Name: Ocena zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj metodę oceny zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. Technika pozwala porównać toksyczność różnych szczepów bakterii i badać interakcje patogen-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za pomoc ze strony głównego ośrodka C. elegans na Tajwanie oraz Laboratorium Diagnostyki Mikrobiologicznej i Oporności na Środki Przeciwdrobnoustrojowe Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung za dostarczenie izolatów Aeromonas. Uznajemy również Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) oraz WormBase. Dziękujemy również Savanze Moore za redakcję rękopisu.
To badanie było częściowo wspierane przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 105-2628-B-006-017-MY3) oraz Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung (NCKUH-10705001) dla P.L. Chen.

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby dowiedzieć się, jak przygotować rozwiązanie.
<ol>
	<li>Aby przygotować M9 medium12, rozpuść 1,5 g KH2PO4, 5,66 g Na2HPO4 i 2,5 g NaCl w 500 ml wody dejonizowanej. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min. Poczekaj, aż ostygnie do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 0,5 ml 1 MMgSO4 przed pierwszym użyciem.</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę dla nicieni (NGM)12, rozpuść 3 g NaCl, 2,5 g peptonu bakteryjnego i 20 g agaru w 1 l wody dejonizowanej. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min. Poczekaj, aż sstygnie do 55 °C w łaźni wodnej, a następnie dodaj 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5% cholesterolu w etanolu i 25 ml buforu fosforanowego. Zamieszaj, aby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Wlej około 5 ml NGM do każdej 6 cm szalki Petriego. Unikaj powstawania pęcherzyków na powierzchni płyty. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na 1 noc i zapakuj w temperaturze 4 °C. Przed użyciem przywróć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Aby przygotować wzbogacony NGM (ENGM), rozpuść 3 g NaCl, 5 g peptonu bakteryjnego, 1 g ekstraktu drożdżowego i 30 g agaru w 1 l wody dejonizowanej. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min. Poczekaj, aż ostygnie do 55 °C w łaźni wodnej i dodaj 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5% cholesterolu w etanolu i 25 ml buforu fosforanowego. Zamieszaj, aby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Wlej około 10 ml ENGM do każdej szalki Petriego o średnicy 9 cm. Unikaj powstawania pęcherzyków na powierzchni płyty. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na 1 noc i zapakuj w temperaturze 4 °C. Przed użyciem doprowadź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Aby przygotować S medium12, przed użyciem wymieszaj 40 ml S Basal, 0,4 ml 1 M cytrynianu potasu, 0,4 ml roztworu metali śladowych, 0,12 ml 1 M CaCl2, 0,12 ml 1 M MgSO4, 40 μL 5% cholesterolu w etanolu i 1 ml 8 mM FudR.</li>
</ol>
2. Synchronizacja C. elegans6,9,12
<ol>
	<li>Umyj około 2,000 robaków w stadium ciężarnym dorosłym 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w probówce o pojemności 15 ml. Wypłucz bakterie 3x, trzymając robaki na dnie tuby.</li>
	<li>Odwirować próbkę przez 1 minutę przy 500 x g, aby ściągnąć robaki. Usuń supernatant i trzymaj robaki w 3,5 ml dejonizowanej wody.</li>
	<li>Do probówki dodać 1 ml NaOCl (10–15%) i 0,5 ml 5 M KOH. Wymieszaj równomiernie, wstrząsając przez <6 minut, aby zlizować ciała robaków.</li>
	<li>Po uwolnieniu jaj z robaków dodaj 10 ml wody dejonizowanej, aby zatrzymać lizę. Wirować przez 1 minutę przy 1 200 x g, aby ściągnąć jaja i usunąć supernatant w jak największym stopniu. Umyć 15 ml pożywki M9 co najmniej 3x, 
	UWAGA: Patrz krok 1.1, aby zapoznać się ze składem podłoża M9.</li>
	<li>Jaja należy przechowywać w 1 ml pożywki M9. Jaja należy transportować do naczynia o średnicy 3,5 cm do inkubacji w temperaturze 20 °C przez jedną noc (około 12–18 godzin). 
	UWAGA: Po inkubacji z jaj wykluwają się larwy robaka, która nazywa się pierwszym stadium larwy (L1).</li>
	<li>Odpipetować 10 μl robaków L1 w pożywce M9. Policz liczbę robaków i oblicz stężenie robaków L1 w pożywce M9.</li>
	<li>Wysiewaj co najwyżej 10 000 inkubowanych robaków w stadium L1 za pomocą pipety na 9 cm płytce ENGM rozsmarowanej Escherichia coli OP50.
	<ol>
		<li>Na tym etapie rozprowadź 0,5 ml wyhodowanej przez noc kultury E. coli OP50 z bulionem Luria-Bertani (LB) na 9 cm płytce ENGM. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16–18 h 
		UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, etap rozsiewania należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury pokojowej przed wysiewem robaków L1. Wysiew co najwyżej 10 000 inkubowanych robaków w stadium L1 na płytce ENGM z E. coli OP50.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować robaki w temperaturze 20 °C przez 44 godziny lub do momentu, gdy osiągną 4. stadium larwy (L4). 
	nuta: Zobacz krok 1.3, aby zapoznać się ze składem podłoża ENGM. Robak ma białą kropkę w kształcie półksiężyca na środku boku ciała w stadium L4.</li>
	<li>Użyj zsynchronizowanych robaków etapu L4 w następujących testach. Użyć dzikich robaków typu N2 w teście przeżywalności C. elegans z Aeromonas dhakensis i teście toksyczności płynnej C. elegans z Aeromonas dhakensis. Użyj robaków RW1596 (myo-3(st386);stEx30[myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) w teście martwicy mięśni C. elegans z Aeromonas dhakensis.</li>
</ol>
3. Test przetrwania C. elegans z Aeromonas6,9
<ol>
	<li>W dniu wysiewu robaków L1 na ENGM rozprzestrzeniających się z E. coli OP50, należy wybrać pojedynczą kolonię każdego z czterech szczepów Aeromonas lub E. coli OP50 i wyhodować odpowiednio 2 ml bulionu LB w temperaturze 37 °C przez 16 h. 
	nuta: Aby uniknąć zanieczyszczenia, ten krok należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym. Wykorzystano tu następujące szczepy bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pożywienia C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany patogenny kliniczny izolat A. dhakensis. A. hydrophila (A) hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 i A. caviae A2-9307121 są reprezentatywnymi izolatami klinicznymi z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.</li>
	<li>Zmierz absorbancję OD600 bulionu bakteryjnego i dostosuj bulion bakteryjny do OD600 = 2.0 z bulionem LB.</li>
	<li>Umieść i rozprowadź 30 μl bulionu bakteryjnego na każdej 6 cm płytce NGM. Hoduj płytki w temperaturze pokojowej przez noc. 
	nuta: Patrz krok 1.2, aby zapoznać się ze składem pożywki NGM.</li>
	<li>W dniu, w którym robaki L1 osiągną stadium L4, losowo wybierz i przenieś 50 robaków na płytkę NGM z każdym z czterech szczepów Aeromonas lub E. coli OP50.</li>
	<li>Inkubować płytki NGM w temperaturze 20 °C aż do zakończenia testu.</li>
	<li>Przenieś wszystkie żywe robaki na nowo przygotowaną płytkę NGM z bakteriami i licz liczbę żywych, martwych i czujnikowych robaków każdego dnia, aż ostatni robak będzie martwy. 
	nuta: Codziennie przenoś robaki na świeżo przygotowaną płytkę NGM w celu podtrzymania infekcji, nawet jeśli używasz sterylnych robaków (np. glp-4 lub z FudR).</li>
	<li>Wykreśl krzywe przeżycia na podstawie obliczeń danych dziennych.</li>
</ol>
4. Test toksyczności cieczy C. elegans za pomocą Aeromonas7
UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Dzień po wysianiu robaków L1 na płytce ENGM rozsmarowanej E. coli OP50, wybierz pojedynczą kolonię każdego z czterech szczepów Aeromonas i E. coli OP50 i posaz z 5 ml bulionu LB każdy w temperaturze 37 °C przez 16 h. 
	UWAGA: W protokole użyto następujących szczepów bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pożywienia C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany patogenny kliniczny izolat A. dhakensis. A. hydrophila (A) hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 i A. caviae A2-9307121 są reprezentatywnymi izolatami klinicznymi z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję OD600 bulionu bakteryjnego.</li>
	<li>Odwirować bulion bakteryjny o sile 3,500 x g przez 15 minut, aby usunąć bulion LB. Ponownie zawiesić bakterie i dostosować bulion bakteryjny do OD600 = 3,0 z pożywką S. Dodaj 195 μl bulionu bakteryjnego w pożywce S do co najmniej 8 dołków 96-dołkowej płytki. 
	nuta: Patrz krok 1.6, aby zapoznać się ze składem podłoża S.</li>
	<li>Zmyj robaki L4 na płytce ENGM za pomocą E. coli OP5 przy użyciu pożywki M9. Dostosuj roztwór robaka do stężenia 5 robaków na μl i dodaj 5 μl roztworu robaka do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że w studzience jest około 25 robaków.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Policz liczbę żywych robaków i martwych robaków po 24, 48 i 72 godzinach. Oblicz wskaźniki przeżywalności każdego dołka za pomocą następującego wzoru: (Żywe robaki/Całkowita liczba robaków) × 100%.</li>
	<li>Narysuj wykres punktowy z dziennym obliczeniem danych.</li>
</ol>
5. C. elegans Test martwicy mięśni za pomocą Aeromonas6
UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, te kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>W dniu, w którym robaki L1 zostaną wysiane na rozsiewaczu ENGM z E. coli OP50, należy wybrać pojedynczą kolonię każdego z czterech szczepów Aeromonas i E. coli OP50 i wyhodować je z 2 ml bulionu LB każdy w temperaturze 37 °C przez 16 h. 
	nuta: Wykorzystano tu następujące szczepy bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pożywienia C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany patogenny kliniczny izolat A. dhakensis. A. hydrophila (A) hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 i A. caviae A2-9307121 są reprezentatywnymi izolatami klinicznymi z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.</li>
	<li>Zmierz absorbancję OD600 bulionu bakteryjnego i dostosuj bulion bakteryjny do OD600 = 2,0 za pomocą bulionu LB. Odczipuj i rozprowadź 30 μl bulionu bakteryjnego na 6 cm płytkach NGM. Hoduj płytki w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>W dniu, w którym robaki L1 osiągną stadium L4, przenieś 50 robaków na każdą płytkę NGM z każdym z czterech szczepów Aeromonas lub E. coli OP50. Inkubować płytki NGM w temperaturze 20 °C. Robaki przenosić co 24 godziny na nowo przygotowane płytki NGM z bakteriami.</li>
	<li>Rób zdjęcia mięśni za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Losowo wybierz 10 robaków na 2% żelu agarozowym w pożywce M9 na szkiełku. Sparaliżuj robaki za pomocą 2 μl 1% azydku sodu w pożywce M9 na agarozie przez mniej niż 5 minut przed zrobieniem zdjęć.</li>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe i uchwyć obrazy mięśni za pomocą filtra białka fluorescencyjnego (GFP) na mikroskopie fluorescencyjnym z kamerą urządzenia sprzężonego z ładunkiem. Uchwyć obrazy mięśni po 24, 48 i 72 godzinach od etapu L4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie analizy obrazu i przygotowanie rysunku za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. 
	nuta: Definicje wyników i poziomów uszkodzeń mięśni są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 3, dla którego kryteria są wymienione w następujący sposób: 3 punkty za brakujące włókna mięśniowe; 2 punkty za pęknięte lub uszkodzone włókna mięśniowe; 1 punkt dla zgiętych włókien mięśniowych; 0 punktów dla zdrowych włókien mięśniowych.</li>
</ol>
6. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie eksperymenty co najmniej trzy razy niezależnie.</li>
	<li>Metodę Kaplana-Meiera można wykorzystać do oceny testów przeżycia C. elegans i zastosować test log-rank do analizy różnic w przeżywalności. Ustaw istotność statystyczną na poziomie 0,05.</li>
	<li>Użyj testu t Studenta, aby przeanalizować wyniki statystyczne testów toksyczności cieczy C. elegans dla dwóch różnych grup. Użyj jednoczynnikowego testu ANOVA do analizy różnic między trzema lub więcej wartościami dla jednej zmiennej niezależnej. Ustaw istotność statystyczną na poziomie 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

C. elegans jest bakteriożernym nicieniem, który naturalnie przyjmuje bakterie jako pokarm i rozwinął skomplikowaną wrodzoną odporność na bakterie podczas procesu ewolucji. Dwa z głównych narządów utrzymujących i wspierających odporność to naskórek i jelita 9,13. Naskórek i pasma mięśni C. elegans przypominają struktury tkanek miękkich u ssaków i ludzi6. Ze względu na te cechy, C. elegans ma zastosowanie jako orga...

Wykazano, że ludzki patogen, Aeromonas, powoduje klinicznie zapalenie żołądka i jelit, infekcje ran, posocznicę i infekcje dróg moczowych1,2. Stwierdzono, że większość chorób związanych z chorobami ludzkimi jest związana z czterema gatunkami bakterii: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii i Aeromonas caviae 2,3,4,5. Wśród chorób zakaźnych Aeromonas infekcje tkanek miękkich mogą powodować ciężką zachorowalność i śmiertelność u ludzi. Warto zauważyć, że martwica mięśni jest najcięższą formą infekcji tkanek miękkich6. Obserwacja przeżywalności i martwicy mięśni Caenorhabditis elegans po zakażeniu jest wygodną metodą spekulacji na temat toksyczności Aeromonas.
Naukowcy już opracowali liczne organizmy modelowe do badania infekcji bakteryjnych. W poprzednich badaniach myszy, danio pręgowane i nicienie wykorzystano jako modele zwierzęce do badania patogenezy i zjadliwości Aeromonas6,7,8. Każdy model zwierzęcy ma swoje zalety i zastosowania. Organizm modelowy, Caenorhabditis elegans, jest bakteriożernym nicieniem, który w naturalny sposób przyjmuje bakterie jako pokarm. C. elegansrozwinął skomplikowany wrodzony układ odpornościowy chroniący przed infekcjami bakteryjnymi w trakcie swojej ewolucji. Udowodniono, że pod wpływem stresu związanego z infekcją bakteryjną C. elegans jest doskonałym modelem infekcji do badania patogenezy bakteryjnej Aeromonas6,7,9 i innych patogenów, takich jak grzyb10 i enterokrwotoczny Escherichia coli O157:H711. Jednak nadal nie ma publikacji, która skupiałaby się na metodologii wykorzystania C. elegans jako modelu do badania zjadliwości Aeromonas.
Tutaj wprowadzamy trzy różne eksperymenty do badania infekcji Aeromonas przy użyciu C. elegans jako modelu zwierzęcego: testy na przeżycie, toksyczność płynów i martwicę mięśni. Metody te są wygodnym sposobem oceny toksyczności wśród gatunków Aeromonas i w ich obrębie oraz poprawy zrozumienia patogenezy Aeromonas.

<table><tbody><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Inkubacja bakterii</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>Przygotowanie pożywki hodowlanej&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>Pożywka hodowlana preparat&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>Pożywka hodowlana przygotowanie&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>Pożywka hodowlana&nbsp;</td></tr><tr><td>etanol</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka Petriego 6 cm</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>płytki agarowe</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>płynny test</td></tr><tr><td>peptonowy bakteryjny</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>Pożywka hodowlana&nbsp;</td></tr><tr><td>kwas cytrynowy i byk; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>cytrynian tri-potasu i byk; H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>disodowe EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>Pożywka hodowlana preparat&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>trypton</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>Przygotowanie podłoża hodowlanego&nbsp;</td></tr><tr><td>System mikroskopowy</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipase Ti odwrócone&nbsp;</td><td>obrazowanie mikroskopowe</td></tr><tr><td>Naukowa kamera CCD</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>Retiga-2000R Szybki 1394&nbsp;</td><td>obrazowanie mikroskopowe</td></tr></tbody></table>

ocena zjadliwości i patogenezy zakażenia aeromonas w modelu caenorhabditis elegans

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Klinicznie wykazano, że ludzki patogen Aeromonas powoduje zapalenie żołądka i jelit, infekcje ran, posocznicę i infekcje dróg moczowych. Stwierdzono, że większość chorób u ludzi jest związana z czterema gatunkami bakterii: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii i Aeromonas caviae. Organizm modelowy Caenorhabditis elegans jest bakteriożercą, który stanowi doskonały model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej Aeromonas. W tym miejscu przedstawiamy trzy różne eksperymenty w celu zbadania infekcji Aeromonas przy użyciu modelu C. elegans, w tym testy przeżycia, toksyczności płynów i martwicy mięśni. Wyniki trzech metod określających zjadliwość Aeromonas były spójne. Wykazano, że A. dhakensis jest najbardziej toksyczny spośród 4 głównych gatunków Aeromonas powodujących infekcje kliniczne. Wykazano, że metody te są wygodnym sposobem oceny toksyczności wśród i w obrębie gatunków Aeromonas i przyczyniają się do lepszego zrozumienia patogenezy zakażenia Aeromonas.

Postępując zgodnie z opisanymi powyżej protokołami, można łatwo odróżnić toksyczność czterech szczepów Aeromonas. Test przeżywalności C. elegans przedstawiono na Ryc. 1. Wskaźniki przeżywalności C. elegans zakażonych gatunkami Aeromonas, przedstawione w kolejności malejącej, wynosiły odpowiednio dla: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila oraz A. dhakensis. Pomimo zróżnicowania toksyczności pomiędzy gatunkam...

Tutaj przedstawiamy trzy różne eksperymenty do badania infekcji Aeromonas u C. elegans. Korzystając z tych wygodnych metod, łatwo jest ocenić toksyczność wśród i w obrębie gatunków Aeromonas.

Ocena zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen, takie jak patogenność i zjadliwość infekcji bakteryjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy ocenić toksyczność wśród i w obrębie gatunków Aeromonas oraz przyczynić się do zrozumienia patogenezy infekcji Aeromonas. Na początek umyj około 2 000 dorosłych robaków sterylną wodą dejonizowaną.Powtórz pranie trzy razy, trzymając robaki na dnie tuby. Po odwirowaniu robaków usuń supernatant i trzymaj robaki w 3,5 mililitra wody dejonizowanej. Dodaj jeden mililitr podchlorynu sodu i 0,5 mililitra wodorotlenku potasu do probówki.Następnie potrząsaj probówką przez sześć minut, aby zlizować ciała robaków. Po uwolnieniu jaj dodaj 10 mililitrów wody dejonizowanej, aby zatrzymać lizę. Następnie odwiruj probówkę, aby ściągnąć jaja i usunąć jak najwięcej supernatantu.Umyj jajka 15 mililitrami pożywki M9 co najmniej trzy razy. Przenieś jaja do 3,5-centymetrowego naczynia i wysiaduj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez jedną noc. Następnie usuń z płytki 10 mikrolitrów robaków L1 i pożywki M9.Policz robaki i uzyskaj stężenie robaków L1 w pożywce M9. Za pomocą pipety weź 0,5 mililitra bulionu E.coli OP50 LB i rozprowadź go na płytce ENGM. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin.Schłodzić ENGM do temperatury pokojowej. Następnie wysiewaj inkubowane robaki L1 na płytce ENGM z E.coli OP50. Inkubuj robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż osiągną etap L4.Najpierw wybierz pojedynczą kolonię każdego z czterech szczepów Aeromonas i hoduj je zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie zmierz absorbancję OD 600 bulionu bakteryjnego i dostosuj ją, aż absorbancja będzie równa 2,0. Następnie umieść i rozprowadź 30 mikrolitrów bulionu bakteryjnego z każdego szczepu na płytkach NGM.Losowo wybierz i przenieś wcześniej przygotowane robaki L4 na płytki NGM ze szczepami Aeromonas. Następnie inkubować płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż do zakończenia testu. Każdego dnia przenieś wszystkie żywe robaki na nową płytkę NGM z bakteriami.Licz liczbę żywych, martwych i czujników robaków każdego dnia, aż ostatni robak będzie martwy. Po wyhodowaniu szczepów Aeromonas i zmierzeniu ich absorbancji zgodnie z wcześniejszym opisem, odwirować bulion bakteryjny o stężeniu 3 500 g przez 15 minut. Dostosuj bulion bakteryjny za pomocą S Medium.I dodaj 195 mikrolitrów bulionu bakteryjnego w pożywce S do ośmiu dołków 96-dołkowej płytki. Zmyj robaki z płytki ENGM za pomocą pożywki M9. Następnie dostosuj stężenie roztworu robaka do pięciu robaków na mikrolitr.Dodaj pięć mikrolitrów roztworu robaka do każdego z dołków 96-dołkowej płytki. Inkubować płytkę na shakerze i policzyć liczbę żywych robaków po 24, 48 i 72 godzinach. Po wyhodowaniu szczepów Aeromonas i dostosowaniu absorbancji zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić i rozprowadzić bulion bakteryjny na płytkach NGM.Następnie przenieś 50 robaków L4 na każdą płytkę NGM. Co 24 godziny przenieś robaki na świeże płytki NGM. Losowo wybierz 10 robaków i przenieś je do 2% żelu agarozowego w pożywce M9 na szkiełku.Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe na żelu i uchwyć obrazy mięśni za pomocą zielonego fluorescencyjnego filtra białkowego na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę. W protokole tym oceniono toksyczność czterech szczepów Aeromonas. Wskaźnik przeżywalności C.elegans zakażonych gatunkami Aeromonas był najwyższy w testach z użyciem A.caviae, a najniższy w testach z użyciem A.dhakensis.W płynnym teście toksyczności przeżywalność C.elegans znacznie się zmniejszyła w przypadku zakażenia A.dhakensis lub A.hydrophilia. W teście martwicy mięśni stopnie uszkodzenia mięśni różniły się w zależności od gatunku Aeromonas. A.caviae spowodował najmniejsze uszkodzenia mięśni, podczas gdy A.dhakensis spowodował najwięcej uszkodzeń mięśni.Metody opisane w tym filmie oferują wygodny sposób różnicowania różnorodności wirulencji wśród i w obrębie gatunków Aeromonas. Ponadto jest to również wiarygodny model, za pomocą którego można badać interakcję między patogenem a gospodarzem.

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny...

Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje test przeżycia z użyciem C. elegans do modelowania patogenezy Aeromonas , gdzie doustne spożycie bakterii prowadzi do infekcji i śmiertelności jelit, umożliwiając ilościową ocenę zjadliwości bakterii w żywym systemie gospodarza.

Modelowanie patogenezy aeromonasów u C. elegans za pomocą testu przetrwania

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Ten film demonstruje test toksyczności cieczy C. elegans z użyciem Aeromonas, metodę służącą do oceny zjadliwości bakterii poprzez pomiar przeżywalności robaków w środowisku ciekłym o ograniczonym zawartości składników odżywczych. Test wykazuje patogenność specyficzną dla szczepu na podstawie zakresu uszkodzeń i śmiertelności wywołanej toksynami u C. elegans.

Ocena zjadliwości bakteryjnej za pomocą testu toksyczności płynnej C. elegans

Źródło: Chen, Y. i in., Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje test martwicy mięśni u C. elegans (Caenorhabditis elegans) z użyciem patogennych szczepów Aeromonas . Poprzez karmienie zielonych białek fluorescencyjnych (GFP) na płytkach z nasionami Aeromonas, test modeluje infekcję bakteryjną i ujawnia uszkodzenia tkanek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Postępująca utrata struktury mięśniowej i sygnału...

Badanie martwicy mięśni u C. elegans wywołane przez patogenny szczep aeromonas

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę oceny zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. Technika pozwala porównać toksyczność różnych szczepów bakterii i badać interakcje patogen-gospodarz.

Ocena zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów