In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki systemowej. Na przykład w jaki sposób aktywność zespołów neuronalnych wspiera przetwarzanie sensoryczne i poznawcze w mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona dokładne celowanie białek optogenetycznych, takich jak rodopsyna Chan i GCaMP, do obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania, bez konieczności oddzielnej procedury wstrzykiwania wirusa.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ osadzanie jedwabiu i wirusa na małych implantach optycznych może wymagać pewnej wprawy, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Najpierw wymieszaj rozmrożony AAV i od pięciu do siedmiu do siedmiu punktów pięcioprocentowej wodnej fibroiny jedwabiu w stosunku jeden do jednego w 200-mikrolitrowej probówce do PCR. Delikatnie odpipetuj roztwór kilka razy, aby dokładnie wymieszać AAV i fibroinę.

Aby zdeponować jedwab/AAV, należy załadować pipetę iniekcyjną ilością roztworu wymaganą do liczby wykonywanych implantów włóknistych plus około 30 procent więcej, aby zrekompensować straty spowodowane zatkaniem pipety. Następnie zamontuj uchwyt tulejki w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w mikrowtryskiwacz. Umieść uchwyt tulejki nad mikrowtryskiwaczem i nałóż mieszaninę jedwabiu i AAV od dołu.

Manewruj pipetą iniekcyjną, aż dotknie lub prawie dotknie środka powierzchni światłowodu, a następnie wyrzuć od 10 do 20 nanolitrów roztworu jedwabiu/AAV. Następnie wyjmij pipetę. Następnie obserwuj bolus jedwabiu/AAV na płaskiej powierzchni, która wygląda jak płynna kopuła, która wysycha do płaskiego filmu w ciągu około jednej minuty.

Powtarzaj poprzednie kroki, aż zostanie osadzona żądana ilość jedwabiu/AAV. Przygotowując wiele implantów, nałóż roztwór jedwabiu/AAV na jeden implant, a następnie przejdź do powlekania innych implantów, zanim powrócisz do pierwszego. Po godzinie suszenia umieść cały uchwyt tulejki w komorze próżniowej i odkurz suszenie przez noc w temperaturze około 125 torów i czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia oceń kształt i położenie powstałej warstwy jedwabiu pod mikroskopem o dużej mocy. Upewnij się, że folie są ograniczone do końcówki powierzchni światłowodu, stosunkowo cienkie i symetryczne. W przypadku powlekania stożkowych światłowodów należy przyłożyć pipetę iniekcyjną do jedwabiu/AAV z boku światłowodu na początku stożka, upewniając się, że pipeta dotyka światłowodu.

Wyrzuć 20 nanolitrów jedwabiu/AAV, aby rozpocząć proces powlekania, upewniając się, że kropla przylega do światłowodu i pozostaje na granicy światłowodu i pipety. Delikatnie przechyl kroplę w kierunku końca końcówki z włókna, gdy jedwab/AAV wyschnie, i utrzymuj pipetę iniekcyjną w kontakcie z wysychającą kroplą, aby uniknąć zatkania końcówki pipety. Gdy pierwszy bolus prawie całkowicie wyschnie, wyrzuć kolejne 20 nanolitrów i kontynuuj odprowadzanie kropli wzdłuż stożka.

Powtórz poprzedni krok, wyrzucając niewielkie ilości jedwabiu/AAV i stopniowo susząc roztwór z boku stożka. Po wysuszeniu oceń kształt i położenie powstałego filmu jedwabiu pod mikroskopem o dużej mocy. W przypadku powlekania implantów soczewek GRIN należy umieścić jedwab/AAV w jednym wstrzyknięciu na implancie soczewki GRIN.

Po wyschnięciu oceń kształt i położenie powstałej warstwy jedwabiu pod mikroskopem o dużej mocy, aby upewnić się, że folia pokrywa powierzchnię soczewki. W przypadku powlekania szklanych okien czaszkowych należy ręcznie odpipetować pięciomikrolitrową kroplę jedwabiu/AAV na powierzchnię trzymilimetrowego okrągłego szkiełka nakrywkowego, tak aby kropla rozproszyła się i pokryła całą powierzchnię szkła. Po wyschnięciu należy przechowywać włókna światłowodowe pokryte jedwabiem/AAV w chłodzonym eksykatorze próżniowym w temperaturze 125 torów i czterech stopniach Celsjusza przed wszczepieniem urządzeń.

Obrazy fluorescencyjne białek optogenetycznych znakowanych fluoroforem dostarczyły miary zakresu ekspresji warstw jedwabiu / AAV, a typowe światłowody mogą z łatwością pomieścić 200 nanolitrów jedwabiu / AAV. Dzięki praktyce eksperymentatorzy mogą osiągnąć wysoce wiarygodną ekspresję wokół końcówki wszczepionych włókien. Dwa możliwe problemy z powlekanymi oknami czaszkowymi to niewystarczająca ekspresja i jedwabne folie, które nie rozpuszczają się i zasłaniają pole widzenia.

Aby zwiększyć ekspresję, można wykonać durektomię przed wszczepieniem okienka i/lub zwiększeniem ilości wirusa w filmie. Najlepszą ekspresję osiągnięto przy użyciu mieszaniny od jednego do czterech jedwabiu i miana AAV. Ilość jedwabiu w powlekanych oknach jest od 10 do 100 razy większa niż na implantach z włókien, a folia jest mniej osadzona w tkance, a zatem może nie być narażona na ten sam poziom aktywności proteolitycznej, który może rozpuszczać jedwabne folie.

Jednak obecność jedwabiu jest niezbędna do uzyskania wyrazu pod oknami, prawdopodobnie dlatego, że film wykonany z samego wirusa jest zmywany przez płyn śródmiąższowy podczas operacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować i przechowywać implanty pokryte jedwabiem w opisany przez nas sposób. Niewłaściwe przechowywanie może zmienić właściwości folii jedwabiu lub zmniejszyć skuteczność wektorów ekspresji wirusa.

Technika ta może być bardzo przydatna dla naukowców zajmujących się neuronauką systemową w celu zbadania, w jaki sposób aktywność neuronalna napędza przetwarzanie sensoryczne i poznawcze w mózgach ssaków, takich jak myszy, szczury, a nawet naczelne. Nie zapominaj, że praca z wektorami ekspresji wirusów może być niebezpieczna, a środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, gogle i fartuchy laboratoryjne, powinny być zawsze noszone podczas pracy z wirusem związanym z adenowirusem.