Name: Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Poznaj metodę konia trojańskiego Ustilago maydis do dostarczania białek kukurydzianych in situ w liście, kwiatostany i kłosy. Technika ta umożliwia badanie funkcji białek i przebiegu infekcji z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Thomasowi Dresselhausowi, Martinowi Parniske, Noureddine Djella i Arminowi Hildebrandowi za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej i materiału roślinnego. Pierwotne prace nad metodą konia trojańskiego były wspierane przez stypendium podoktorskie Leopoldina i projekt NSF IOS13-39229. Prace przedstawione w tym artykule były wspierane przez SFB924 (projekty A14 i B14) DFG.

1. Budowa konia trojańskiego U. maydis
UWAGA: Zobacz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Amplifikacja interesującego genu z cDNA kukurydzy przy użyciu starterów specyficznych dla genu i polimerazy DNA z korektą. Sklonuj podstawowy produkt PCR i przekształć konstrukt w E. coli zgodnie z instrukcjami dostawcy plazmidu. Sprawdź poprawność sekwencji genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą sekwencjonowania Sangera przed użyciem do następnych etapów klonowania. 
	nuta: Specyfikacje PCR muszą być zoptymalizowane ze względu na specyficzność sekwencji starterów i optymalne warunki reakcji polimerazy DNA.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji genu kukurydzy będącego przedmiotem zainteresowania bez sekwencji kodującej peptyd sygnałowy (SP).</li>
	<li>Przedłuż 5' koniec podkładu odwrotnego z motywem RSIATA i miejscem cięcia NcoI (Tabela 1).</li>
	<li>Amplifikować gen kukurydzy za pomocą polimerazy DNA z korektą przy użyciu konstruktu PCR wygenerowanego w 1.1 jako matrycy PCR.</li>
	<li>Podwójnie trawić produkt PCR i plazmid transformacyjny U. maydis, p123-PUmpit2-Sp Umpit2-Zm mac1-mCherry-Ha">15, za pomocą XbaI i NcoI. Oczyść strawiony produkt PCR i plazmid.</li>
	<li>Związać strawiony produkt PCR do matrycy p123-PUmpit2-Sp Umpit2-Zm mac1-mCherry-Ha przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta. Przekształć produkt ligacji w E. coli i zweryfikuj prawidłową sekwencję genu zainteresowania za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	<li>Linearyzuj gen p123-PUm pit2-Sp Um pit2-Zm of interest-mCherry-Ha za pomocą enzymu restrykcyjnego SspI i przekształć DNA w solopatogenny szczep U. maydis SG20016. Wyizoluj transformanty U. maydis przez selekcję karboksyny i potwierdź izolowane transformanty za pomocą analizy Southern blot16. 
	nuta: Dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania należy wyizolować i przeanalizować co najmniej trzy niezależne transformanty U. maydis w celu oszacowania wszelkich efektów fenotypowych losowych mutacji tła.</li>
</ol>
2. Pożywki hodowlane
<ol>
	<li>Przygotuj płynne podłoże YEPSlight 16: 1,0% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 0,4% (w/v) baktopeptonu i 0,4% (w/v) sacharozy. Rozpuścić wszystkie składniki w ddH2O i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.</li>
	<li>Przygotuj agar ziemniaczany z dekstrozą (PD-agar)20: 3,9% (w/v) agar z dekstrozą ziemniaczaną i 1,0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (f.c. 0,01 M). Wymieszaj wszystkie składniki bezpośrednio w butelce do autoklawowania i dodaj ddH2O plus mieszadło magnetyczne. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.</li>
	<li>Przygotuj PD-Charcoal agar20: 3,9% (w/v) agaru z dekstrozą ziemniaczaną, 1% (w/v) węgla drzewnego i 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (f.c. 0,01 M). Wymieszaj wszystkie składniki bezpośrednio w butelce do autoklawowania i dodaj ddH2O plus mieszadło magnetyczne. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.</li>
</ol>
3. Infekcja roślin
<ol>
	<li>Należy wcześniej przeprowadzić analizę podziału komórek kukurydzy w odpowiedzi na białko dostarczone przez konia trojańskiego (np. zliczanie komórek w oparciu o mikroskopię). Proliferacja komórek kukurydzy wywołana przez U. maydis, a następnie tworzenie się nowotworu rozpoczyna się około 4-5 dni po zakażeniu. Ilościowa ocena choroby jest zależna od tkanki i powinna być wykonywana od 6 do 14 dni po zakażeniu. 
	nuta: Poszczególne odmiany kukurydzy wykazują różny poziom podatności na zakażenie U. maydis. Kukurydza cvs. W23, A188, Gaspe flint, Early Golden Bantam czy Va35 wykazują podatność na ten patogen i dlatego są odpowiednimi odmianami do badań nad koniem trojańskim.</li>
	<li>Przygotowanie inokulum U. maydis
	<ol>
		<li>Włączenie szczepu progenitorowego SG200 jako kontroli negatywnej do wszystkich eksperymentów z końmi trojańskimi w celu oszacowania skutków ubocznych zakażenia szczepem transgenicznym. W tym przypadku użyj szczepu U. maydis wyrażającego niewydzielaną wersję białka będącego przedmiotem zainteresowania jako kontrolę negatywną. Jednak ze względu na praktyczność (np. większe badania przesiewowe) szczep progenitorowy może być łatwiejszym wyborem kontroli.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu oszacuj, jakie ilości kultury infekcji są potrzebne. Należy pamiętać, że zakażenie każdej rośliny wymaga 1 - 1,5 ml zawiesiny U. maydis w zależności od rodzaju tkanki kukurydzy. 
		nuta: Około 1 ml kultury na noc wystarcza do rozcieńczenia do OD600 0,2 w 20 mllekkiej pożywki YEPS, a 25 ml kultury U. maydis z OD600 0,8-1,0 jest wystarczające do zakażenia 13-16 roślin.</li>
		<li>Zeskrobać U. maydis z płytki agarowej PD za pomocą sterylnej pipety Pasteura, zaszczepić w 5 mllekkiej pożywki YEPS i pozwolić kulturze rosnąć w temperaturze 28 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 16 godzin.</li>
		<li>Przed zakażeniem należy zbadać kulturę inokulacji U. maydis za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej pod kątem prawidłowego wzrostu i zanieczyszczenia bakteryjnego przy 400-krotnym powiększeniu. 
		nuta: W odpowiedniej kulturze widoczny jest tylko grzyb w kształcie cygara (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Zmieszać 900 μl świeżegoświatła YEPS ze 100 μl nocnej hodowli i zmierzyć OD600 przy użyciupożywki świetlnej YEPS jako ślepej próby w analizie spektrofotometru.</li>
		<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc świeżąlekką pożywką YEPS do OD600 0,2 i pozwolić kulturze rosnąć w temperaturze 28 °C z ciągłym wstrząsaniem przy 200 obr./min, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu wskazanej przez OD600 nm 0,8-1,0, 
		UWAGA: W tych warunkach komórki U. maydis namnażają się co 2 godziny, a więc pożądany OD600 osiąga się po 4-5 godzinach hodowli.</li>
		<li>Zebrać komórki przy OD600 0,8-1,0, wirując z prędkością 3,000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Umyj osad komórkowy jeden raz za pomocą ddH2O. W tym celu dodać jedną objętość kultury ddH2O, wirować z 3000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w ddH2O za pomocą szklanej pipety o pojemności 20 ml, dostosowując w ten sposób końcową wartość OD600 do 3,0 (dla testu na koniu trojańskim) lub 1,0 (dla oceny choroby).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja konia trojańskiego: w roślinie wydzielanie białka fuzyjnego kukurydzy
	<ol>
		<li>Zainfekuj siewki kukurydzy szczepem konia trojańskiego17.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie mikroskopowe zakażonych siewek po 2-3 dniach od zakażenia za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. W tym celu należy wyciąć prostokątny kawałek liścia 1 cm poniżej punktu wstrzyknięcia, umieścić próbkę na szkiełku mikroskopowym i dodać kroplę ddH2O. Aby uwidocznić białko fuzyjne mCherry, należy wzbudzić próbkę przy λ= 561 nm i zarejestrować emisję przy λ= 580 - 630 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie dorosłych liści kukurydzy
	<ol>
		<li>Uprawiać rośliny kukurydzy do stadium dojrzałych liści (gdy co najmniej 7 liści wyrasta w łodydze). 
		nuta: Faza ta osiągana jest po czterech tygodniach od siewu w warunkach szklarniowych 14 godzin, 28 °C w dzień/10 godzin, 22 °C w rytmie nocnym odmiany W23. Czas trwania może się różnić w zależności od odmiany kukurydzy i warunków szklarniowych.</li>
		<li>Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20G x 1.</li>
		<li>Ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować tkankę merystemu w łodydze. Podstawę merystemu można odróżnić po przejściu od twardszej łodygi do bardziej miękkiej tkanki.</li>
		<li>Zaznacz merystem na łodydze za pomocą długopisu.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1,5 ml kultury U. maydis 1 cm powyżej merystema pędu lub merystema kwiatostanowego.</li>
		<li>Oceń objawy choroby po 6 i 12 dniach od zakażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie frędzli
	<ol>
		<li>Uprawiaj rośliny kukurydzy aż do osiągnięcia fazy frędzli. 
		nuta: Szczegółowe kalendarium rozwoju pylników i frędzli w odmianie kukurydzy. W23 był wcześniej opisany 18,19. Frędzle zawierające pylniki pre-mejotyczne są bardzo podatne na zakażenie U. maydis; W odmianie kukurydzy Frędzle W23 są wielkości 4 - 7 cm.</li>
		<li>Ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować frędzel w łodydze.</li>
		<li>Zaznacz końcówkę i podstawę frędzla na łodydze za pomocą długopisu.</li>
		<li>Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20G x 1.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1,5 ml inokulum wokół frędzla. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum, powoli umieść po 0,5 ml na końcówce, środkowej części i podstawie frędzla zaznaczonej pisakiem.</li>
		<li>Oceń objawy choroby po 10 dniach od zakażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie uszu 
	UWAGA: Rozwój tkanek ucha różni się w zależności od różnych odmian kukurydzy i warunków szklarniowych i musi być uważnie obserwowany przed inokulacją. Uszy zaczynające wyrastać z jedwabiu są bardzo podatne na zakażenie U. maydis.
	<ol>
		<li>Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20 G x 1.</li>
		<li>Wstrzyknąć igłę do zaszczepiania w przestrzeń między liśćmi łuski tak głęboko, jak to możliwe, nie uszkadzając ucha.</li>
		<li>Uwolnij 1,5 ml inokulum wokół ucha.</li>
		<li>Wyjąć strzykawkę z igłą i ostrożnie wmasować kolbę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór U. maydis.</li>
		<li>Oceń objawy choroby po 14 dniach od zakażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzić żywotność inokulum U. maydis
	<ol>
		<li>Upuść 10 μl inokulum na płytkę z agarem z węgla drzewnego PD i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 dni. 
		nuta: Jeśli odpowiednia kultura U. maydis jest w stanie tworzyć włókna, widoczna staje się puszysta, biała grzybnia (<silna klasa="xfig">Rysunek 5)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowoczesne badania nad uprawami wymagają protokołów analizy molekularnej na poziomie genetycznym i białkowym. Dostępność genetyczna poprzez transformację jest niedostępna lub jest nieefektywna i czasochłonna w przypadku większości gatunków roślin uprawnych, takich jak kukurydza. Co więcej, wiarygodne narzędzia genetyczne, takie jak systemy reporterowe promotorów, są rzadkie, co utrudnia badanie funkcji białek in situ z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych miejscach tkanki. Białka apoplastyczne możn...

Biotroficzny patogen Ustilago maydis jest czynnikiem wywołującym chorobę pleśni kukurydzianej1. Infekuje wszystkie nadziemne części kukurydzy, powodując powstawanie dużych guzów, które zawierają melanizowane, czarne zarodniki. Szacuje się, że na poziomie globalnym U. maydis powoduje roczną utratę około 2% plonów kukurydzy, podczas gdy nowotwory są cenione jako gastronomiczny przysmak w Meksyku. Infekcja roślin jest inicjowana przez appressorium, które wydziela enzymy lizujące ścianę komórkową, aby wniknąć do pierwszej warstwy komórek naskórka kukurydzy. Z pierwotnego miejsca infekcji U. maydis rośnie wewnątrzkomórkowo i międzykomórkowo, atakując od jednej do dwóch warstw komórek każdego dnia1,2. Udana infekcja powoduje przerost roślin, który przekształca się w widoczne guzy po pięciu dniach od infekcji1,3,4. Podczas wszystkich etapów infekcji strzępki grzybów wnikają w błonę cytoplazmy rośliny bez bezpośredniego kontaktu z cytoplazmą gospodarza1,2. Ciasna przestrzeń apoplazmatyczna między infekującymi strzępkami a błoną plazmatyczną rośliny jest uważana za miejsce interakcji gospodarz/patogen, zwane strefą interakcji biotroficznej. W celu pokonania wrodzonego układu odpornościowego rośliny, U. maydis wydziela szereg białek efektorowych do strefy interakcji biotroficznej1. Niektóre efektory są pobierane przez komórki roślinne, podczas gdy inne pozostają w strefie interakcji biotroficznej5,6,7,8. Jednym z efektorów apoplastycznych jest UmPit2, który oddziałuje z apoplastycznymi proteazami kukurydzy, aby zapobiec uwalnianiu peptydu sygnałowego ZmZIP1 z ZmPROZIP przez aktywność proteazy apoplastycznej9,10.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci U. maydis stał się nie tylko modelem genetyki grzybów w interakcji roślina-patogen, ale także cennym narzędziem w biotechnologii ze względu na dobrze poznany cykl życia, łatwą dostępność genetyczną i heterologiczną ekspresję wydzielanych białek11,12,13. Określono sygnały zarówno dla konwencjonalnego, jak i niekonwencjonalnego wydzielania białek, co pozwala na kontrolę modyfikacji potranslacyjnych14. Ostatnio U. maydis został wykorzystany jako koń trojański do badania małych, wydzielanych białek kukurydzy in situ15. Podejście oparte na koniu trojańskim zostało z powodzeniem wykorzystane do analizy funkcji małego, wydzielanego białka ZmMAC1, które bierze udział w rozwoju innych. ZmMAC1 indukuje podział peryklinalny komórek pluripotencjalnych i specyfikację losu komórek nowo powstałych komórek15. Tą samą metodą ujawniono biologiczną funkcję peptydu ZmZIP1 związanego z uszkodzeniem kukurydzy. Wydzielanie przez U. maydis kukurydzy ZmZIP1 spowodowało upośledzenie tworzenia guza10. W związku z tym podejście oparte na koniu trojańskim stanowi cenną alternatywę dla badań białek in situ o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, która nie wymaga generowania stabilnych linii transformacji kukurydzy ani infiltracji tkanek heterologicznie wyrażonymi i oczyszczonymi białkami. W szczególności strategia konia trojańskiego umożliwia wydzielanie dowolnego heterologicznego białka do apoplastu kukurydzy i bezpośrednie porównanie zakażonych i niezakażonych komórek roślinnych w tej samej tkance.
Ten protokół ilustruje główne kroki do wygenerowania szczepu konia trojańskiego U. maydis w celu zbadania interesującego białka. Ponadto zawiera dokładne informacje na temat procedur infekcji trzech różnych typów tkanek kukurydzy (dorosłe liście, frędzle i kłosy) U. maydis, co jest warunkiem wstępnym do badania progresji infekcji czasoprzestrzennej i funkcji białek w tych tkankach docelowych. Nie podano dalszych specyfikacji dotyczących amplifikacji genów kukurydzy i technik obrazowania mikroskopowego, ponieważ etapy te są specyficzne dla celu i zależne od instrumentu. W związku z tym protokół ten jest skierowany do doświadczonych użytkowników standardowych technik biologii molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 2 ml&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 igła podskórna</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA z kukurydzy</td><td></td><td></td><td>z tkanki kukurydzy wyrażającej gen zainteresowania</td></tr><tr><td>Węgiel drzewny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop</td><td></td><td></td> skaningowy <td>wykorzystuje lokalnie dostępny sprzęt</td></tr><tr><td>Kuweta (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-wytrząsarka ustawiona na 28 &deg; C, 200 obr./min</td><td></td><td></td><td>korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny z 400-krotnym powiększeniem</td><td></td><td></td><td>korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura (szklana, długa końcówka)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>można wymienić na inne podstawowe wektory klonowania, takie jak pENTR lub pJET</td></tr><tr><td>Agar ziemniaczany i dekstroza&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Pen</td><td></td><td></td><td>używać lokalnie dostępnego sprzętu</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>używać lokalnie dostępnego sprzętu</td></tr><tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Zainspirowani mitem o koniu trojańskim Homera, zaprojektowaliśmy patogen kukurydzy Ustilago maydis, aby dostarczał wydzielane białka do apopplastu kukurydzy, umożliwiając analizę fenotypową in vivo. Metoda ta nie opiera się na transformacji kukurydzy, ale wykorzystuje genetykę drobnoustrojów i zdolności wydzielnicze patogenów. W ten sposób umożliwia inspekcję in vivo wydzielanych białek dostarczanych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych rodzajach miejsc infekcji i tkanek. Strategia konia trojańskiego może być wykorzystana do przejściowego uzupełniania fenotypów utraty funkcji kukurydzy, do funkcjonalnego charakteryzowania domen białkowych, do analizy efektów białkowych poza celem lub do badania przedawkowania białka po stronie kukurydzy, co czyni ją potężnym narzędziem do badań białek w systemie uprawy kukurydzy. Praca ta zawiera dokładny protokół generowania szczepu konia trojańskiego, a następnie standardowe protokoły infekcji w celu zastosowania tej metody do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Konstrukcje dla U. maydis Doświadczenia typu koń trojański są klonowane do plazmidu p123-PUmpit2-SpHmpit2-gen zainteresowania-mCherry-HaBadany gen kukurydzy jest połączony z mCherry reporter fluorescencyjny i epitop Kwas hialuronowy-tag. Ekspresja białka fuzyjnego znajduje się pod kontrolą U. maydis Hmpit2 promotor aktywowany specyficznie podczas infekcji<s...

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Badanie procesów na poziomie genetycznym i białkowym ma kluczowe znaczenie w badaniach nad roślinami. Nasze podejście umożliwia kontrolę wydzielanych białek labiryntu z najwyższą rozdzielczością przestrzenną czasową po różnych stronach infekcji i tkankach. Metoda konia trojańskiego bada przydatne możliwości automatycznego wydzielania.Pozwala to uniknąć czasochłonnych i trudnych transformacji labiryntu oraz ułatwia szczegółowe badania nad wydzielanymi białkami w labiryncie. Szczegółowe informacje na temat prawidłowego porażenia dodanych liści labiryntu, frędzli i kłosa. I pokazuje udane badanie progresji infekcji i funkcji białka w tkance docelowej.Procedurę zademonstruje Isabell Fiedler, doktorantka z laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, zeskrob Eumadous z płytki pediatrycznej za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zaszczepić 5 mililitrów lekkiej pożywki YEPS za pomocą Eumadous.Uprawiaj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza, stale wstrząsając przy 200 obr./min przez 16 godzin. Następnego dnia wymieszaj 900 mikrolitrów świeżego YEPS Light ze 100 mikrolitrami nocnej kultury. Zmierz OD-600 za pomocą YEPS Light Medium jako ślepej próby w analizie spektrofotometru.Rozcieńczyć nocną kulturę świeżym lekkim podłożem YEPS do OD-600 2. Pozwól kulturze rosnąć w temperaturze 28 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przy 200 obr./min, aż osiągnie fazę wzrostu środkowej logarytmy, wskazywaną przez OD-600 od 8 do 1,0. Po inkubacji zbierz komórki, obracając je w tempie 3000 razy chi przez 10 minut.Odrzucić supernatant. Następnie przemyj pilette komórkową jeden raz 1 objętością kultury DDH2O. Obracaj komórki w 3000 razy chi przez 10 minut i wyrzuć supernatant.Następnie ostrożnie ponownie zawiesić pilet komórkowy w DDH2O, używając szklanej pipety o pojemności 20 mililitrów. W ten sposób dostosowuje się końcowy OD-600 do 3,0 dla testu konia trojańskiego lub 1,0 dla oceny choroby. Uprawiaj rośliny labiryntu do stadium dorosłych liści, w którym co najmniej liść 7 rośnie w łodydze.Następnie przenieś kulturę Eumadous do 3-mililitrowej strzykawki z igłą podskórną o rozmiarze 20 rozmiarów. Ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować lustrzaną tkankę łodygi. Podstawę łodygi Mirror można odróżnić po przejściu od twardszej łodygi do bardziej miękkiej tkanki.Zaznacz trzpień lustra na łodydze za pomocą długopisu. Wstrzyknij 1,5 mililitra kultury Eumadous 1 centymetr powyżej łodygi lustra pędu lub łodygi lustrzanej kwiatostanu. Gdy rośliny labiryntu osiągną etap frędzli, ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować frędzel w łodydze.Zaznacz końcówkę i podstawę frędzla na łodydze za pomocą długopisu. Przenieś kulturę Eumadous do 3-mililitrowej strzykawki z 20 G bi jedną igłą podskórną, aby wstrzyknąć łącznie 1,5 mililitra inokulum wokół frędzla. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum, powoli umieść 5 mililitrów na końcówce, środku i podstawie frędzla zaznaczonego długopisem.Przenieść kulturę Eumadous do 3-mililitrowej strzykawki z igłą podskórną w rozmiarze 20. Wstrzyknąć igłę do zaszczepiania w przestrzeń między liśćmi łuski tak głęboko, jak to możliwe, nie raniąc ucha, a następnie uwolnić 1,5 mililitra inokulum wokół ucha. Następnie wyjąć strzykawkę i igłę i ostrożnie wmasować kolbę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór Eumadous.Upuść 10 mikrolitrów inokulum na płytkę ślimaka z węgla drzewnego PD. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Strzępki wydzielające ZM Mach1 otoczone są sygnałem fluorescencyjnym i wiśniowym.W przeciwieństwie do tego, strzępki niewydzielające wykazują sygnał fluorescencyjny tylko w cytoplazmie grzyba. Niewłaściwa lokalizacja frędzla lub nierównomierne rozmieszczenie inokulum może skutkować niezakażonym frędzlem lub tylko częściowym zakażeniem frędzla w porównaniu z równomiernym rozmieszczeniem. Pojedynczy patogenny szczep progenestrowy konia trojańskiego SG-200, hodowany na świdrze z węgla drzewnego PD, tworzy białe włókna puchu na płytce, jak pokazano.Podczas gdy szczep Eumadous FB1 wymaga krycia przed utworzeniem zakaźnego włókna. Po zakażeniu możliwa reakcja na objawy białka wątroby konia trojańskiego może być analizowana przy użyciu różnych metod, w tym ocen choroby lub obrazowania mikroskopowego. W przypadku wielu patogenów transformacja i wydzielanie są dobrze poznane i mogą być badane w podobny sposób.W związku z tym umożliwiają badanie gospodarza, który nie jest podatny na transformację.

using-ustilago-maydis-as-trojan-horse-for-situ-delivery-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Beernink, B. M. i in. Bezpośrednia agroinokulacja sadzonek kukurydzy poprzez wstrzyknięcie klonów zakaźnych wirusa mozaiki lisogona oraz wirusa mozaiki trzciny cukrowej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem Agrobacterium do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów. Opisuje proces zakażenia Agrobacterium , systemowe rozprzestrzenianie się wirusa oraz zmiany fenotypowe wywołane interferencją RNA.

Dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem agrobakterii do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Tutaj opisujemy dostarczanie mikroRNA za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 w mysim modelu choroby nerwowo-mięśniowej. Pojedyncze podanie obwodowe myszom spowodowało trwałą nadekspresję miRNA w neuronach mięśniowych i ruchowych, co dało możliwość zbadania funkcji miRNA i potencjału terapeutycznego in vivo.

Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni

Poznaj metodę konia trojańskiego Ustilago maydis do dostarczania białek kukurydzianych in situ w liście, kwiatostany i kłosy. Technika ta umożliwia badanie funkcji białek i przebiegu infekcji z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Przeglądaj więcej filmów