Name: Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj technikę nanoprecypitacji błyskawicznej FNP do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych. Metoda ta umożliwia skalowalną produkcję nanocząstek o zastosowaniu w systemach dostarczania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) przyznane K.D.R.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Enkapsulacja związków hydrofobowych, takich jak witamina E, podobnie jak w kroku 1 Protokołu, została obszernie opisana 9,14,28. Wytwarzane są stosunkowo monodyspersyjne cząstki, ponieważ skala czasu mieszania jest krótsza niż skala czasu agregacji i wzrostu cząstek. W szczególności zmieszany roztwór rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika szybko staje się jednorodny, co umożliwia równomierne zarodkowanie. Montaż kopolimeru blokowego z powierzchnią cząstek zapewnia następnie stabilizację steryczną, która zatrzymuje wzrost cząstek5. Ponieważ czas mieszania w komorze (turbulencje) jest funkcją natężenia przepływu na wlocie do CIJ lub MIVM, istnieje szybkość wlotu, która występuje po przejściu do mieszania turbulentnego, gdzie wielkość cząstek jest zasadniczo stała13. Zapewnia to dodatkową odporność procesu, ponieważ pewne różnice w natężeniu przepływu na wlocie (tj. prędkość wciągania strzykawki) mogą być tolerowane bez znaczącego wpływu na ostateczną wielkość NP, jak pokazano na rysunku 3. Wolniejsze lub nierówne prędkości wlotowe mogą skutkować większymi cząstkami lub większą dystrybucją polidyspersji, jak widać w przykładzie przerw zapłonu. FNP został również rozszerzony o enkapsulację związków hydrofilowych w nanocząstkach poprzez odwrotne nanowytrącanie Flash. Te odwrócone nanocząstki można następnie wykorzystać do wytworzenia mikrocząstek lub pokryć PEG w celu wytworzenia nanocząstek dyspergowalnych w wodzie25. Podstawowe zasady montażu pozostają takie same, chociaż istnieje dodatkowa złożoność sieciowania rdzenia cząstek. Jest to konieczne do stabilizacji cząstki w środowisku wodnym. Ogólnie rzecz biorąc, stosunek ładunku 1:1 w porównaniu z blokiem wielokwasowym jest wystarczający, chociaż oddziaływania jonowe można promować poprzez dostosowanie pH poprzez dodanie zasady19. W tym protokole opisano tylko pierwszy krok procesu tworzenia odwróconych NP.
Oprócz szybkiego mieszania, skuteczne opracowanie preparatu przez FNP lub iFNP jest ograniczone do przypadków, w których może być spełnionych kilka warunków 9,14. Po pierwsze, wszystkie wejścia strumienia muszą być mieszalne. Podczas gdy emulsje były używane do produkcji NP, FNP wymaga jednolitej fazy roztworu w mieszalniku. Po drugie, składnik rdzeniowy musi być prawie nierozpuszczalny w warunkach rozpuszczalnika w mieszalniku (w przypadku CIJ jest to mieszanina 50/50 objętościowo), aby umożliwić szybkie zarodkowanie. W przeciwnym razie znaczna część pozostanie niekapsułkowana lub wytrąci się po dalszym rozcieńczeniu rozpuszczalnikiem. MIVM może zapewnić wyższą zawartość rozpuszczalnika w komorze mieszania, aby rozwiązać problem ograniczeń rozpuszczalności materiału rdzeniowego. Często przydatne jest generowanie krzywych przesycenia na podstawie danych rozpuszczalności w funkcji składu rozpuszczalnika w celu kierowania projektowaniem procesu9. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne krzywe dla dwóch związków. Niskie przesycenie w warunkach komory mieszania uzasadnia pracę w różnych składach, zwykle przy użyciu MIVM. Wyższe przesycenie sprzyja zarodkowaniu składnika rdzenia w stosunku do wzrostu cząstek, ale niedopasowanie czasu montażu materiału rdzenia i stabilizatora może skutkować dużymi agregatami terapeutycznymi. D'Addio i Prud'homme dokonali szczegółowego przeglądu zastosowania takich krzywych przesycenia9. Na koniec BCP musi zostać molekularnie rozpuszczony w strumieniu rozpuszczalnika, a strumień antyrozpuszczalnika musi być selektywny dla jednego bloku. BCP musi być wystarczająco amfifilowy, aby zapewnić zarówno solwonofobiczną siłę napędową od zapadniętego bloku w celu zakotwiczenia stabilizatora na powierzchni cząstki, jak i aby solwatowany blok nadawał cząstce stabilność steryczną. Rozpuszczalniki inne niż opisane w protokole mogą być stosowane, o ile spełniają te ograniczenia.
Praktyka z ręczną obsługą strzykawki może poprawić wskaźnik powodzenia podczas badań przesiewowych. Jak wspomniano powyżej, praca powyżej przejścia do jednorodnych, turbulentnych warunków mieszania oznacza, że w procesie tolerowane są niewielkie zmiany natężenia przepływu28. Skalowanie do przepływów sterowanych przez pompę, sterowanych komputerowo skutkuje jeszcze większymi korzyściami w zakresie spójności dzięki powtarzalnym natężeniom przepływu na wlocie. W dowolnym momencie podczas przetwarzania końcowego cząstek, oględziny lub analiza DLS mogą wykazać obecność dużych agregatów, które mogą być spowodowane przypadkowym pyłem lub niestabilnością cząstek. W razie potrzeby strumień może być filtrowany za pomocą odpowiedniej wielkości porów filtra. Ze względu na brak agregatów stwierdziliśmy, że podczas filtrowania nanocząstek pokrytych PEG zwykle traci się mniej niż 5% masy, jeśli nominalny rozmiar filtra jest większy niż rozkład wielkości cząstek. Podczas filtrowania agregatów konieczne jest eksperymentalne określenie masy utraconej podczas procesu. Kwantyfikacja ubytku masy może być przeprowadzona na jeden z dwóch sposobów. Całkowitą masę ciał stałych w danej objętości można określić za pomocą analizy termograwimetrycznej przed i po filtracji w celu określenia zakresu zmian (patrz sekcja 2 Informacje Uzupełniające ). Alternatywnie cząstki można odzyskać (np. przez liofilizację) i rozpuścić w dobrym rozpuszczalniku. Stężenie materiału rdzenia można następnie bezpośrednio zmierzyć za pomocą odpowiedniej techniki, takiej jak spektrofotometria w ultrafiolecie lub chromatografia.
W przypadku FNP pozostałości rozpuszczalnika organicznego o stężeniu 10% obj. (np. THF) muszą zostać usunięte z dyspersji wodnej. Można to osiągnąć poprzez destylację wyparną14,29, dializę30 lub filtrację o przepływie stycznym31,32. Praktyczne rozważania dotyczące każdego etapu przetwarzania są opisane w zamieszczonych cytatach. W przypadku dializy typowe membrany to odcięcia 3,5 kDa lub 6-8 kDa, chociaż dostępne są większe opcje. Ta granica masy cząsteczkowej jest wystarczająca do usunięcia rozpuszczalnika podczas dializowania przez 24 godziny przy użyciu kilku zmian kąpieli. Zastosowanie filtracji z przepływem stycznym pociąga za sobą pewien rozwój procesu, ponieważ należy zachować ostrożność, aby uniknąć indukowania agregacji z powodu polaryzacji stężenia na powierzchni membrany. Odkryliśmy, że zmniejszenie składu rozpuszczalnika organicznego poniżej wartości zależnej od układu, zwykle 2-10 obj., eliminuje agregację na powierzchni membrany. Po przetworzeniu stężenie nanocząstek można łatwo określić za pomocą analizy termograwimetrycznej (zob. sekcja 2 Informacje uzupełniające). Często pożądane jest transportowanie lub przechowywanie cząstek w bardzo stabilnej formie. Dyspersje wodne można po prostu szybko zamrozić za pomocą mieszaniny suchego lodu i acetonu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, suche proszki można otrzymać przez liofilizację33,34 lub suszenie rozpyłowe24. Często należy dodać krioprotektant, aby zmniejszyć agregację nanocząstek podczas zamrażania lub suszenia. Cukry (sacharoza, trehaloza itp.), poli(glikol etylenowy) lub cyklodekstryny mogą być badane pod kątem skuteczności w zakresie stężeń poprzez monitorowanie wielkości za pomocą DLS 35,36,37,38. Typowe problemy ze stabilnością nanocząsteczek podczas przetwarzania są często związane z rozpuszczalnością lub separacją faz w rdzeniu, co skutkuje przegrupowaniem w kierunku niższego stanu energetycznego w warunkach, w których zwiększa się ruchliwość. Zastosowanie materiałów współrdzeniowych, alternatywnych stabilizatorów lub zmodyfikowanego składu roztworu zewnętrznego może pomóc w poprawie stabilności 14,16,17,39,40,41.
Jak wspomniano powyżej, MIVM umożliwia wyższą zawartość rozpuszczalnika w komorze mieszania, gdy jest to wymagane do osiągnięcia wysokiego przesycenia. Może również pozwolić na fizyczną segregację gatunków na więcej niż dwa strumienie, gdy wymagają tego ograniczenia reaktywności lub rozpuszczalności. Przykładem jest tworzenie stabilizowanych białkiem zeiny nanocząstek antybiotyku klofaziminy24. Hydrofobowa klofazymina jest wprowadzana do strumienia acetonu; Zeina jest wprowadzana do 60% etanolowego strumienia wodnego; Kazeina, która kompleksuje się z zeiną, jest wprowadzana za pomocą wodnego strumienia buforowego, a czwarty strumień jest dodatkowym buforem w celu zwiększenia stosunku wody do acetonu i etanolu. Wymagane są dwa strumienie rozpuszczalników, ponieważ klofazymina i zeina nie są rozpuszczalne w zwykłym rozpuszczalniku. Proces ten nie mógł być zrealizowany w dwustrumieniowym mikserze CIJ. Ten stabilizowany białkiem preparat pokazuje również, że FNP nie ogranicza się do stabilizatorów BCP. Cząstki janusa zostały wyprodukowane bez stabilizatora42 i zademonstrowano szereg tanich stabilizatorów do zastosowań doustnych24. W szczególności kopolimery, takie jak hydroksypropylometyloceluloza, mogą być stosowane zamiast kopolimerów blokowych24. Materiały rdzeniowe mogą być bardziej hydrofobowe za pomocą wielu technik. Hydrofobowe parowanie jonów zostało zastosowane do enkapsulacji szerokiej gamy związków, które mają pośrednią rozpuszczalność 43,44,45. Ekstremalnie hydrofobowe proleki zostały wygenerowane, a następnie zamknięte w kapsułkach46. Kwasy nukleinowe zostały otoczone kapsułkami poprzez kompleksowanie z lipidami kationowymi47. Co ważne, badania te wykazały, że FNP może wytwarzać szereg substancji chemicznych na powierzchni cząstek. Ponadto zastosowano mieszane stabilizatory zawierające frakcję BCP, która została zmodyfikowana za pomocą liganda celującego na końcu łańcucha. Umożliwia to precyzyjną kontrolę zawartości ligandów na powierzchni, ponieważ skład cząstek odzwierciedla skład strumienia wejściowego23,48. Podobnie, możliwe jest również włączenie wielu podstawowych składników, w tym barwników i nieorganicznych nanocząstek 3,8.
Flash NanoPrecipitation to skalowalne podejście do nanocząstek polimerowych składających się z rdzenia hydrofobowego lub hydrofilowego. Jeśli spełnione są kryteria wymienione powyżej, na ogół ponad 95% materiału rdzenia jest zamknięte w cząsteczce przy wysokim ułamku masowym. Trzy przedstawione tutaj przykłady zostały przeprowadzone w skali laboratoryjnej, wymagając kilku miligramów materiału i około 0,5 ml w każdym strumieniu wlotowym. Pozwala to na szybkie badanie przesiewowe warunków cząstek w celu optymalizacji receptury. Zwiększenie skali preparatów ołowiu do większych wielkości partii jest kwestią dłuższego prowadzenia procesu, co można łatwo osiągnąć za pomocą pomp strzykawkowych lub regulatorów przepływu. Z kolei zwiększenie skali nanoprecypitacji z dodatkiem masowym napotyka na dobrze udokumentowane wyzwania związane z utrzymaniem wystarczającego mikromieszania w miejscu dodawania i uwzględnianiem skutków zmiany geometrii naczynia49. Jest to poważna bariera, ponieważ kluczowe znaczenie ma produkcja cząstek w spójny sposób, aby spełnić wymagania FDA50. Techniki mikrofluidyczne mogą również wytwarzać jednolite, powtarzalne nanocząstki, ale umożliwiają produkcję tylko w zakresie miligramów. Na przykład Karnik i wsp. podali tempo produkcji 0,25 mg/min w badaniu uwalniania leku51. Dalsze zwiększanie skali zazwyczaj wiąże się z równoległością przy wysokich kosztach kapitałowych12. W przypadku FNP łatwo jest wyprodukować 1 gram nanocząstek w tempie 600 mg/min za pomocą pompy strzykawkowej i kilku złączek do podłączenia do wlotów mieszalnika. W związku z tym FNP stanowi zarówno dostępne narzędzie do badań przesiewowych na skalę laboratoryjną, jak i skalowalne podejście do produkcji nanocząsteczek na potrzeby prac translacyjnych.

Od końca lat dziewięćdziesiątych obserwuje się stały wzrost liczby badań klinicznych z wykorzystaniem nanomateriałów1,2. Rosnące zainteresowanie odzwierciedla potencjał nanomateriałów w zakresie poprawy biodostępności leków hydrofobowych i umożliwienia preferencyjnego ukierunkowania w obrębie organizmu3. Nanocząstki polimerowe (określane tutaj jako nanocząstki lub nanocząsteczki) stanowią coraz większą część tej klasy materiałów2. Nanocząsteczki wzbudziły zainteresowanie, ponieważ mają wysoce regulowane właściwości, takie jak rozmiar, skład i funkcjonalizacja powierzchni4. W przypadku stosowania do podawania słabo rozpuszczalnych leków, nanocząsteczki często mają strukturę rdzeń-powłoka, w której środek terapeutyczny jest zamknięty w hydrofobowym rdzeniu, a otoczka składa się z hydrofilowej szczotki polimerowej. Prosty sposób na wygenerowanie tej struktury wykorzystuje amfifilowy kopolimer diblokowy (BCP) składający się z degradowalnego bloku hydrofobowego, który stanowi część rdzenia cząstki, oraz hydrofilowego bloku poli(glikolu etylenowego) (PEG), który tworzy szczotkę polimerową i nadaje stabilizację steryczną4,5.
Nanoprecypitacja jest powszechną techniką wytwarzania nanocząstek polimerowych, ponieważ jest prosta i nie wymaga dużej ilości energii6. W najprostszej formie nanowytrącanie polega na dodaniu pipetą składników NP w rozpuszczalniku organicznym, takim jak aceton, do nadmiaru wymieszanej wody. Zmiana rozpuszczalnika na rozcieńczony roztwór wodny powoduje wytrącenie się nierozpuszczalnego składnika rdzenia. Stabilizator gromadzi się na tej rosnącej powierzchni cząstek, kierowany przez adsorpcję zapadniętego bloku hydrofobowego7,8,9,10. Równomierny rozkład wielkości cząstek uzyskuje się, gdy rozpuszczalnik i woda szybko mieszają się, tworząc jednorodny roztwór. Mieszanie, które jest wolniejsze niż zarodkowanie i składanie składników, skutkuje większą, bardziej polidyspersyjną populacją cząstek. Chociaż jest łatwo dostępne dla prostego testu, podejście wsadowe z mieszadłem powoduje dużą zmienność ze względu na niespójność mieszania i nie nadaje się do skalowania w górę6,11. Mikrofluidyka pojawiła się jako kolejna droga do produkcji NP, która może być prowadzona w sposób ciągły. Ten sposób produkcji został niedawno poddany przeglądowi przez Dinga i wsp.11. Powszechne podejście wykorzystuje ogniskowanie przepływu laminarnego w celu zmniejszenia skali długości rozpuszczalnika do wartości submikronowych. Mieszanie antyrozpuszczalnika odbywa się na drodze dyfuzji, więc małe wymiary przepływu mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia jednorodnych cząstek11,12. Zrównoleglenie wielu komór mikroprzepływowych w celu zwiększenia skali jest problematyczne w przypadku dużych wolumenów produkcji.
Warunki szybkiego mieszania, które sprzyjają równomiernemu nanowytrącaniu w mikrofluidyce, mogą być wytwarzane w ograniczonych, burzliwych przepływach. Nanoprecypitacja Flash (FNP) wykorzystuje specjalne geometrie mieszania, aby osiągnąć te warunki przy wyższych objętościowych natężeniach przepływu niż jest to możliwe w przypadku mikrofluidyki. Strumienie wlotowe wchodzą do komory mieszania w warunkach turbulentnych, które prowadzą do powstawania wirów, tak że na skali długości dyfuzji tworzą się blaszki rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika11,13. W ten sposób uzyskuje się równomierne mieszanie w skali czasowej krótszej niż zarodkowanie i wzrost terapeutyki. Ograniczona geometria mieszalnika nie pozwala na ominięcie strumienia w obszarze, w którym zachodzi turbulentne rozpraszanie energii, a cały system doświadcza tego samego procesu historia13. Zarodkowanie zachodzi równomiernie w komorze mieszania, a wzrost cząstek postępuje do momentu zatrzymania przez złożenie BCP na powierzchni9,14. Mieszany strumień zawierający stabilne cząstki można następnie rozcieńczyć dodatkowym rozpuszczalnikiem, aby zahamować dojrzewanie cząstek Ostwalda15,16,17.
Mieszalnik CIJ (A Limited Impacting Jet) jest najprostszym projektem mieszalnika dla FNP i pozwala na mieszanie dwóch strumieni w sposób skalowalny i ciągły, jak pokazano w Rysunek 1A13. Mieszalnik wirowy z wieloma wlotami (MIVM) został opracowany, aby umożliwić do czterech różnych wejść strumienia, jednocześnie osiągając szybkie mikromieszanie wymagane do równomiernego tworzenia cząstek, jak pokazano na Rysunek 1B18. FNP umożliwia proste badania przesiewowe preparatów, które można łatwo przełożyć na produkcję na skalę komercyjną. Ze względu na ciągły charakter procesu, większe wielkości partii nie wymagają nowych zbiorników, ale raczej dłuższych czasów pracy, co umożliwia proste przełożenie na produkcję na skalę kilogramową w tym samym ciągu urządzeń.
Hydrofilowe związki, takie jak peptydy i białka ('biologiczne') mogą być również kapsułkowane w procesie zwanym odwrotnym nanoprecypitacją błyskawiczną (iFNP). Technika wymaga amfifilowego BCP, gdzie jeden blok jest hydrofobowy, a drugi jest poliacid19. Pierwszym etapem jest szybkie zmieszanie strumienia dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego lek biologiczny i BCP z rozpuszczalnikiem lipofilowym, takim jak dichlorometan lub chloroform. Powoduje to powstawanie cząstek stabilizowanych hydrofobową szczotką blokową. W tym przypadku taka architektura zostanie określona mianem "odwróconego" NP. Rdzeń zawiera polikwas, który jest następnie sieciowany jonowo za pomocą kationu wielowartościowego. Stabilizuje to cząstki do przetworzenia w środowisku wodnym w postaci mikrocząstek lub nanocząstek pokrytych PEG za pomocą technik, które zostały opisane w literaturze19,20,21.
Ten protokół może być wykorzystany do produkcji na skalę laboratoryjną polimerowych nanocząsteczek typu rdzeń-powłoka, zawierających w sobie związki hydrofobowe lub hydrofilowe. Podrozdziały protokołu zawierają instrukcje dotyczące korzystania z obu klas mikserów - CIJ i MIVM. Czytnik powinien być w stanie dostosować protokół do nowych komponentów rdzeniowych i odtwarzalnie generować nanocząstki o pożądanej wielkości przy użyciu odpowiedniego miksera dla wejść strumienia. Poniżej przedstawiono trzy przykładowe preparaty z wykorzystaniem FNP i iFNP. Dwa z nich wykorzystują mikser CIJ, a jeden wymaga klasy MIVM<sup="xref">15,22. Pierwsza formulacja demonstruje enkapsulację modelowego związku hydrofobowego przez FNP. Drugi preparat demonstruje enkapsulację modelowego związku hydrofilowego za pomocą iFNP w mieszalniku CIJ. Ostateczna formuła stanowi przykład enkapsulacji białka przez iFNP przy użyciu MIVM. Protokół dla tej trzeciej formuły opisuje użycie małego, ręcznego MIVM określanego jako "μMIVM". Konstrukcja mieszalnika jest mniejsza, aby umożliwić uproszczone przesiewanie preparatów, ale zachowanie skalowania jest dobrze zrozumiałe, a mieszalnik nie jest urządzeniem mikroprzepływowym22. Ostatnia sekcja protokołu zawiera kilka uwag na temat zwiększania skali preparatów ołowiu zidentyfikowanych podczas badań przesiewowych. Preparaty te mają na celu zapewnienie punktów dostępu do nauki procesu, a co za tym idzie, wykorzystanie nieulegających degradacji polimerów na bazie poli(styrenu). Alternatywne stabilizatory zostały opisane w literaturze, z wieloma dostępnymi biokompatybilnymi opcjami komercyjnymi14,23,24.

<table><tbody><tr><td>Mieszalnik z ograniczonymi strumieniami uderzeniowymi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Rysunki techniczne można znaleźć w informacjach uzupełniających. Zapoznaj się z tekstem do walidacji nowego miksera</td></tr><tr><td>Dopasowanie Luer</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-604</td><td>Montaż na wlocie mieszalnika CIJ lub MIVM z odpowiednimi gwintami</td></tr><tr><td>Złączka wtykowa</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-309</td><td>Montaż po bokach mieszalnika CIJ (punkt dostępu uszczelki po wierceniu)</td></tr> <tr><td>Złączka wylotowa - CIJ</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-205</td><td>Montaż z tulejką i rurką na wylocie komory CIJ</td></tr><tr><td>Tuleja wylotowa - CIJ</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-200</td><td>Montaż ze złączką wylotową (duży koniec zlicowany z rurką)</td></tr><tr><td>Rurka wylotowa - CIJ</td><td>Idex Health & Science</td><td>1517</td><td>Użyj obcinaka do rurek do czystych końcówek. Upewnij się, że dodatkowe rurki nie wnikają do komory mieszania</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-4</td><td>Użyj THF bez stabilizatora, aby uniknąć ograniczeń rozpuszczalności BHT. Nadtlenki mogą zakłócać niektóre zastosowania.</td></tr><tr><td>Strzykawka z normą (3 ml)</td><td>VWR</td><td>53548-017</td><td></td></tr><tr><td>Witamina E (alfa;-tokoferol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90669-50G-F Przechowywać</td><td>w zimnym</td></tr><tr><td>poli(glikolu styreno-b-etylenowo), PS1.6k-b-PEG5k</td><td>Źródło</td><td>polimeru P13141-SEO</td><td>Inne rozmiary bloków dopuszczalne w zależności od zastosowania</td></tr><tr><td>poli(styren)1,8k</td><td>Źródło polimeru</td><td>P2275-S</td><td>Przykład hydrofobowego materiału rdzenia</td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki Luer-slip, 1ml (100 pk)</td><td>National</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Maltodekstryna DE 4-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>419672-100G</td><td></td></tr><tr><td>poli(styren-b-kwas akrylowy), PS5k-b-PAA4.8k</td><td>Źródło polimeru</td>: <td>P5917-SAA:</td><td>Inne rozmiary bloków dopuszczalne w zależności od zastosowania</td></tr>: <tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Dihdyrat chlorku wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-25G</td><td>Higroskopijny.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z białka jaja kurzego (albumina jaja kurzego, OVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-1G</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td><td>NA</td><td>NA Zobacz</td><td>informacje uzupełniające dla rysunków technicznych. Zapoznaj się z tekstem w celu walidacji nowego miksera</td></tr><tr><td>Armatura wylotowa - MIVM</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-942</td><td>Połączenie z tulejką</td></tr><tr><td>Rurka wylotowa - MIVM</td><td>NA</td><td></td><td>Pasuje do identyfikatora tulejki.</td></tr><tr><td>O-ring (MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>Zamów luzem - część eksploatacyjna. Upewnij się, że jest kompatybilny z rozpuszczalnikiem, jeśli używasz alternatywnego źródła.</td></tr><tr><td>Stojak na mikser</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Zobacz Markwalter & Prud'homme for design.17</td></tr></tbody></table>

nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Formułowanie związku terapeutycznego w postaci nanocząsteczek (NPs) może nadać unikalne właściwości. W przypadku leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, preparaty NP mogą poprawiać biodostępność i modyfikować dystrybucję leków w organizmie. W przypadku leków hydrofilowych, takich jak peptydy lub białka, enkapsulacja w nanocząsteczkach może również zapewnić ochronę przed naturalnymi mechanizmami klirensu. Istnieje kilka technik wytwarzania polimerowych nanocząsteczek, które są skalowalne. Flash NanoPrecipitation (FNP) to proces, w którym wykorzystuje się zmodyfikowane geometrie mieszania do wytwarzania nanocząsteczek o wąskim rozkładzie wielkości i regulowanych rozmiarach od 30 do 400 nm. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące produkcji na skalę laboratoryjną nanocząstek polimerowych typu rdzeń-powłoka o docelowej wielkości przy użyciu FNP. Protokół może być wdrożony do hermetyzacji związków hydrofilowych lub hydrofobowych z niewielkimi modyfikacjami. Technika ta może być z łatwością stosowana w laboratorium w skali miligramowej do przesiewania preparatów. Trafienia ołowiu można bezpośrednio skalować do skali gramowej i kilogramowej. Ze względu na to, że jest to proces ciągły, zwiększanie skali wiąże się z dłuższym czasem trwania procesu mieszania, a nie z translacją na nowe zbiorniki procesowe. NP produkowane przez FNP są silnie obciążone środkiem terapeutycznym, posiadają gęstą stabilizującą szczotkę polimerową i mają powtarzalność wielkości ± 6%.

Przesiewanie formulacji NP za pomocą FNP jest szybkie i wymaga niewielkich ilości materiału (rzędu 1-10 mg). Protokół FNP służący do enkapsulacji związków hydrofobowych, takich jak witamina E (krok 1), pozwala na otrzymanie stabilnej, przejrzystej lub lekko opalizującej dyspersji NP. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) stanowi niezawodny sposób charakteryzacji wielkości cząstek. Jak pokazano na Rysunku 3, proces ten w sposób powtarzalny wytwarza NP o niskiej polidyspersyjności. Typowy indeks polidyspersyjności (PDI) wynosi mniej niż 0,20, co wskazuje na relatywnie monodyspersyjną populację. PDI jest wyznaczany z funkcji autokorelacji i często jest implementowany w oprogramowaniu urządzenia. Jest to stosunek drugiego do pierwszego momentu, gdzie dla cząstek monodyspersyjnych zazwyczaj uzyskuje się wartości rzędu 0,126. Dla czterech zgłoszonych powtórzeń formulacji witamina E/PS-b-PEG wartość ta wyniosła 0,12 ± 0,02, a średnica wynosiła 107 ± 7 nm. Na Rysunku 3 przedstawiono również typowy „błąd” wynikający z nierównomiernego lub zbyt wolnego nacisku na strzykawki. Polidyspersyjność nie uległa zmianie, ale rozmiar był nieco większy (135 nm). Uwzględniając tę próbkę, nowe parametry wielkości cząstek wynoszą 113 ± 14 nm. Błąd prowadzi do okresów, w których w komorze znajduje się tylko jeden rodzaj strumienia. Ważne jest, aby cały strumień przechodził przez tę samą historię procesu i posiadał te same wzglбne objętości strumieni organicznego i wodnego wewnątrz mieszalnika. Bez stabilizatora powstaje nieprzezroczysty roztwór z widocznymi agregatami. Funkcja autokorelacji DLS dla tej próbki jest niemonotoniczna i nie wygasza się gładko, co widać na wstawce do Rysunku 3.
Kontrola rozmiaru cząstek za pomocą FNP została przedstawiona na Rysunku 4, gdzie zmiana względnych ilości materiału rdzenia – w tym przypadku poli(styrenu)1.8k – oraz stabilizatora PS-b-PEG doprowadziła do uzyskania cząstek o rozmiarach od 49 do 152 nm. Rozmiary te uzyskano przy strumieniach THF o całkowitym stężeniu masowym rdzenia i stabilizatora wynoszącym 20 mg/mL, w których materiał rdzenia w postaci poli(styrenu) stanowił 25%, 50% lub 75% całkowitej masy. Polidyspersyjność nanocząstek była zawsze niższa niż 0,15. Szczegółowe omówienie wpływu parametrów na rozmiar cząstek wytwarzanych metodą FNP można znaleźć w literaturze10. Stopień obciążenia można dostosować, utrzymując stałą objętość rozpuszczalnika i zmieniając względne objętości roztworów stokowych rdzenia i stabilizatora. Podobnie, całkowite stężenie masowe można zmieniać, przygotowując roztwory stokowe o stężeniach innych niż 10 mg/mL. W określonych warunkach za pomocą DLS27 można zaobserwować populację pustych miceli. Nie ma to żadnego szkodliwego wpływu, poza poszerzeniem zmierzonego rozkładu wielkości cząstek. W przypadku podobnych rozmiarów może się to objawiać w postaci jednego szerokiego piku zamiast dwóch oddzielnych pików.
Ten sam mieszalnik CIJ może być również wykorzystany do enkapsulacji związków hydrofilowych za pomocą iFNP, co przedstawiono w kroku 2 protokołu. Cząstki wytworzone w opisanej formulacji mają wielkość około 65 nm przy niskiej polidyspersyjności wynoszącej 0,08. Rozkład wielkości przedstawiono na Rysunku 5A (linie przerywane). Wpływ sieciowania reszt kwasu karboksylowego PAA na stabilność cząstek wykazano za pomocą analizy DLS w silnym rozpuszczalniku, takim jak DMSO, co przedstawiono na Rysunku 5B. Funkcja autokorelacji dla dobrze sieciowanych cząstek powinna rozpoczynać się w pobliżu wartości 1 i gwałtownie spadać do 0 w czasie charakterystycznym, który jest powiązany z wielkością cząstek (linia ciągła). Cząstki, które znacznie pęcznieją lub rozpuszczają się, nie są sieciowane i wykazują minimalny sygnał autokorelacji (linia kropkowana). W przypadku iFNP nieudane próby objawiają się w sposób podobny do opisanych powyżej FNP. Mogą być widoczne agregaty lub może zostać zaobserwowany niewłaściwy kształt funkcji autokorelacji DLS. Urządzenie MIVM może być stosowane do FNP lub iFNP, gdy z powodu ograniczeń systemowych, takich jak rozpuszczalność lub niekompatybilność chemiczna, wymaganych jest więcej niż dwa strumienie wlotowe. Wersja małoscale MIVM (μMIVM) wraz ze statywem mieszalnika przedstawiona jest na Rysunku 2. Podobnie jak w przypadku CIJ, mieszalnik ten może być wykorzystany do enkapsulacji związków hydrofobowych lub hydrofilowych22. W kroku 3 opisano protokół enkapsulacji białka hydrofilowego, OVA, za pomocą iFNP. Rozkład wielkości cząstek przedstawiono na Rysunku 5A (linia ciągła). Wielkość wynosi około 125 nm przy PDI wynoszącym 0,16. Ogólny protokół obsługi pompy strzykawkowej w większej skali znajduje się w kroku 4.
<img alt="Układ wygaszania rozpuszczalnik-antyrozpuszczalnik; schemat, aparatura eksperymentalna, tworzenie nanocząstek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematy zestawu mieszalnika i wewnętrznego wzorca przepływu. (A) Mieszalnik z ograniczonymi zderzającymi się strumieniami (CIJ) z przymocowanymi strzykawkami znajduje się nad kąpielą wygaszającą. Na zdjęciu nie widoczny jest mieszadło magnetyczne w fiolce z kąpielą wygaszającą oraz mieszadło magnetyczne. Geometria mieszania przedstawiona jest w widoku powiększonym, ukazującym dwa wloty strumieni, które zderzają się w centrum komory. (B) Przedstawiono wielowlotowy mieszalnik wirowy (μMIVM) ze szklanymi strzykawkami, umieszczony w statywie nad kąpielą wygaszającą. Płyta ruchoma i ograniczniki mechaniczne zostały wycięte ze zdjęcia. Widok powiększony schematycznie przedstawia komorę wirową i kanały wlotowe. (C) Schematyczne przedstawienie nanocząstek (NP) typu rdzeń-otoczka wytworzonych za pomocą FNP. Czerwone sfery reprezentują lek terapeutyczny, który wraz z niebieskim zapadniętym blokiem polimerowym tworzy rdzeń NP. Żółty blok polimerowy tworzy warstwę szczotkową zapewniającą stabilizację steryczną NP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do badania ściskania, schemat z opisanymi elementami: płyta ruchoma, ogranicznik mechaniczny, płyta wsporcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Terminologia μMIVM i komponenty do montażu. μMIVM wymaga statywu mieszacza, aby umożliwić równomierne wciskanie czterech strzykawek. W tym przypadku wysokości tłoków strzykawek muszą być identyczne, aby zapewnić spójne mieszanie. Alternatywnie urządzenie można obsługiwać za pomocą pomp strzykawkowych. Po lewej stronie rysunku przedstawiono statyw mieszacza z opisanymi komponentami. Po prawej znajduje się rozmontowany mieszacz z zamontowanym pierścieniem O-ring na tarczy geometrii mieszania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład wielkości nanocząstek, wykres znormalizowanej intensywności z wstawką czasu korelacji względem intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rozkład wielkości polimerowych nanocząstek zawierających rdzeń z witaminą E i stabilizowanych przez PS-b-PEG. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) dostarcza rozkładów wielkości ważonych intensywnością, które wskazują rozkład średnicy NP. Krzywe stanowią średnią z analiz powtórzonych trzykrotnie dla każdej próby i zostały przeskalowane w celu uzyskania identycznych maksymalnych wysokości piku. Cztery powtórzenia (linie ciągłe) wskazują na wysoką powtarzalność metody (odchylenie standardowe = 7 nm). Uwzględniono również reprezentatywny błąd wykonania (linia przerywana), taki jak zbyt mała prędkość tłoka strzykawki lub nierównoprzydatne dociśnięcie dwóch strzykawek, co skutkuje większą średnicą cząstek. Odchylenie standardowe wielkości NP z uwzględnieniem błędu wykonania wynosiło 14 nm. (Wstawka) Bez stabilizatora PS-b-PEG powstają duże agregaty w skali mikronowej (lub krople, w przypadku oleju takiego jak witamina E). Funkcja autokorelacji DLS z pomiaru bez stabilizatora (linia kropkowana) jest przedstawiona wraz z reprezentatywną autokorelacją z powtórzenia dla nanocząstek (linia ciągła). Funkcja autokorelacji wykazuje szereg charakterystycznych skal czasowych dla próbki kontrolnej, co wskazuje na populację polidyspersyjną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres rozkładu wielkości nanocząstek; zmienne zawartości rdzenia, znormalizowana intensywność względem średnicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kontrola wielkości cząstek za pomocą FNP poprzez zmienianie względnych stosunków materiału rdzenia do stabilizatora. Przedstawiono rozkłady wielkości ważone intensywnością dla trzech formulacji z rdzeniem z poli(styrenu) stabilizowanym przez PS-b-PEG. Całkowite stężenie masy w THF wynosiło 20 mg/mL, a antyrozpuszczalnikiem była woda. Formulacje przygotowano w mieszalniku CIJ. Ułamek masy stanowiący materiał rdzenia jest podany w legendzie. Na przykład próbka z 25% rdzeniem zawierała 5 mg/mL poli(styrenu) i 15 mg/mL PS-b-PEG. Średnie wielkości dla zawartości rdzenia 25% (linia ciągła), 50% (linia przerywana) i 75% (linia mieszana) wynosiły odpowiednio 49 nm, 96 nm i 152 nm. Wszystkie wartości PDI były mniejsze niż 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy rozkładu wielkości nanocząstek i funkcji korelacji; analiza dynamicznego rozpraszania światła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Charakterystyka odwróconych NP wykonanych w mieszalniku CIJ lub μMIVM. (A) Krzywe DLS stanowią średnią z analiz przeprowadzonych w trzech powtórzeniach dla każdej formulacji. Linia przerywana wskazuje rozkład wielkości cząstek 3k MD wykonanych w mieszalniku CIJ, natomiast linia ciągła przedstawia rozkład wielkości cząstek OVA wykonanych w μMIVM. (B) Stopień sieciowania można ocenić za pomocą DLS, stosując DMSO jako rozcieńczalnik. Funkcja autokorelacji DLS wskazuje na stopień sieciowania poprzez początkową wartość autokorelacji oraz obserwację wyraźnego przejścia do wartości zero. Linia przerywana przedstawia funkcję autokorelacji dla cząstki bez sieciowania, wykazując słaby sygnał początkowy i szeroki czas zaniku. Linia ciągła przedstawia autokorelację po dodaniu silnego sieciowania (w tym przypadku tetraetylenopentaminy), co objawia się silnym sygnałem początkowym i zdefiniowaną skalą czasu zaniku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przesycenie a rozpuszczalnik organiczny; wykres porównujący poziomy rozpuszczalności Peptydu B i boskalidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przesycenie, S, jako funkcja względnych stosunków mieszania rozpuszczalnika organicznego do wody. (A) Porównanie najwyższego osiągalnego przesycenia dla (○) boskalidu, pestycydy, oraz (■) peptydu B, siedmiorezystowego peptydu modelowego. Strumień organiczny zawiera boskalid w stężeniu 230 mg/mL i peptyd B w stężeniu 200 mg/mL, co odpowiada ich stężeniom nasycenia. Maksymalne przesycenie zależy od każdego układu aktywny składnik farmaceutyczny (API)/rozpuszczalnik. (B) Gdy stężenie boskalidu w strumieniu organicznym zostanie zmniejszone 20-krotnie, warunki, w których osiągane jest przesycenie i nanowytrącanie, stają się ograniczone. Rysunek przedrukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pliki uzupełniające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Aby pobrać pliki, kliknij tutaj.</a>

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Zademonstrowane tutaj techniki nanoprecypitacji błyskawicznej (FNP) oferują skalowalną i prostą platformę do hermetyzacji związków hydrofobowych lub hydrofilowych wewnątrz nanocząstek polimerowych. Dla jasności, technika stosowana do kapsułkowania leków biologicznych nazywa się odwrotnym nanoprecypitacją błyskawiczną lub IFNP. Podstawowe zasady pozostają niezmienione, ale uzyskana struktura nanocząstek jest inna.Ogólnie rzecz biorąc, nowi użytkownicy potrzebują praktyki, aby konsekwentnie obsługiwać strzykawki wlotowe podczas ręcznego wytwarzania małych partii nanocząstek. Większe ilości można wytwarzać za pomocą pomp strzykawkowych sterowanych komputerowo. Nasz protokół zawiera również szczegółowe informacje dotyczące przetwarzania końcowego roztworów nanocząstek, co często ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego zastosowania preparatu.Przed rozpoczęciem procesu sprawdź złączki miksera CIJ i upewnij się, że rurka wylotowa nie jest zaciśnięta. Następnie napełnij dwie pięciomililitrowe strzykawki Luer lock bez gumy polipropylenowej dwoma do trzech mililitrów acetonu lub innego rozpuszczalnika czyszczącego. Zablokować strzykawki w adapterach wlotowych i umieścić zespół nad pojemnikiem na odpady.Stopniowo wciskaj tłoki, aby przepuścić rozpuszczalnik przez komorę mieszania w ciągu kilku sekund. Następnie wyjąć strzykawki i osuszyć mieszaninę strumieniem azotu. Następnie, aby rozpocząć przygotowywanie strumienia wejściowego rozpuszczalnika, odpipetować 0,25 mililitra 10 miligramów na mililitr roztworu witaminy E, w tetrahydrofuranie wolnym od stabilizatora, do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Następnie odpipetować 0,25 mililitra 10 miligramów na mililitr roztworu stabilizatora z kopolimeru blokowego w THF do tej samej probówki. Wirować mieszaninę przez pięć do 10 sekund, a następnie odwirować ją w temperaturze tysiąca G przez pięć do 10 sekund, aby odzyskać płyn przylegający do nakrętki. Przygotuj 1,5 mililitra probówkę wirówkową zawierającą 0,525 mililitra dejonizowanej wody jako antyrozpuszczalnik.Następnie odpipetuj cztery mililitry wody dejonizowanej do 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej, aby przygotować kąpiel gaszącą. Umieścić mały mieszadło w fiolce. Umieść czysty mikser CIJ nad kąpielą hartowniczą w stojaku lub bloku probówki na płycie mieszającej.Rozpocznij mieszanie kąpieli hartowniczej z prędkością około 75% maksymalnej możliwej prędkości. Następnie dopasuj igłę do jednomililitrowej strzykawki bez kauczuku polipropylenowego i wyciągnij antyrozpuszczalnik. Ostrożnie usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, a następnie wyjąć i wyrzucić igłę.Wyregulować tłok w taki sposób, aby płyn docierał do końca strzykawki. Następnie przymocować strzykawkę do jednego z wlotów CIJ. W ten sam sposób pobrać mieszaninę rozpuszczalnika do drugiej strzykawki i podłączyć ją do drugiego wlotu.Aby utworzyć nanocząstki, należy jednocześnie wcisnąć oba tłoki płynnym, jednostajnym ruchem w czasie krótszym niż 0,5 sekundy. Bardzo ważne jest, aby wciskać strzykawki szybko, równomiernie i płynnie. Nie należy gwałtownie uderzać w strzykawki, ale należy rozpocząć ruch już w kontakcie z wierzchołkami strzykawek.Następnie ustawić mieszalnik CIJ nad pojemnikiem na odpady, nie wyjmując strzykawek, aby upewnić się, że objętość zapchana nie spływa do dyspersji. Wyjąć mieszadło z fiolki scyntylacyjnej i zakryć je. Następnie należy wyjąć i wyrzucić strzykawki z rozpuszczalnikiem i antyrozpuszczalnikiem.Wyczyść mieszalnik przed następną próbą nanostrącania błyskawicznego. Aby przygotować próbkę do analizy dynamicznego rozpraszania światła, należy odpipetować 100 mikrolitrów dyspersji do kuwety. Dodać 900 mikrolitrów rozpuszczalnika do kąpieli hartowniczej i dobrze wymieszać pipetując przed rozpoczęciem analizy próbki.Aby rozpocząć montaż mikro MIVM, umieść O-ring w tarczy geometrii mieszania. Dopasuj otwory w tarczy mieszającej do kołków na górnej tarczy i dopasuj je do siebie, uważając, aby nie przesunąć O-ringu. Poluzuj złączkę rurki wylotowej w dolnym odbiorniku, a następnie przykręć podłączone dyski do odbiornika.Zamontuj klucz płaski do kołków górnej tarczy i dokręć zespół. Dokręcić złączkę rurki wylotowej tak, aby mocno przylegała do dolnej powierzchni tarczy geometrii mieszania. Upewnij się, że łączniki strzykawki na górnej tarczy są dobrze dopasowane.Podnieś ruchomą płytę na stojaku miksera, aby nie przeszkadzała, a następnie umieść zmontowany mikser na stojaku, z rurką wylotową przewleczoną przez płytę nośną. Następnie umieść 15-mililitrową probówkę wirówkową zawierającą 5,25 mililitra chloroformu jako kąpiel hartowniczą pod rurką wylotową. Następnie narysuj 0,75 mililitra roztworu A, który jest roztworem albuminy jaja kurzego o stężeniu pięciu miligramów na mililitr w dimetylosulfotlenku w 10% objętości wody, do jednomililitrowej gazoszczelnej strzykawki typu Luer lock z końcówką igły.Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza, wyjmij igłę i zalej roztwór do końca złączki Luer. Podłączyć strzykawkę do wlotu mieszalnika. Powtórz ten proces z 0,75 mililitra roztworu B, który wynosi sześć miligramów na mililitr stabilizatora kopolimeru blokowego w DMSO i roztworu C, który jest THF.Podłączyć strzykawki do wlotów mieszalnika zgodnie z ruchem wskazówek zegara, w kolejności alfabetycznej. Przygotuj gazoszczelną strzykawkę o pojemności 2,5 mililitra zawierającą 1,85 mililitra roztworu D, który jest chloroformem, i podłącz ją do czwartego wlotu. Upewnij się, że nie ma znaczącej różnicy w wysokości strzykawki.Następnie ostrożnie chwyć obudowę łożyska po obu stronach ruchomej płytki i powoli opuść płytkę, aż będzie ledwo równomiernie spoczywać na strzykawkach. Aby wytworzyć nanocząstki, należy równomiernie i płynnie wcisnąć płytkę w ciągu około 0,5 do jednej sekundy. Następnie wyjmij i zakryj rurkę kąpieli hartowniczej.Po zakończeniu zdemontuj i wyczyść mikser. Aby pracować z większymi objętościami, załaduj roztwory do gazoszczelnych strzykawek i podłącz rurki z politetrafluoroetylenu ze złączkami Luer do strzykawek. Zagruntować roztwory do końców rurek.Zacisnąć strzykawki w pompach strzykawkowych i podłączyć rurkę do odpowiednich wlotów mieszalnika. Umieść małą fiolkę na odpady pod rurką wylotową w celu zebrania objętości początkowej. Przygotuj kąpiel hartowniczą i trzymaj ją w pobliżu.Jednocześnie uruchom pompy i pozwól, aby około pięciu mililitrów ścieków spłynęło do fiolki z odpadami. Następnie zacznij zbierać nanocząstki w kąpieli hartowniczej jak zwykle. W razie potrzeby można użyć płytki mieszającej do wymieszania kąpieli hartowniczej.Cztery powtórzenia nanocząstek polimerowych z rdzeniem hydrofobowym FNP, przygotowane w mieszalniku CIJ, wykazały wysoką replikowalność i były stosunkowo monodyspersyjne, o średniej średnicy 107 nanometrów. Reprezentatywny niewypał spowodowany powolnym lub nierównomiernym wgłębieniem strzykawki wytworzył nieco większe cząstki, podczas gdy polidyspersja nie została naruszona w tym przykładzie, przerwy w zapłonie mogą skutkować większą dystrybucją polidyspersji. Funkcja automatycznej korelacji DLS zanikła płynnie dla reprezentatywnej próbki nanocząstek polimerowych.Ten gładki rozpad nie został zaobserwowany, gdy próbowano formułować bez stabilizatora z kopolimeru blokowego, który zamiast tego wytwarzał kropelki oleju w skali mikronowej. Względna ilość materiału rdzenia do stabilizatora kontrolowała wielkość cząstek, jak pokazano tutaj, w nanocząstkach z rdzeniem polistyrenowym. PDI wynosił poniżej 0,15 w każdym preparacie.Nanocząstki z hydrofilowymi rdzeniami były produkowane przez IFNP. Cząstki z rdzeniem maltodekstryny, przygotowane w mieszalniku CIJ, miały średnicę około 65 nanometrów, a PDI 0,08. Cząstki z rdzeniem albuminy jaja kurzego przygotowane w mikro MIVM miały średnicę około 125 nanometrów i PDI 0,16.FNP i IFNP to potężne narzędzia do przetwarzania cząsteczek i nanocząstek. Przed wykonaniem którejkolwiek z technik należy wziąć pod uwagę rozpuszczalność każdego składnika we wszystkich rozpuszczalnikach lub mieszaninach rozpuszczalników, aby zapewnić wysokie przesycenie podczas mieszania. Podstawowa technika jest prosta, ale opanowanie kroków depresji strzykawki wymaga trochę praktyki.Jeśli masz z tym problem, rozważ użycie konfiguracji pompy strzykawkowej, takiej jak ta pokazana na tym filmie, aby poprawić spójność. W przypadku naładowanych cząsteczek hydrofilowych lub cząsteczek o średniej rozpuszczalności, FNP można połączyć z hydrofobowym parowaniem jonów, aby umożliwić skuteczną enkapsulację. FNP może być również używany do hermetyzacji wielu związków w tym samym rdzeniu nanocząsteczkowym.Zapoznaj się z tekstem i innymi zasobami literatury, aby dowiedzieć się, jak najlepiej usunąć rozpuszczalniki organiczne z dyspersji nanocząstek w pożądanym zastosowaniu. Istnieje również szereg technik stabilizacji nanocząstek podczas przechowywania.

flash-nanoprecipitation-for-encapsulation-hydrophobic-hydrophilic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Tutaj prezentujemy niezawodną metodę monitorowania inkorporacji nanocząstek do matrycy gospodarza polimeru poprzez enkapsulację pęcznienia. Pokazujemy, że stężenie powierzchniowe kropek kwantowych selenku kadmu można dokładnie zobrazować za pomocą przekrojowego obrazowania fluorescencyjnego.

Zaawansowana analiza składu kompozytów nanocząstkowo-polimerowych z wykorzystaniem bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego

Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania zapewnia szybkie, powtarzalne podejście do prototypowania syntezy wrażliwych na bodźce mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych) o wąskim rozkładzie rozmiarów. W tej syntezie protokołu demonstruje się charakterystykę rozpraszania światła i śledzenie fluorescencji pojedynczych cząstek tych mikrożeli w mikroskopii szerokokątnej.

Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Niniejsza praca opisuje metodę wytwarzania nanokryształów micelarnych, wyłaniającej się głównej klasy nanobiomateriałów. Ta metoda łączy w sobie elektronatryskiwanie od góry do dołu, samoorganizację od dołu do góry i kontrolę struktury na bazie rozpuszczalnika. Metoda wytwarzania jest w dużej mierze ciągła, może wytwarzać produkty wysokiej jakości i posiada niedrogie środki kontroli struktury.

Wytwarzanie sferycznych i ślimakowatych nanokryształów micelarnych poprzez połączenie elektrorozpylania, samoorganizacji i kontroli struktury na bazie rozpuszczalnika

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Poznaj technikę nanoprecypitacji błyskawicznej FNP do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych. Metoda ta umożliwia skalowalną produkcję nanocząstek o zastosowaniu w systemach dostarczania leków.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Przeglądaj więcej filmów