiele sposobów ekspresji białek wrażliwych na światło, ale stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych jest obecnie najbardziej elastycznym podejściem, ponieważ ekspresję można kontrolować z precyzją genetyczną, anatomiczną i czasową. Pomimo dużej użyteczności wektorów wirusowych, dostarczenie wirusa do miejsca implantów optycznych wiąże się z licznymi wyzwaniami. Stereotaktyczne wstrzyknięcia wirusa wymagają operacji, które wydłużają czas operacji, zwiększają koszty badań i stanowią zagrożenie dla zdrowia zwierzęcia. Otaczająca tkanka może zostać fizycznie uszkodzona przez strzykawkę do wstrzykiwań oraz przez immunogenne zapalenie spowodowane nagłym dostarczeniem bolusa wirusa o wysokim mianie. Dopasowanie iniekcji do implantów optycznych jest szczególnie trudne, gdy celuje się w małe obszary głęboko w mózgu. Aby sprostać tym wyzwaniom, opisujemy metodę powlekania wielu typów implantów optycznych foliami składającymi się z fibroiny jedwabiu i wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV). Fibroina, polimer pochodzący z kokonu Bombyx mori, może kapsułkować i chronić biomolekuły i może być przetwarzana na formy od rozpuszczalnych filmów po ceramikę. Po wszczepieniu do mózgu, powłoki jedwabiu/AAV uwalniają wirusa na styku elementów optycznych i otaczającego mózgu, kierując ekspresję dokładnie tam, gdzie jest to potrzebne. Metoda ta jest łatwa do wdrożenia i obiecuje znaczne ułatwienie badań in vivo funkcji obwodów neuronalnych.

Aby ocenić skuteczność filmów jedwabnych/AAV w indukowaniu ekspresji, dokonano perfuzji zwierząt 2-3 tygodnie po implantacji i przygotowano skrawki mózgu z obszaru zainteresowania. Obrazy fluorescencyjne białek optogenetycznych znakowanych fluoroforem (ChR2-YFP) pozwoliły na pomiar zakresu ekspresji (Rycina 1D). Typowe światłowody (średnica 230 µm) mogą z łatwością pomieścić 200 nL jedwabiu/AAV. Dzięki praktyce eksperymentatorzy mogą osiągnąć wysoce niezawodn...

Tutaj prezentujemy metodę dostarczania wektorów ekspresji wirusa do mózgu za pomocą jedwabnych folii fibroinowych. Ta metoda pozwala na ukierunkowane dostarczanie wektorów ekspresyjnych za pomocą światłowodów pokrytych jedwabiem/AAV, światłowodów stożkowych i okien czaszkowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki systemowej. Na przykład w jaki sposób aktywność zespołów neuronalnych wspiera przetwarzanie sensoryczne i poznawcze w mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona dokładne celowanie białek optogenetycznych, takich jak rodopsyna Chan i GCaMP, do obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania, bez konieczności oddzielnej procedury wstrzykiwania wirusa.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ osadzanie jedwabiu i wirusa na małych implantach optycznych może wymagać pewnej wprawy, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Najpierw wymieszaj rozmrożony AAV i od pięciu do siedmiu do siedmiu punktów pięcioprocentowej wodnej fibroiny jedwabiu w stosunku jeden do jednego w 200-mikrolitrowej probówce do PCR. Delikatnie odpipetuj roztwór kilka razy, aby dokładnie wymieszać AAV i fibroinę.Aby zdeponować jedwab/AAV, należy załadować pipetę iniekcyjną ilością roztworu wymaganą do liczby wykonywanych implantów włóknistych plus około 30 procent więcej, aby zrekompensować straty spowodowane zatkaniem pipety. Następnie zamontuj uchwyt tulejki w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w mikrowtrys

in-vivo-targeted-expression-optogenetic-proteins-using-silkaav

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Dostarczanie genów za pomocą AAV w celu wizualizacji zaburzeń integralności błony siatkówki

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Poznaj metodę ukierunkowanej ekspresji białek optogenetycznych w mózgu ssaków przy użyciu folii jedwabiu/AAV. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie aktywności neuronalnej bez konieczności osobnych iniekcji wirusowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Przeglądaj więcej filmów