Name: Test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Poznaj szybki test konkurencji płytkowej do oceny kompostów pod kątem supresji Rhizoctonia solani. Ta metoda pozwala badać biologiczną kontrolę patogenów glebowych w ciągu kilku dni zamiast tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

The Vermont Agricultural Experiment Station Competitive Hatch Program VT-HO1609 sfinansował badania. Lynn Fang użyła tej metody w ramach swojej pracy magisterskiej na Uniwersytecie Vermont6.

1. Przygotowanie wstępne
<ol>
	<li>Główna kultura grzybów (organizm testowy)
	<ol>
		<li>Zamów z American Type Culture Collection, Microbiology Collection9, według jego teleomorfu Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) lub MYA 4031.</li>
		<li>Alternatywnie: zebrać izolaty lokalne w sposób opisany przez autorów. Siewki rzodkiewki czerwonej (Raphanus sativus) dobrze sprawdzają się jako rośliny pułapkowe; należy zebrać glebę z miejsca, w którym odnotowano występowanie choroby zrzucania siewek lub zgnilizny korzeni wywołanej przez R. solaniWysiać nasiona do gleby, a następnie wyizolować patogen z zmian korzeniowych, gdy siewki będą miały od 3 do 4 tygodni.
		<ol>
			<li>Usuń siewki z gleby i opłucz je wodą z kranu. Poszukaj brązowej tkanki w obszarze podlistowia pomiędzy liśćmi a korzeniem (Rycina 1).</li>
			<li>Za pomocą jednostronnej żyletki należy wyciąć 1-centymetrowe odcinki podkiełznia lub korzenia o brązowym zabarwieniu. Używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, należy zanurzyć odcinki w 10% roztworze domowego wybielacza na 1 minutę, a następnie opłukać przez 10 sekund w sterylnej wodzie. 
			UWAGA: Górna i dolna część sterylnej szalki Petriego mogą służyć jako przydatne pojemniki na tym etapie.</li>
			<li>Używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, przenieś fragmenty roślin na papierowy ręcznik, aby je osuszyć, a następnie umieść je na powierzchni szalki Petriego z agarem wodnym (15 g w 1 l).</li>
			<li>Umieść szalkę Petriego w plastikowym pojemniku z pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej (około 20 °C). Przetrzyj wnętrze pojemnika 10% roztworem wybielacza lub 75% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed włożeniem szalki.</li>
			<li>Przechowywać izolaty w długoterminowym magazynie na skosach z minimalnego podłoża agaru z mąką kukurydzianą (17 g w 1 L) (przy 5 °C).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Zapadanie siewek wywołane przez Rhizoctonia solani, schemat oceny nasilenia choroby, porażony podsiewka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Objawy choroby. Gleba zawierająca R. solani skutkuje nierównomiernym kiełkowaniem i wzrostem siewek (lewo). Objawy u siewek rzodkwi występują w postaci brązowych zmian martwiczych na podsadzce (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<ol start="2">
	<li>Do przygotowania inokulum do tego testu na płytkach należy użyć szalek z agarem ziemniaczanym (39 g w 1 L).
	<ol>
		<li>Na jeden lub dwa dni przed testem należy przygotować kulturę potomną Rhizoctonia na agarze ziemniaczanym, aby zapewnić jej odpowiedni wzrost na płytce przed rozpoczęciem badania. Kulturę potomną rozpoczyna się poprzez przeniesienie niewielkiego fragmentu (10 mm średnicy) R. solani z kultury głównej do centrum nowej płytki z agarem ziemniaczanym (Rysunek 2). 
		UWAGA: Pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub przetrzeć blat laboratoryjny 10% roztworem wybielacza lub 75% etanolem, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Autoklawować probówki o pojemności 25 mL zawierające aliquoty 10 mL wody destylowanej (2 x liczba próbek).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek do badania
<ol>
	<li>Do probówek o pojemności 25 mL wlej 10 mL autoklawowanej wody i dodaj dwie niezależne próbki o masie 0,5 g z każdej badanej próbki kompostu. Wstrząsaj probówki przez noc.
	<ol>
		<li>Oznacz probówki unikalnymi numerami próbek, a każdy element pary jako A (referencyjny) lub B (próbka).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 h dodaj 1,5 g czystego agaru do 90 mL wody destylowanej w dwóch kolbach stożkowych o pojemności 125 mL.</li>
	<li>Autoklawuj obie kolby stożkowe z agarem oraz próbkę A z każdej pary przez 20 min przy ustawieniu powolnego upustu pary.</li>
	<li>Po autoklawowaniu umieść kolby stożkowe z agarem w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C aż do osiągnięcia stanu równowagi (około 30 min). Nie wkładaj zawiesin próbek do kąpieli wodnej, dopóki nie ochłodzi się ona do 45 °C.</li>
</ol>
<img alt="Wzrost Rhizoctonia na agarze z wyciągu z kompostu po 2 dniach; schemat próbek autoklawowanych i żywych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Ilustracja protokołu. Korki z *R. solani* umieszcza się na szalkach Petriego zawierających wodny ekstrakt z kompostu. Średnicę wzrostu grzybni mierzy się po 1–2 dniach przy użyciu stereomikroskopu w celu poprawy rozdzielczości i kontrastu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<ol start="5">
	<li>Wlej zawiesinę kompostową z próbki A (autoklawowana referencja) do stopionego agaru w kolbie A. Zamieszaj okrężnymi ruchami, aby rozprowadzić kompost w agarze.</li>
	<li>Wlej zawiesinę kompostową z próbki B (próbka żywa) do stopionego agaru w kolbie B. Zamieszaj okrężnymi ruchami, aby rozprowadzić kompost w agarze.</li>
	<li>Rozlej zawartość każdej z kolb do pięciu plastikowych szalek Petri o średnicy 10 mm.</li>
	<li>Pozostaw szalki do ostygnięcia na całą noc, aż agar stężeje.</li>
</ol>
3. Dodanie wyzwania Rhizoctonia
<ol>
	<li>Stosując technikę aseptyczną, przenieś fragmenty R. solani o jednakowej wielkości na każdą parę szalek agarowych z próbkami (do wycięcia fragmentów o równym rozmiarze dobrze sprawdza się wycinak korkowy o średnicy 3 do 5 mm). Pobieraj fragmenty z zewnętrznej krawędzi kolonii, aby mieć pewność, że grzybnia aktywnie rośnie. 
	UWAGA: Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub przemyj blat laboratoryjny 10% wybielaczem lub 70% etanolem.</li>
	<li>Inkubuj szalki w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni, aż wzrost kolonii osiągnie około połowy odległości do krawędzi szalek A.</li>
</ol>
4. Pomiar wzrostu R. solani
<ol>
	<li>Zmierz promień grzybni na każdej płytce z dokładnością do 1 mm, używając przezroczystej płaskiej linijki oraz stereomikroskopu z oświetleniem przechodzącym. 
	UWAGA: Oświetlenie skośne lub ciemne pole ułatwią dostrzeżenie i pomiar przezroczystych strzępek. Na tym etapie, jeśli kompost wykazuje właściwości supresyjne, wokół fragmentów kompostu na płytce B widoczne będą strefy zahamowania wzrostu.</li>
	<li>Zapisz pomiary promienia w trzech miejscach na każdej płytce, a następnie oblicz ich średnią, która będzie służyć jako miara reprezentatywna.</li>
	<li>Odejmij średnią z płytek B od średniej z płytek A. Jeśli B &lt; A, oznacza to, że w płytkach B znajdują się mikroorganizmy wykazujące działanie supresyjne wobec patogenu R. solani.</li>
	<li>Podziel średni promień przez liczbę dni trwania próby, aby wyrazić jednostki względnej supresji jako tempo wzrostu w mm grzybni na dzień.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia%5BTitle%5D)+AND+%22Spanish+Journal+of+Agricultural+Research%22%5BJournal%5D)">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li>
<li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li>
<li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Civil+Engineering%22%5BJournal%5D)">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li>
<li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li>
<li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+indicators+of+compost-mediated+disease+suppression+against+the+soilborne+plant+pathogen+Rhizoctonia+solani%22">Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani</a>. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li>
<li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Compost+Science+and+Utilization%22%5BJournal%5D)">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018).</li>
<li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR%2C+UV+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiemy z poprzednich badań, że niektóre komposty są skuteczne w tłumieniu R. solani i że efekty hamujące wynikają z mikroorganizmów żyjących w kompoście, a nie z abiotycznych właściwości kompostu 6,8. Stosowanie autoklawowania jako środka do "zabijania" mikrobioty jest krytykowane, ponieważ wpływa na skład chemiczny węgla w pożywkach10. Porównaliśmy zastosowanie autoklawowania z filtracją próżniową za pomocą papieru Whatman nr 1. Z...

Rhizoctonia reprezentuje szeroki kompleks grzybów, z których Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) jest patogenem powodującym zgniliznę korzeni i tłumienie1. Rhizoctonia solani jest agresywnym patogenem i saprofitem, który może przetrwać jako sklerocja w niekorzystnych warunkach środowiskowych1. W rezultacie występuje na całym świecie i może powodować choroby u wielu różnych gospodarzy roślin, w tym Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae i Brassicaceae, powodując poważne straty ekonomiczne.
Kompost ma zdolność do przechowywania środków kontroli biologicznej dla niektórych patogenów roślin2. Jednak nie wszystkie komposty są takie same ani nie wpływają w podobny sposób na wszystkie patogeny3. Węgiel drewnopochodny ma wyższy stosunek ligniny do celulozy niż komposty na bazie siana lub węgla ze słomy. R. solani preferuje łatwo dostępny węgiel znajdujący się w słomie. Natomiast grzyby kontroli biologicznej, takie jak Trichoderma spp., są bardziej skuteczne, gdy węgiel jest trudniej dostępny. Pożyteczne grzyby i bakterie w kompoście mogą tłumić choroby roślin poprzez konkurencję, antagonizm lub regulację wzrostu roślin3. Proponowany test wykrywa przede wszystkim antagonizm powstały w wyniku produkcji antybiotyków, ekoenzymów lub chelatorów, które są szkodliwe dla patogenu.
Testy biologiczne roślin są złotym standardem do określenia, czy komposty sprzyjają, czy hamują wzrost roślin4. Jednak testy biologiczne roślin są czasochłonne (tygodnie do miesięcy), co może być dłuższe niż pożądane i wymaga więcej pracy w celu ekstrakcji roślin z korzeniami w celu ilościowego określenia ciężkości systemów korzeniowych. Porównywalnie solidne, ale szybsze (dniowe) testy byłyby idealne dla programów kontroli jakości. Celem tego artykułu jest zademonstrowanie stosunkowo szybkiego i dokładnego testu do przewidywania potencjału tłumiącego kompostu. Metoda była wzorowana na Alfano i wsp.5 z dwoma wyjątkami, ekstrakty kompostowe zostały rozcieńczone i zamiast agaru z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) użyto agaru wodnego. R. solani rośnie szybko na prostych pożywkach wodnych, podczas gdy PDA sprzyja rozwojowi bakterii i innych grzybów, które zanieczyszczają kulturę6.
Ten test płytkowy służy jako wskaźnik tłumienia, który dotyczy szeregu patogenów roślinnych, które przetrwały w glebie jako saprofity, w tym R. solani7, Alternaria wczesne zarazy, więdnięcie Fusarium, zgnilizna korzeni Phytophthora i zgnilizna korzeni Pythium. Test konkurencji płytkowej jest przydatny do badania przesiewowego szeregu produktów kompostowych pod kątem zawierania zbiorowisk drobnoustrojów, które służą jako środki kontroli biologicznej patogenów glebowych. Test był jednym z najbardziej spójnych wskaźników tłumienia chorób w komercyjnych produktach kompostowych6,8. Produkty zostały wybrane ze względu na ich różnorodność pod względem receptury, dojrzałości i procesu produkcji.

<table><tbody><tr><td>autoklawowalna szklana kolba stożkowa z wąską szyjką</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-040D</td><td>125-ml</td></tr><tr><td>autoklawowalne szklane probówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925J</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>odwodniony agar granulowany</td><td>ilość Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>500 g</td></tr><tr>rękawice<td>żaroodporne</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEMGG1314WL</td><td>kilka marek dostępnych</td></tr><tr><td>Parafilm (paski o szerokości 2-3 cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM992 13-374-16</td><td>Jednorazowe</td></tr><tr><td>polistyrenowe szalki Petriego</td> o szerokości 5 lub 10 cm <td>Fisher Scientific</td><td>R80116</td><td>jest dostępny w rękawach po 20 sztuk lub w pudełkach po 500</td></tr><tr><td>suszonych agarów z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0013-15-8</td><td>jest dostępny w ilościach 100, 500 i 2000 gramów</td></tr><tr><td>wytrząsarka samostronna</td><td>Thomas Scientific</td><td>1227Y31</td><td>inne modele będą działać</td></tr><tr><td>kąpiel wodna</td><td>ThermoScientific</td><td>S37363</td><td>5L</td></tr><tr><td>przezroczysta linijka ogólnego przeznaczenia, płaska, co najmniej 10 cm</td><td>Dowolna</td><td></td><td>reguła metryczna</td></tr><tr><td>Kultura ATCC Amerykańska</td><td>kolekcja kultur typu</td><td>amerykańskiego ATCC 10154</td><td>teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) lub MYA 4031;</td></tr><tr><td>taśma laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15935</td><td>autoklawowalna i usuwalna, preferowany</td></tr><tr><td>wodoodporny marker</td> o szerokości 1 cala materiał <td>biurowy lub naukowy</td><td>Cienka końcówka Sharpie</td><td>napisz numer próbki na taśmie</td></tr></tbody></table>

test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

Celem było opracowanie i zoptymalizowanie prostego, niedrogiego i skutecznego testu biologicznego do wykrywania zdolności tłumienia chorób przez konkretny kompost przeciwko przenoszonemu przez glebę grzybowi Rhizoctonia solani. R. solani jest patogenem wielu różnych żywicieli roślinnych na całym świecie. Grzyb przeżywa w glebie jako saprofity i szybko rośnie na prostych pożywkach z agarem wodnym. Test płytkowy jest szybką metodą porównywania kompostów pod kątem ich zdolności do spowalniania wzrostu R. solani. Test dobrze koreluje również z tłumieniem innych patogenów grzybowych przenoszonych przez glebę, które przetrwają jako saprofity w glebach, takich jak wczesne zarazy Alternaria, więdnięcie Fusarium, zgnilizna korzeni Phytophthora i zgnilizna korzeni Pythium.

Gotowy kompost powinien być stabilny i dojrzały – dwa terminy często używane zamiennie – aby mógł być bezpiecznie pakowany i transportowany oraz nie wywoływał negatywnych skutków podczas końcowego zastosowania4. Stabilność to odporność na rozkład, którą zazwyczaj określa się za pomocą wskaźników aktywności mikrobiologicznej. Ogólne pomiary oddychania mikrobiologicznego mogą określać stabilność kompostu, ale niekoniecznie stopień tłumienia chorób wywoływany...

Prezentowany jest protokół testu konkurencji płytkowej w celu określenia, czy dany kompost może zawierać bakterie i grzyby, które hamują wzrost Rhizoctonia solani.

Test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z biologiczną kontrolą patogenów roślin przenoszonych przez glebę. Złotym standardem w testowaniu materiałów takich jak kompost jest przeprowadzenie testu biologicznego roślin w celu sprawdzenia, czy są one toksyczne dla roślin. Trwa to jednak trzy tygodnie.Tę metodę można wykonać w ciągu około dwóch do trzech dni. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, niedroga i skuteczna. Test ten polega na szybkim przesiewaniu określonego kompostu w celu zahamowania wzrostu Rhizoctonia solani.Jednak test ten może być również stosowany przeciwko innym patogenom roślin przenoszonym przez glebę, takim jak Fusariums, Pythiums i Phytophthoras. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ dba o wyizolowanie i utrzymanie czystej kultury grzyba, unikając jednocześnie zanieczyszczenia. Procedurę izolacji zademonstruje Taylor Readyhough, doktorantka z mojego laboratorium.Emma Wright, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium, zademonstruje test konkurencji. Na początek zasiej nasiona czerwonej rzodkiewki w glebie, o której wiadomo, że w przeszłości występowały choroby wywoływane przez R.solani. Po trzech do czterech tygodniach usuń sadzonki z gleby i spłucz je wodą z kranu.Za pomocą żyletki odetnij jednocentymetrowe segmenty hipokotylu i korzenia, które mają brązowy kolor. Następnie użyj wysterylizowanych płomieniowo kleszczyków, aby zanurzyć segmenty w 10% roztworze wybielacza na jedną minutę. Następnie opłucz segmenty w sterylnej wodzie.Następnie użyj kleszczy wysterylizowanych płomieniem, aby przenieść segmenty na ręcznik papierowy. Osusz segmenty i przenieś je na szalkę Petriego z agarem wodnym. Umieścić szalkę Petriego w pojemniku z pokrywką i inkubować segmenty w temperaturze pokojowej.Aby założyć kulturę potomną, przenieś jeden z segmentów na środek świeżego talerza agaru z dekstrozą ziemniaczaną. Następnie autoklaw 25-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów wody. Dodaj dwie 0,5-gramowe próbki każdej próbki testowej do pary autoklawowanych probówek z 10 mililitrami sterylnej wody i potrząśnij probówkami przez noc.Po 24 godzinach dodaj 1,5 grama zwykłego agaru i 90 mililitrów wody destylowanej do pary stożkowych kolb. Po autoklawowaniu kolb umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie wlać autoklawowaną próbkę referencyjną i żywą próbkę do stopionego agaru.Wlać mieszaniny z każdej kolby do pięciu szalek Petriego. Aby chronić rodzime drobnoustroje, ważne jest, aby nie dodawać kompostu, gdy agar jest zbyt gorący. Dlatego przed dodaniem kompostu pozwól agarowi ostygnąć do 45 stopni Celsjusza.Stosując technikę aseptyczną, przenieść kawałki R.solani na każdą parę płytek z próbkami. Następnie inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Na koniec, użyj przezroczystej, płaskiej linijki i mikroskopu stereoskopowego, aby zmierzyć promień grzybni na każdej płytce z dokładnością do milimetra.W tym protokole ekstrakty z żywych kompostów hamowały wzrost R.solani znacznie bardziej niż próbki autoklawowane, co pokazuje, że efekt był mikrobiologiczny, a nie oparty na składnikach odżywczych. Supresja jest mierzona jako zmniejszenie wzrostu w porównaniu z kontrolą w autoklawie. Na wzrost nie miał wpływu czas dojrzewania lub peklowania kompostu.Na wzrost znaczący wpływ miała metoda kompostowania i składniki receptury, w szczególności wermikompost, procesy pokosu i receptury z korą z twardego drewna. Po opracowaniu technika ta może być kandydatem do komercyjnej certyfikacji kompostu pod kątem właściwości przeciwchorobotwórczych.

a-plate-competition-assay-as-quick-preliminary-assessment-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Poznaj szybki test konkurencji płytkowej do oceny kompostów pod kątem supresji Rhizoctonia solani. Ta metoda pozwala badać biologiczną kontrolę patogenów glebowych w ciągu kilku dni zamiast tygodni.

Test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby

Przeglądaj więcej filmów