Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Metoda ta rozszerza nanotechnologię DNA z materiałów źródłowych liniowego oligonukleotydu (DAS) na bardziej koliste DAS. Głównymi zaletami tych technicznych jest to, że są proste, solidne i niedrogie dla większości laboratoriów. W celu oczyszczenia kolistego DNA dodać 20 mikrolitrów formamidu do roztworu świeżo przygotowanego, nienaruszonego kolistego DNA, do końcowej objętości 140 mikrolitrów z mieszaniem.

Załaduj od 16 do 20 mikrolitrów okrągłego roztworu DNA do każdego z siedmiu do dziewięciu denaturujących dołków żelowych PAGE. Wymieszaj dwa mikrolitry barwnika ładującego z ośmioma mikrolitrami odpowiedniego liniowego DNA prekursora i wstrzyknij mieszaninę do oddzielnej studzienki referencyjnej. Następnie uruchom żel przez około dwie godziny przy napięciu 10 woltów na centymetr, zatrzymując bieg, gdy ksylen-cyjanol FF można zaobserwować około dwóch trzecich żelu.

Zakładając gumowe rękawice i okulary, przenieś żel na fluorescencyjną płytkę chromatografii cienkowarstwowej i użyj żyletki, aby odciąć docelowe pasma żelu, tak jak są zacienione przez promieniowanie UV. Umieść opaski żelowe w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej w celu wysuszenia, a następnie zetrzyj wysuszone żele na pastę i dodaj wodę dejonizowaną o podwójnej objętości żelu, aby wytrząsnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka przefiltruj mieszaninę do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej, przepłukując boki pierwszej probówki niewielką ilością zdejonizowanej wody, aby odzyskać resztki DNA, i ponownie filtrując, aby połączyć supernaty.

Następnie oczyść koliste DNA poprzez wytrącanie etanolu i przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W przypadku wyżarzania w jednym doniczku wymieszaj dwa mikrolitry 10-krotnego buforu magnezowego EDTA z octanu Tris, jeden mikrolitr każdego 10-mikromolowego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor Tris EDTA w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, do końcowej objętości 20 mikrolitrów. Następnie wyżarzaj roztwór montażowy w butelce termicznej od 95 do 25 stopni Celsjusza, przez 48 godzin.

W przypadku dwuetapowego wyżarzania nieskończonych sieci należy wymieszać dwa mikrolitry 10-krotnego buforu magnezowego EDTA z octanu Tris, jeden mikrolitr każdego 10-mikromolowego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor Tris EDTA w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, do końcowej objętości 20 mikrolitrów. W pierwszym etapie wyżarzania podpłytkowego należy wyżarzać każdy roztwór prekursora podpłytkowego w termocyklerze PCR, stosując szybką metodę chłodzenia liniowego od 95 do 25 stopni Celsjusza, przez dwie i pół godziny. Aby przygotować roztwór montażowy, dla każdej z czterech nieskończonych sieci, wymieszaj ze sobą 10 mikrolitrów każdego z dwóch odpowiednich roztworów podpłytkowych, do końcowego stężenia 0,25 mikromola dla każdej nici.

W drugim etapie wyżarzania sieciowego wyżarzaj mieszaninę o objętości 20 mikrolitrów w termocyklerze PCR, stosując metodę powolnego chłodzenia. W przypadku dwuetapowego wyżarzania dwóch skończonych prostokątnych sieci należy wymieszać jeden mikrolitr 10-krotnego buforu magnezowego EDTA z octanu Tris, 0,5 mikrolitra każdego 10-mikromolowego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor Tris EDTA w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, do końcowej objętości 10 mikrolitrów. W pierwszym etapie wyżarzania wyżarzaj każdy roztwór podpłytkowy prekursora w termocyklerze PCR, stosując metodę szybkiego chłodzenia liniowego, jak pokazano, od 95 do 25 stopni Celsjusza przez dwie i pół godziny, a następnie wymieszaj wyżarzone 32 roztwory podpłytkowe, każdy o pojemności 2 mikrolitrów, razem w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, do końcowej objętości 64 mikrolitrów.

Następnie, w drugim etapie wyżarzania, wyżarzaj mieszaninę o pojemności 64 mikrolitrów w termocyklerze, stosując metodę powolnego chłodzenia, jak pokazano. Do elektroforetycznego oczyszczania sieci skończonych należy przygotować natywny 2% żel agarozowy i załadować 20 mikrolitrów skończonego roztworu sieci do każdej studzienki, wraz z dodaniem 5 mikrolitrów drabinki DNA o długości od 100 do 3000 par zasad, do oddzielnej studzienki. Po przeprowadzeniu żelu przez dwie godziny pod napięciem 5 woltów na centymetr w lodowatej kąpieli wodnej, przeciąć docelowe pasma żelu mniej więcej na poziomie znacznika 1000 par zasad w świetle UV, jak pokazano, i pokrój pasma żelu na drobne kawałki.

Umieść pokruszone żele w kolumnie filtracyjnej i odwiruj kolumnę, aby wyekstrahować sieci. Następnie zbierz roztwór do obrazowania pod mikroskopią sił atomowych. W celu skończonego oczyszczania sieciowego za pomocą glikolu polietylenowego lub PEG, należy wymieszać 50 mikrolitrów roztworu sieci o skończonej objętości z równą objętością 15% buforu PEG 8000, odwirować roztwór i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu PEG w celu dodatkowego odwirowania.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w buforze magnezowym Tris acetate EDTA, do obrazowania mikroskopii sił atomowych. Aby uzyskać nieskończone obrazowanie mikroskopu sił atomowych 2D w sieci, odetnij świeżą warstwę miki i umieść dwa mikrolitry wyżarzonej próbki na czystej powierzchni. Pozwól, aby sieci DNA wchłonęły się do powierzchni miki, przed dwukrotnym umyciem powierzchni 100 mikrolitrami wody dejonizowanej na pranie, susząc powierzchnię sprężonym powietrzem po drugim myciu.

Aby uzyskać obrazy mikroskopu sił atomowych nieskończonych sieci DNA w powietrzu, otwórz tryb stukania w oprogramowaniu do obrazowania i ustaw rozmiar skanu na 0,5 do pięciu mikrometrów, rozdzielczość skanowania na 512 linii, a szybkość skanowania od jednego do 3,5 Hz. Następnie zeskanuj powierzchnię miki za pomocą trójkątnych sond mikroskopu sił atomowych. W przypadku obrazowania skończonych sieci DNA, odetnij świeżą warstwę miki, jak pokazano, i umieść 80 mikrolitrów jednokrotnego buforu magnezowego EDTA z octanu Tris na czystej powierzchni miki.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów skończonych próbek do buforu i pozwól sieciom DNA na dwie minuty wchłonąć się do powierzchni miki, zanim dodasz kolejne 50 mikrolitrów buforu magnezowego EDTA octanu Tris do sondy. Następnie ustaw rozmiar skanowania na 0,5 do jednego mikrometra, rozdzielczość skanowania na 256 linii, a szybkość skanowania na 1,5 Hz, przed zeskanowaniem powierzchni za pomocą trójkątnych sond, jak pokazano. Koliste DNA porusza się nieco wolniej niż jego prekursor liniowy DNA w denaturującym PAGE, ponieważ pory wewnątrz kolistego DNA są penetrowane i opóźniane przez włókna żelowe.

Okrągłe rodziny zespołów nukleotydowych z 64 mają tylko jeden przezroczysty i czysty pasek dla każdego zespołu, co potwierdza stabilność ich motywów monomerów. Okrągłe rodziny płytek składających 84 nukleotydy mają jednak smugi wokół swoich głównych pasm, co wskazuje na obecność drobnych produktów ubocznych. Niezależnie od drobnych produktów ubocznych nieprawidłowych asocjacji, z docelowych motywów monomerów można złożyć doskonałe sieci o wysokiej wydajności.

Każdy zespół ma swoje własne cechy morfologiczne w skali mikrometrycznej, takie jak nanodruty, nanorurki, nanospirale, nanowstążki i nanoprostokąty. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby unikać w szczególności zanieczyszczenia gruzem podczas lub poza stopniami. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę dla badań w dziedzinie nanotechnologii DNA w celu zbadania nowych członków rodziny niektórych bardziej cyrkularnych nanotechnologii DNA.