Name: Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj technikę powlekania DNA origami chitozanem i LPEI, aby chronić nanostruktury przed degradacją enzymatyczną w środowisku biologicznym. Metoda zwiększa pobór komórkowy i umożliwia funkcjonalizację powierzchni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 686647. Obrazy TEM zostały zarejestrowane na maszynie Morgagni pracującej pod napięciem 80 kV w obiekcie EM należącym do Vienna Biocenter Core Facilities GmbH (VBCF). Serdecznie dziękujemy Tadiji Kekic za pomoc w projekcie graficznym oraz Elisie De LIano za zaprojektowanie szkieletowej nanostruktury.

1. Przygotowanie roztworu zapasowego polikationu
<ol>
	<li>Roztwór zapasowy LPEI
	<ol>
		<li>Do zlewki szklanej zawierającej &lt;10 mL H2O dodać 10 mg LPEI.</li>
		<li>Aby całkowicie rozpuścić LPEI, dodawać HCl (32%) do osiągnięcia pH 2,0.</li>
		<li>Dostosować pH do wartości 7,0 poprzez dodanie NaOH (10 M).</li>
		<li>Uzupełnić objętość do uzyskania stężenia końcowego 1 mg/mL.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór zapasowy LPEI przez membranę 0,22 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór zapasowy chitosanu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 16,6 mg mleczanu oligosacharydu chitosanu (Mw ~ 5 kDa, 60% składu oligosacharydowego, deacetylowany z chityny w 90%) w 1 mL wodnego roztworu kwasu octowego (10%), aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie nanostruktur DNA origami
<ol>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 mL zmieszaj 100 µL próbki origami DNA (w buforze 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl (oznaczonym jako TB) z dodatkiem 18 mM MgCl2) z równą objętością (100 µL) buforu TB uzupełnionego o 22 mM MgCl2.</li>
	<li>Dodaj 200 µL buforu oczyszczającego (15% (w/v) PEG 8,000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA oraz 505 mM NaCl). Delikatnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki.</li>
	<li>Wiruj próbkę przy 16,000 × g w temperaturze pokojowej (r.t.) przez 25 min.</li>
	<li>Ostrożnie odlej nadsącz i resuspenduj osad w buforze TB uzupełnionym o 16 mM MgCl2. Nadsącz zawiera nadmiar nici stapli, natomiast osad zawiera wytrącone origami DNA.</li>
	<li>Inkubuj próbkę przez jeden dzień w temperaturze pokojowej (r.t.) przy 650 rpm w termomikserze. Krok ten służy do całkowitej resuspensji origami DNA.</li>
</ol>
3. Elektroforeza w żelu agarozowym (AGE)
<ol>
	<li>Do zlewki szklanej dodać 1.6 g agarozy i 80 mL buforu TAE 0,5x (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM kwasu octowego, pH 8), aby przygotować 2% żel agarozowy. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 5 min. Przez 1 min delikatnie mieszać zawartość zlewki w kąpieli wodnej. Dodać 352 µL MgCl2 (2,5 M), aby uzyskać żel o stężeniu 11 mM MgCl2. Zabarwić żel uprzednio, dodając 10 µL barwnika do żeli DNA.</li>
	<li>Wylać roztwór żelu do suchej formy i włożyć grzebień do elektroforezy. Pozostawić roztwór do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-30 min.</li>
	<li>Uzupełnić bufor do prowadzenia (bufor TAE 0,5x) o 11 mM MgCl2.</li>
	<li>Zmieszać 10-20 µL próbki z 20% objętościowo 6x buforu do ładowania (30% (v/v) glicerolu, 0,25% (w/v) błękitu bromofenolowego, 0,25% (w/v) xylene cyanol FF) i nanieść do studzienek żelu agarozowego.</li>
	<li>Prowadzić elektroforezę przy napięciu 70 V w temperaturze pokojowej przez 2,5-3 h.</li>
	<li>Wizualizować żel za pomocą skanera UV.</li>
</ol>
4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa z barwieniem negatywowym (nsTEM)
<ol>
	<li>Nanieś 5 µL rozcieńczonej nanostruktury lub polypleksu na siatkę TEM Cu400 pokrytą węglem i poddaną wyładowaniom żarowym. Pozostaw do adsorpcji na ok. 1 min.</li>
	<li>Odsącz nadmiar cieczy z krawędzi siatki za pomocą kawałka papieru filtrującego.</li>
	<li>Nanieś 5 µL 2% wodnego roztworu octanu uranylu i odczekaj 1 min.</li>
	<li>Użyj krawędzi papieru filtrującego, aby całkowicie odsączyć nadmiar cieczy z krawędzi siatki.</li>
	<li>Pozostaw siatkę do całkowitego wyschnięcia przed wprowadzeniem jej do TEM.</li>
</ol>
5. Tworzenie polipleksów
UWAGA: Przykład ilustrujący przygotowanie polypleksu składającego się z origami DNA i chitosanu przy stosunkach N/P 0,01-8.
<ol>
	<li>Oblicz liczbę grup aminowych na polikation, korzystając z formuły-1 (Tabela 1).</li>
	<li>Zmierz stężenie oczyszczonego DNA origami za pomocą spektrofotometru UV przy 260 nm. W celu kalibracji urządzenia użyj 2 µL buforu TB jako próbki ślepej. Oblicz „nmol fosforanu”, korzystając z formuły-2.</li>
	<li>Przygotuj 15 µL struktury DNA origami zawierającej 1 nmol fosforanu.</li>
	<li>Użyj formuły-3, aby obliczyć objętość chitozanu niezbędną do przygotowania polipleksu przy N/P 0,01-8. Na przykład, aby przygotować polipleks przy N/P 8, wymagane jest 1,8 µL chitozanu (0,8 mg/mL) (przy N/P wynoszącym 8, liczbie moli fosforanu równej 1, masie cząsteczkowej chitozanu 5 000 g/mol, stężeniu roztworu zapasu chitozanu 0,8 mg/mL oraz liczbie grup aminowych na cząsteczkę chitozanu równej 28). Dodaj 13,2 µL buforu TB do 1,8 µL chitozanu (0,8 mg/mL). Dodaj 15 µL roztworu chitozanu (0,8 mg/mL) do 15 µL DNA origami z kroku 5.3, aby otrzymać polipleks DNA origami-chitozan z N/P 8. Polipleks tworzy się samoistnie.</li>
	<li>Powtórz krok 5.4, aby przygotować polipleksy o różnych stosunkach N/P.</li>
	<li>Przeprowadź AGE zgodnie z opisem w kroku 3 (Rycina 1A). Jako kontrolę uwzględnij nieosłonięte DNA origami.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie polipleksu zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 2). 
	 
	Formuła-1) liczba grup aminowych na polikation 
	<img alt="Równanie stosunku masy cząsteczkowej, chemia polielektrolitów, formuła edukacyjna, analiza biochemiczna." src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	 
	Formuła-2) mole fosforanu 
	=<img alt="Równanie stężenia DNA origami; obliczenia z wykorzystaniem masy cząsteczkowej, ng/µL oraz objętości w µL." src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	 
	Formuła-3) Objętość (µL) polikationów 
	=<img alt="Formuła analizy polimerów, obliczanie stosunku N/P, równanie analizy grup fosforanowych i aminowych." src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
</ol>
6. Dekapsulacja z użyciem siarczanu dekstranu
<ol>
	<li>Oblicz liczbę grup siarczanowych w cząsteczce siarczanu dekstranu, korzystając z wzoru-4 (Tabela 2).</li>
	<li>Oblicz objętość siarczanu dekstranu niezbędną do dekompleksacji polipleksu przy zdefiniowanym stosunku A/P, korzystając z wzoru-5. Stosunek ładunków A/P to stosunek grup siarczanowych polianionu (A) do grup fosforanowych (P) origami DNA. Do wydajnej dekompleksacji polipleksów wymagana jest nadmiarowa ilość siarczanu dekstranu (np. 500-1 000). Na przykład, aby zdekompleksować polipleks przygotowany w sekcji 5 (polipleks zawiera 1 nmol fosforanu) przy A/P 1 000, potrzebne jest 3,6 µL siarczanu dekstranu 40 kDa (50 mg/mL) (A/P wynosi 1 000, liczba moli fosforanu to 1, masa cząsteczkowa siarczanu dekstranu wynosi 40 000 g/mol, stężenie roztworu stokowego siarczanu dekstranu wynosi 50 mg/mL, a liczba grup siarczanowych to 220). Dodaj 3,6 µL siarczanu dekstranu (50 mg/mL) do polipleksu z kroku 5.4 i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>W przypadku pracy z polipleksem chitosanowym, dodaj NaOH, aby ułatwić proces dekompleksacji. Dodaj NaOH do uzyskania stężenia końcowego 10 mM. Pomiń ten krok w przypadku polipleksów LPEI.</li>
	<li>Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym (AGE) zgodnie z opisem w Kroku 3 (Rysunek 1B). Jako kontrolę uwzględnij „gołe” origami DNA oraz polipleks. 
	 
	Wzór-4) liczba grup siarczanowych na polianion= 
	<img alt="Równanie przedstawiające obliczanie masy cząsteczkowej polianionu w analizie chemii polimerów." src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
	 
	Wzór-5) Objętość (µL) siarczanu dekstranu 
	=<img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie fosforanu, obejmujący stężenie siarczanu dekstranu i masę cząsteczkową." src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"></li>
</ol>
7. Stabilność w warunkach niedoboru Mg
<ol>
	<li>Przemyć 20 µL origami DNA lub odpowiedni polipleks (zawierający 2 nmol fosforanu) 4x 600 µL buforu Mg-zero (5 mM Tris, 1 mM EDTA i 30 mM NaCl), korzystając z kolumny do ultrafiltracji (MWCO ~ 3 kDa). Każde przemywanie wirować z prędkością 14 000 × g w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.</li>
	<li>Zebrać pozostały roztwór (80 µL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez jeden dzień przy 650 rpm w termomikserze.</li>
	<li>W przypadku testowania polipleksu LPEI, dodać 2,5 µL MgCl2 (500 mM), aby uzyskać stężenie końcowe 16 mM MgCl2. Następnie dodać 7 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL) (odpowiadającego stosunkowi A/P 1 000), aby rozwinąć rdzeniowe nanostruktury DNA (dekapsulacja, patrz Krok 6). 
	UWAGA: Pominąć ten krok w przypadku pracy z polipleksem chitozanowym lub gołym origami DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w Kroku 3 (Rysunek 2).</li>
</ol>
8. Test miareczkowania DNazą I dla gołych nanostruktur origami DNA
<ol>
	<li>W probówkach PCR o pojemności 0,2 mL wymieszaj 3 µL gołego DNA origami zawierającego 1 nmol fosforanu z 2 µL 10x buforu do DNase I (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6), 1 µL MgCl2 (250 mM) oraz 12 µL wody. Dodaj 2 µL DNase I (10x). Dostosuj stężenie roztworu stokowego DNase I (10x), aby uzyskać końcowe stężenie DNase I na poziomie 0,25-2 U/mL.</li>
	<li>Inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 1-2 h.</li>
	<li>Umieść próbki w lodzie i zneutralizuj aktywność nukleolityczną, dodając 2 µL 500 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 2,5 µL EGTA (33 mM).</li>
	<li>Próbki poddaj analizie za pomocą AGE zgodnie z opisem w kroku 3.</li>
</ol>
9. Stabilność polipleksów wobec DNazy I
<ol>
	<li>W probówce PCR o pojemności 0,2 mL wymieszać 4 µL polipleksu (zawierającego 1 nmol fosforanu, przygotowanego przy różnych stosunkach N/P) z 1,5 µL buforu do DNazy I (10x), 8 µL TB oraz 1,5 µL DNazy I (100 U/mL).</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w termocyklerze.</li>
	<li>Dodać 2 µL proteinazy K (20 mg/mL) w celu strawienia DNazy I. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w termocyklerze. 
	UWAGA: Zamiast trawienia enzymatycznego można przeprowadzić chemiczną dezaktywację DNazy I poprzez dodanie 1,5 µL DTT (500 mM) i 2 µL EGTA (33 mM).</li>
	<li>Dodać 3,6 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL) (odpowiadającego A/P 1 000), aby rozplątać rdzeniowe nanostruktury DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić AGE zgodnie z opisem w kroku 3 (Rycina 3A, Rycina 3C). W ramach kontroli do pomiaru i porównania intensywności prążków na żelu należy uwzględnić świeże origami DNA.</li>
	<li>Wyciąć prążek z żelu AGE i wyekstrahować origami DNA za pomocą kolumny do ekstrakcji metodą mrożenia z wyciskaniem (squeeze freeze extraction), zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 2).</li>
</ol>
10. Stabilność w obecności płodowej surowicy bydlęcej (FBS)
<ol>
	<li>W probówkach PCR o pojemności 0,2 mL zmieszać 4 µL gołego DNA origami lub odpowiadającego mu polypleksu (zawierającego 1 nmol fosforanu) z 17 µL buforu TB + 10% FBS. Należy użyć świeżo rozmrożonego FBS.</li>
	<li>Próbkę inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 ˚C przez 24 h.</li>
	<li>Próbkę zanurzyć w łaźni lodowej.</li>
	<li>W przypadku testowania polypleksu przeprowadzić proces dekapsulacji poprzez dodanie 3,6 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL). Dodatkowo dodać NaOH w przypadku pracy z polypleksami chitozanowymi (patrz krok 6.3).</li>
	<li>Przeprowadzić AGE zgodnie z opisem w kroku 3. Świeże DNA origami należy dołączyć jako kontrolę do pomiaru i porównania intensywności prążków na żelu.</li>
	<li>Wyciąć prążek z żelu AGE i wyekstrahować DNA origami za pomocą kolumny do ekstrakcji metodą squeeze freeze.</li>
	<li>Do wyekstrahowanego roztworu DNA origami (20 µL) w probówce PCR o pojemności 0,2 mL dodać 2 µL proteinazy K (20 mg/mL). Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w termocyklerze w celu strawienia białek surowicy związanych z nanostrukturami.</li>
	<li>Próbkę przemyć 5x 500 µL buforu TB zawierającego 16 mM MgCl2 przy użyciu kolumny do ultrawirowania (MWCO ~ 100 kDa), aby usunąć proteinazę K (MW ~ 28,9 kDa). Każde przemywanie wirować przy 14 000 × g w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 3). 
	UWAGA: Próbkę wyekstrahowaną z żelu w kroku 10.6 można wykorzystać bezpośrednio do obrazowania nsTEM. Jednak obrazowanie może być bardzo trudne ze względu na przyłączenie białek surowicy do nanostruktur DNA origami. Dlatego w celu ułatwienia procesu obrazowania zaleca się traktowanie proteinazą K (kroki 10.7-10.9).</li>
</ol>
11. Badanie adresowalności origami DNA funkcjonalizowanego peroksydazą chrzanową (HRP) po powleczeniu polikationami
<ol>
	<li>Oczyścić samoorganizujące się biotynilowane NR (Biotin-NR) zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Inkubować 200 µL oczyszczonego Biotin-NR (36 nM, w uzupełnionym buforze TB 16 mM) z 200 µL streptawidyny koniugowanej z HRP (540 nM w buforze TB). Dodać 4.8 µL MgCl₂2 (500 mM) do stężenia końcowego 14 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 h przy 650 obr./min w termomikserze</li>
	<li>Oczyść nanorurki funkcjonalizowane HRP (HRP-NR) metodą oczyszczania PEG (opisaną w kroku 2), aby usunąć niezwiązane enzymy HRP. Resuspenduj wytrącony produkt HRP-NR w buforze TB zawierającym 16 mM MgCl2.2.</li>
	<li>Wymieszać 6.5 µL oczyszczonego HRP-NR (36 nM) z 6.5 µL polikationów o różnych stężeniach w celu przygotowania polipleksów przy stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 4, 10 i 20 (przy użyciu formuła 3).</li>
	<li>Powtórz kroki 11.2–11.4 dla niebiotynilowanego NR. Ponieważ enzym HRP może wiązać się niespecyficznie z origami DNA, kontrolą w teście będzie niebiotynilowane origami DNA, które zostało poddane działaniu enzymów HRP i oczyszczone za pomocą PEG (podobnie jak Biotin-NR).</li>
	<li>Wymieszać 6.5 µL wody destylowanej z 6.5 µL polikationów o różnych stężeniach, odpowiadających określonym stosunkom N/P wynoszącym odpowiednio 1, 2, 4, 10 i 20. Próbki te służą jako grupa kontrolna.</li>
	<li>Dodaj roztwór przygotowany w krokach 11.4–11.6 (12.5 µL) do płytki 96-dołkowej, w tym 72.5 µL buforu HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 10 µL 2,2'-azino-bis(3-etylibenzotiazolino-6-kwasu sulfonowego) (ABTS) (15 mM).</li>
	<li>Dodaj 5 µL wodoru2O2 (12 mM) i wymieszać dokładnie, pipetując ciecz w górę i w dół. H2O2 inicjuje reakcję.</li>
	<li>Pomiar absorbancji przy 421 nm przez 4 h za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek (Rycina 4A).</li>
</ol>
12. Badanie adresowalności funkcjonalizowanych aptamerami wiążącymi hemin (HBA) struktur DNA origami po powleczeniu polikationami
<ol>
	<li>Oczyścić nanorurki funkcjonalizowane HBA (HBA-NR) zgodnie z opisem w kroku 2. Zawiesić wytrącony HBA-NR w buforze TB uzupełnionym o 6 mM MgCl2 (wyższe stężenie soli prowadzi do agregacji HBA-NR).</li>
	<li>Zmieszać 10 µL HBA-NR (40 nM) z 10 µL polikationów o różnych stężeniach, aby przygotować polipleksy o określonych stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 10 i 20.</li>
	<li>Zmieszać 10 µL gołych nanorurek (naked-NR, 40 nM) lub wody destylowanej z 10 µL polikationów o różnych stężeniach odpowiadających stosunkom N/P 1, 2, 10 i 20.</li>
	<li>Dodać przygotowany 20 µL roztwór z kroków 12.2 i 12.3 do płytki 96-dołkowej zawierającej 60 µL buforu HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) i dokładnie wymieszać. Należy uwzględnić co najmniej jedną próbkę ślepą, zastępując 20 µL roztworu polipleksu lub polikationu (z kroków 12.2 i 12.3) wodą.</li>
	<li>Dodać 5 µL heminy (0,04 mM), a następnie 10 µL ATBS (15 mM). Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5 min.</li>
	<li>Dodać 5 µL H2O2 (12 mM) i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Zmierz absorbancję przy 421 nm przez 30 min za pomocą wielomodalnego czytnika płytek (Rysunek 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials.+Programmable+materials+and+the+nature+of+the+DNA+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond.</a> Science. 347 (6224), 1260901(2015).</li>
<li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+and+high+yield+fabrication+of+dense+nanoparticle+arrays+onto+DNA+origami+at+statistically+independent+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites.</a> Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).</li>
<li>Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Material%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).</li>
<li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li>
<li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li>
<li>Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+stability+of+DNA+origami+nanostructures+in+low-magnesium+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).</li>
<li>Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+the+instability+of+DNA+nanostructures+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture.</a> ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Gene+Delivery%3A+Principle%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress.</a> The AAPS Journal. 11 (4), 671(2009).</li>
<li>Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+and+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene therapy and DNA delivery systems.</a> International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li>
<li>Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligolysine-based+coating+protects+DNA+nanostructures+from+low-salt+denaturation+and+nuclease+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation.</a> Nature Communication. 8, 15654(2017).</li>
<li>Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+copolymer+micellization+as+a+protection+strategy+for+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).</li>
<li>Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymers+for+DNA+origami+coating+-+examining+their+binding+efficiency+and+tuning+the+enzymatic+reaction+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates.</a> Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).</li>
<li>Perrault, S. D., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-inspired+membrane+encapsulation+of+DNA+nanostructures+to+achieve+in+vivo+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability.</a> ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).</li>
<li>Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Poly%29cation-induced+protection+of+conventional+and+wireframe+DNA+origami+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">(Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures.</a> Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).</li>
<li>Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li>
<li>Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+nanoscale+DNA+assemblies+programmed+from+the+top+down%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down.</a> Science. 352 (6293), 1534(2016).</li>
<li>Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+scaffolded+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li>
<li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (106), 51272(2015).</li>
<li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), 50268(2013).</li>
<li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+complex+two-dimensional+shapes+from+single-stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486(2015).</li>
<li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li>
<li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+protection+and+release+of+DNA%3A+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li>
<li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions%3A+which+is+the+best+and+how+does+it+work%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+An+Asian+Journal%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li>
<li>Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Formation+of+%22Chain-Armor%22-Stabilized+DNA+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).</li>
<li>Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-programmable+covalent+bonding+of+designed+DNA+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies.</a> Science Advances. , 1157(2018).</li>
<li>Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+Coating+Enhances+the+Cellular+Uptake+of+Mesoporous+Silica+Nanoparticles+and+Allows+Safe+Delivery+of+siRNA+and+DNA+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszym raportem.

W samoorganizacji origami DNA, nici zszywkowe są zwykle dodawane w proporcji 5-10 nadmiaru do rusztowania. Te nadmiarowe nici odszywkowe również wiążą się z polikacją i tworzą polipleksy w zakresie monometru, które są dodatkowo trudne do oddzielenia od polipleksów origami DNA. Dlatego krytycznym krokiem w tworzeniu polipleksu jest usunięcie nadmiaru nici zszywek i użycie dobrze oczyszczonych nanostruktur DNA origami.
Opracowano inne metody stabilizacji nanostruktur DNA, takie jak cyklizacja nici DNA poprzez reakcję kliknięcia26. Ponieważ nici zszywkowe modyfikowane alkinami i azydkami są wymagane do tworzenia zazębiających się jednoniciowych pierścieni, technika ta jest ograniczona do stabilizacji małych nanostruktur, takich jak katenan DNA, i nie jest łatwo skalowalna dla większych struktur origami DNA, takich jak te używane w tym protokole. Niedawno Gerling i in.27 opisali metodę tworzenia kowalencyjnych wiązań dimerów pirymidynowych (CPD) między sąsiednimi tymidynami w nanostrukturach DNA za pomocą promieniowania ultrafioletowego. Chociaż metoda ta jest selektywna i skalowalna, jej skuteczność w ochronie origami DNA jest znacznie niższa niż powlekanie polikationowe. Na przykład, obiekty origami DNA stabilizowane CPD wytrzymują tylko 0,4 U/ml DNazy I przez 1 godzinę, podczas gdy polipleksy były stabilne w obecności 10 U/ml DNazy I przez co najmniej jeden dzień.
Krótko mówiąc, chitozan inspirowany terapią genową i powlekanie LPEI jest tanią, jednoetapową i skuteczną metodą rozwiązywania problemów związanych z długoterminową stabilnością nanostruktur origami DNA w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy. Odwracalność tworzenia polipleksu ułatwia jego zastosowanie w wieloetapowych testach diagnostycznych, w których ochrona origami DNA przed degradacją nukleolityczną lub zubożeniem soli jest kluczowa w jednym etapie, ale może powodować problemy w innych etapach, takich jak amplifikacja DNA. Ponadto powlekanie polikacyjne jest potencjalnym podejściem do zwiększenia wychwytu komórkowego nanostruktur origami DNA do zastosowań związanych z dostarczaniem leków28.

DNA to wszechstronny budulec do programowalnego samodzielnego montażu struktur w nanoskali1. Najpopularniejszą metodą tworzenia nanostruktur DNA jest technika origami DNA, która opiera się na samoorganizacji długiego, okrągłego, jednoniciowego rusztowania DNA za pomocą setek krótszych, determinujących kształt syntetycznych nici odszywkowych2. Obecnie tworzenie nanostruktur DNA w prawie każdej geometrii i morfologii jest łatwo wykonalne. Nanostruktury DNA mogą być funkcjonalizowane specyficznie dla miejsca z dużą precyzją3,4 i mogą być zaprogramowane tak, aby ulegały allosterycznym zmianom konformacyjnym5,6. W związku z tym wykorzystanie DNA jako materiału budowlanego daje wyjątkową możliwość tworzenia programowalnych i responsywnych, specjalnie zaprojektowanych nanostruktur do zastosowań w biodetekcji, diagnostyce i dostarczaniu leków. Jednak nanostruktury DNA są podatne na trawienie przez egzo- i endonukleazy, a nanostruktury origami DNA 3D oparte na sieci zazwyczaj wymagają o wysokim zasoleniu (np. 5-20 mM Mg+2), aby zachować ich integralność7,8.
Szybka degradacja DNA przez nukleazy obecne we krwi i macierzy zewnątrzkomórkowej jest główną przeszkodą w efektywnym dostarczaniu in vivo produktów genetycznych do komórek9. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w przypadku dostarczania genów niewirusowych, DNA miesza się z polimerem kationowym przy określonym stosunku ładunku N/P (stosunek amin w polikacji do fosforanów w DNA)10. Kompleks DNA z polimerem kationowym, znany jako polyplex, chroni DNA przed degradacją za pośrednictwem nukleazy i zwiększa jego wychwyt komórkowy11. Zainspirowane postępami w dostarczaniu genów, do stabilizacji nanostruktur DNA origami zastosowano polimery na bazie oligolizyny12, kopolimery oligolizyny i glikolu polietylenowego (PEG)13, polimery na bazie poli(2-dimetyloaminometakrylanu etylu) (PDMAEMA)14 oraz białka kapsydu wirusa15 zostały wykorzystane do stabilizacji nanostruktur DNA origami.
Niedawno opisaliśmy metodę ochrony nanostruktur DNA origami w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy przy użyciu naturalnego kationowego polisacharydu chitozanu i syntetycznej liniowej polietylenoiminy (LPEI)16. Niniejszy artykuł jest adaptacją naszej wcześniejszej pracy i opisuje szczegółowy protokół przygotowania polipleksów, ich charakterystykę, testowanie stabilności nagich i chronionych nanostruktur w pożywkach o niskiej zawartości soli i bogatych w nukleazy oraz badanie adresowalności funkcjonalizowanych enzymami i aptamerami nanostruktur origami DNA po powłoce polikationowej.

<table><tbody><tr><td>10 i razy; Bufor reakcyjny DNazy I</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS (sól diamonowa kwasu 2&prime;-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny ultrawirówki Amicon</td><td>Merck Millipore</td><td>UCF500308, UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>Oligosacharydowy mleczan chitozanu (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylowany, 60%. Skład: oligosacharydy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>Nici odcinkowe specyficzne dla projektu</td><td>Integruj technologie DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu (Mr ~ 4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu (Mr ~ 40 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6&razy;)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (bez RNazy)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) BioUltra, bezwodny, &ge; 99% (miareczkowanie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze Ekstrakcja żelu DNA Kolumny wirujące</td><td>Biorad</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zawiesiny wodoru (32% wag%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki (500 mM ditiotreitol (DTT))</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG, MW ~ 8000 Da)</td><td>Carl Roth</td><td>O263.1</td><td></td></tr><tr><td>Polietylen, liniowy, średnia Mn 10 000, PDI &le; 1.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina, liniowa, średnia Mn 5,000, PDI &le; 1.3</td> Roztwór proteinazy K <td>764582</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(20 mg/ml)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>HRP sprzężony ze streptawidyną</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur dna origami

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

Nanostruktury origami DNA mają ogromny potencjał do wykorzystania w zastosowaniach biologicznych i medycznych. Jednak warunki o niskiej zawartości soli i nukleazy w płynach fizjologicznych indukują denaturację i degradację samoorganizujących się nanostruktur DNA. W przypadku dostarczania genów niewirusowych enzymatyczna degradacja DNA jest przezwyciężana przez enkapsulację ujemnie naładowanego DNA w powłoce kationowej. W niniejszym dokumencie, zainspirowanym postępami w dostarczaniu genów, przedstawiono prostą, jednoetapową i solidną metodologię stabilizacji nanostruktur DNA origami poprzez pokrycie ich chitozanem i liniową polietylenominą. Powłoka polikationowa skutecznie chroni nanostruktury origami DNA w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy. Metoda ta zachowuje również pełną adresowalność funkcjonalizacji nanostruktur DNA opartej na enzymach i aptamerach.

Zaprojektowano trzy nanostruktury origami z DNA o różnych konfiguracjach, w tym nanopręt (NR), nanobutelkę (NB) oraz nanostrukturę szkieletową (WN) (modele 3D nanostruktur przedstawiono na Rysunku 2). NR i NB zostały zaprojektowane odpowiednio w oparciu o sieć kwadratową i plastromiodową przy użyciu oprogramowania caDNAno17, natomiast WN utworzono za pomocą oprogramowania Daedalus18. Kompleksowy protokół projektowania i samoorganizacji nanostruktur DNA został już opublikowany19,20,21,22. Specyficzne dla kształtu nici zszywające (staple strands) zostały zamówione, samoorganizowane i następnie oczyszczone zgodnie z protokołem opisanym przez Stahl et al.23 (krok 2).
Polipleksy scharakteryzowano za pomocą testu opóźnienia w żelu oraz obrazowania nsTEM. Po zmieszaniu origami DNA z polikationami zaobserwowano przesunięcie pasma gołej nanostruktury w stronę katody (Rysunek 1A). Można to przypisać zneutralizowaniu ujemnego ładunku grup fosforanowych podczas wiązania z polikationami oraz ogólnemu zwiększeniu rozmiaru kompleksu. Dodanie nadmiaru polianionów, takich jak siarczan dekstranu, może odwrócić proces tworzenia polipleksów. W tym względzie siarczan dekstranu o wyższej masie cząsteczkowej (MW ~ 40 kDa) okazał się bardziej efektywny w dekompleksowaniu niż siarczan dekstranu o niższej masie cząsteczkowej (MW ~ 4 kDa) (Rysunek 1B).
Podczas obrazowania polipleksów LPEI za pomocą TEM z negatywowaniem octanem uranylu, obrazowanie jakichkolwiek cząstek było utrudnione. Postawiono hipotezę, że LPEI może utrudniać wiązanie octanu uranylu z szkieletem fosforanowym ze względu na szczelne ekranowanie origami DNA. Dlatego przed obrazowaniem nsTEM do polipleksów LEPI dodano nadmiar siarczanu dekstranu. Rozplecione nanostruktury origami DNA nie wykazywały oznak defektów ani rozkładu. W przeciwieństwie do nich, polipleksy chitozanowe zostały pomyślnie zobrazowane bez konieczności stosowania obróbki polianionowej (Rysunek 2).
Wszystkie nieosłonięte nanostruktury DNA (niezależnie od ich różnych konfiguracji) uległy całkowitej denaturacji po jednym dniu inkubacji w 37 °C w buforze Mg-zero, co potwierdzono obrazowaniem nsTEM. W przeciwieństwie do nich, nanostruktury powlekane LPEI lub chitosanem przy N/P≥1 pozostały nienaruszone. Podobnie, testy miareczkowe z DNazą I wykazały podatność nieosłoniętych nanostruktur na trawienie enzymatyczne. Podczas gdy nieosłonięte nanostruktury zostały całkowicie strawione w obecności 1 U/mL DNazy I po 2 h, origami DNA zamknięte w LPEI lub chitosanie pozostały nienaruszone w buforze Mg-zero uzupełnionym o 10 U/mL DNazy I przez co najmniej jeden dzień (Rycina 2). Wyższą stabilność wobec trawienia nukleolitycznego osiągnięto poprzez zwiększenie stosunku N/P polipleksów. Dodatkowo LPEI chroni nanostruktury DNA bardziej efektywnie niż chitosan (Rycina 3A, Rycina 3C), prawdopodobnie ze względu na wyższą gęstość ładunku LPEI, a tym samym wyższe powinowactwo wiązania do DNA24. Nie zaobserwowano różnic przy zastosowaniu LPEI o różnej masie cząsteczkowej (Rycina3B).
Możliwość adresowania grup funkcyjnych w nanostrukturach DNA po enkapsulacji w polimerowej otoczce jest istotną cechą. Ponadto zbadano kompatybilność powłoki polikationowej z DNA origami funkcjonalizowanym peroksydazą chrzanową (HRP) oraz aptamerami wiążącymi heminę (HBA). Trzy biotynilowane nici stapel wystawały z powierzchni NR, a następnie zostały funkcjonalizowane streptawidyną sprzężoną z HRP (trzy enzymy na jedno DNA origami). Do tych eksperymentów wybrano wysoką aktywność katalityczną (Kd: 439 nM) aptamer HBA PS2.M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3')25. Do 24 nici stapel wystawało z powierzchni NR z łącznikiem o długości 5 nm (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3'), po którym następowała sekwencja PS2.M (24 aptamery na jedno DNA origami). Nie zaobserwowano znaczącego zahamowania aktywności enzymatycznej ani aptamerowej po pokryciu funkcjonalizowanego HRP lub HBA DNA origami polimerami LPEI i chitosanem przy różnych stosunkach N/P (Ryc. 4A-B)16. Jednakże kinetyka enzymu HRP uległa drastycznej zmianie po związaniu z DNA origami (Ryc. 4C).
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; kompleksy DNA-polimer, analiza stosunku N/P, badanie tworzenia polipleksów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy AGE przedstawiające tworzenie polipleksów i dekapsulację. (A) Analiza przesunięcia mobilności elektroforetycznej dla NB zmieszanego z chitosanem przy stosunkach N/P od 0,01 do 8. Każda ścieżka zawiera 1 nmol NB. Pierwsza ścieżka to referencyjne NB. (B) Dekapsulacja polipleksów za pomocą polianionowego siarczanu dekstranu (DS). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanego rysunku16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa oddziaływań nanocząsteczek; efekty LPEI i chitosanu, usunięcie Mg, DNaza, TB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mikrografie TEM z barwieniem negatywowym origami DNA i polipleksów. Model 3D i mikrografie nsTEM gołych nanostruktur origami DNA (kolumny 1 i 2). Mikrografie nsTEM polipleksów LPEI (po dekapsulacji) i polipleksów chitosanowych (kolumny 3 i 4). Obrazy nsTEM gołego i chronionego origami DNA (polipleks) poddanego usunięciu Mg (kolumny 5, 6 i 7), degradacji enzymatycznej (kolumny 8 i 9) oraz trawieniu w surowicy (kolumny 10 i 11) przez jedną dobę w 37 °C. W tym badaniu zastosowano LPEI-5 kDa. Gołe nanostruktury DNA uległy degradacji poniżej granicy wykrywalności w AGE w obecności 1 U/mL DNase I lub w TB + 10% FBS po 2 h inkubacji w 37 °C. Paski skali: 100 nm. Rycina ta została zmodyfikowana z wcześniej opublikowanej ryciny16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej i wykres słupkowy; analiza LPEI przy różnych stosunkach N/P, wykazująca trendy stężeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki testów ochrony przed DNazą I. (A) Test ochrony przed DNazą I dla polipleksów WN z LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa oraz LPEI-25 kDa przygotowanych przy stosunkach N/P wynoszących 2, 4, 8 i 10. Próbki poddano działaniu 10 U/mL DNazy I przez 24 h w temperaturze 37 °C. Ostatnia ścieżka to kontrolne WN. Polipleksy zostały odkapsułkowane przed naniesieniem na żel. (B) Znormalizowana średnia intensywność prążka dla polipleksów origami DNA z różnymi LPEI, wyekstrahowana z obrazu AGE-A. Oś Y przedstawia znormalizowaną średnią intensywność prążka. (C) Test ochrony przed DNazą I polipleksów chitosan-WN przygotowanych przy stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 4, 10 i 20. Próbki poddano działaniu 10 U/mL DNazy I przez 24 h w temperaturze 37 °C. Ścieżka 6 to kontrolny polipleks (N/P 20). Ostatnia ścieżka to kontrolne WN. Wszystkie polipleksy chitosanowe zostały odkapsułkowane przed naniesieniem na żel. Rycina ta została zmodyfikowana z wcześniej opublikowanej ryciny16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe absorbancji w funkcji stosunku N/P oraz krzywa absorbancji w funkcji czasu; analiza HRP-NR, HBA-NR, chitosanu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki kolorymetrycznych testów z wykorzystaniem origami DNA funkcjonalizowanego enzymami i aptamerami. (A) Test kolorymetryczny nanostruktur funkcjonalizowanych enzymami (HRP-NR) powleczonych chitosanem 3,7 h po rozpoczęciu reakcji. (B) Test kolorymetryczny nanostruktur funkcjonalizowanych aptamerami (HBA-NR) powleczonych chitosanem, 6 min po zainicjowaniu reakcji. Oś Y przedstawia znormalizowaną absorbancję. (C) Monitorowanie testu kolorymetrycznego HRP i HRP-NR w czasie. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanej ryciny16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polimery kationowe</td>
			<td>Chitosan</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa polimeru (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa monomeru (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba grup aminowych na monomer</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba grup aminowych na polimer</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Obliczanie liczby grup aminowych na polikation.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa siarczanu dekstranu (kDa)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa monomeru (g/mol)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba grup siarczanowych na monomer</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba grup siarczanowych na polimer</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Obliczanie liczby grup siarczanowych na polianion.

Tutaj przedstawiono protokół ochrony nanostruktur DNA origami w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy przy użyciu naturalnych kationowych powłok polisacharydowych chitozanu i syntetycznych liniowych powłok polietylenoiminy (LPEI).

Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Biologiczna stabilizacja nanostruktur DNA ma zasadnicze znaczenie dla przyszłych zastosowań in vivo, takich jak celowane dostarczanie leków. Jednak DNA ulega degradacji w organizmie przez różne enzymy. W tym miejscu przedstawiamy technikę powlekania, która chroni nanostruktury DNA przed degradacją enzymatyczną.Główną zaletą jest to, że nasza powłoka składa się z nietoksycznych związków, które są już stosowane w organizmach żywych, a funkcjonalizacja powierzchni pozostaje możliwa. Ta funkcjonalizacja jest ważna, ponieważ obejmuje czujniki molekularne do rozpoznawania celów i przełączniki do uwalniania ładunku leku. Powłoki polikacyjne znacznie zwiększają wychwyt komórkowy zamkniętych w kapsułkach struktur origami DNA, więc metoda ta może otworzyć drzwi do zastosowań origamis DNA w diagnostyce i terapii.Wychwyt komórkowy jest również wymagany do potencjalnych zastosowań nanotechnologii DNA w dostarczaniu genów. Uważam, że metoda jest dość prosta i można ją łatwo opanować. Na początek zmierz stężenie oczyszczonego origami DNA.Użyj dwóch mikrolitrów buforu TB jako ślepej próby do kalibracji spektrofotometru ultrafioletowego. A następnie zmierz stężenie DNA origami na 260 nanometrach. Następnie oblicz ilości fosforanów w oczyszczonym roztworze origami DNA, używając wzoru drugiego, jak opisano w rękopisie.Przygotuj 15 mikrolitrów struktury origami DNA, dodając jeden nanomol fosforanu, używając buforu TB do rozcieńczenia. Dodaj 13,2 mikrolitra do TB do 1,8 mikrolitra chitozanu. I dodaj 15 mikrolitrów roztworu chitozanu do 15 mikrolitrów origami DNA, aby uzyskać polipleks chitozanu origami DNA o stosunku N/P wynoszącym osiem.Kontynuuj przygotowywanie polipleksów o różnych proporcjach N/P, korzystając z obliczeń opisanych w manuskrypsie. Przygotuj 80 milimetrów tubki na 2% żel agarozowy. Dodaj 352 mikrolitry 2,5-molowego chlorku magnezu, a następnie wstępnie wybarwij go 10 mikrolitrami barwnika żelowego DNA.Wlej roztwór żelu do suchego pudełka żelowego. Włóż żelowy grzebień do elektroforezy i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. W międzyczasie uzupełnij bufor do pracy 11-milimolowym chlorkiem magnezu.Wymieszaj od 10 do 20 mikrolitrów każdej próbki z 20% buforem ładującym 6X. Załaduj próbki do studzienek z żelem agarozowym, w tym origami z nagim DNA jako kontrolę. Uruchom żel pod napięciem 70 woltów w temperaturze pokojowej przez dwie i pół do trzech godzin.Następnie użyj skanera UV, aby zobrazować żel. Aby wykonać test ochrony DNazy I, dodaj cztery mikrolitry każdego polipleksu porównanego przy różnych proporcjach N / P, 1,5 mikrolitra buforu 10X DNazy I, 8 mikrolitrów TB i 1,5 mikrolitra DNazy I do oddzielnej probówki PCR o pojemności 2 mililitrów. Następnie inkubuj to samo w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze przez 24 godziny.Aby strawić DNazę I, dodaj dwa mikrolitry po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze. Następnie, aby rozwikłać rdzeń nanostruktur DNA, dodaj 3,6 mikrolitra po 50 miligramów na mililitr 40 kilodaltonów siarczanu dekstranu. Następnie użyj tych próbek i świeżego origami DNA jako kontroli, aby przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym, jak opisano wcześniej.Obciąć pasmo odpowiadające załadowanym próbkom z żelu. Aby wyekstrahować origami DNA, użyj kolumny ekstrakcyjnej z wyciśniętym zamrażaniem i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie kontynuuj obrazowanie w mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego, jak opisano w manuskrypcie. Wymieszaj 6,5 mikrolitra oczyszczonego 36 nanomolowego HRP-NR z 6,5 mikrolitrami polikacji o różnych stężeniach.Aby przygotować polipleks w proporcjach N / P jeden, dwa, cztery, 10 i 20, przygotuj ślepą próbę, mieszając 6,5 mikrolitra wody destylowanej z 6,5 mikrolitrami polikationów o różnych stężeniach odpowiadających stosunkom N / P jeden, dwa, cztery, 10 i 20. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra każdego z tych przygotowanych roztworów do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce. Następnie dodaj 72,5 mikrolitra buforu HEPES do każdej studzienki i wymieszaj.Dodaj 10 mikrolitrów 15 milimolowych ABTS, a następnie 5 mikrolitrów 12 milimolowego nadtlenku wodoru do każdej studzienki i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Na koniec użyj wielomodowego czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję przy 421 nanometrach przez cztery godziny. Po przeanalizowaniu polipleksów za pomocą testu opóźnienia żelowego, nastąpiło przesunięcie nagiej nanostruktury w kierunku katody, prawdopodobnie z powodu równoważenia ujemnego ładunku grup fosforanowych po związaniu się z polikationami i wzrostem wielkości kompleksu.Po dodaniu dodatkowej ilości polianionów, takich jak siarczan dekstranu, tworzenie polipleksu zostało odwrócone. Siarczan dekstranu o większej masie cząsteczkowej okazał się bardziej skuteczny w porównaniu z siarczanem o niższej masie cząsteczkowej. Po przeanalizowaniu polipleksów za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego, mikrofotografie wykazały nagie nanostruktury DNA origami, liniowe polipleksy polietylenowe po dekapsulacji, polipleksy chitozanowe, obrazy nagich i chronionych origami DNA poddanych zubożeniu magnezu, degradacji enzymatycznej i trawieniu surowicy.W obecności DNazy I, po dwóch godzinach, nagie nanostruktury zostały całkowicie strawione, podczas gdy liniowe polipleksy polietyleninowe origami DNA otoczonego chitozanem pozostały nienaruszone w obecności 10 jednostek na mililitr DNazy I. Liniowe polipleksy polietyleninowe chronią nanostruktury DNA skuteczniej w porównaniu z chitozanem. Gdy stosunek N/P polipleksu jest zwiększony, trawienie DNA było niższe. Po pokryciu enzymu lub po bardziej funkcjonalizowanym origami DNA liniowymi polipleksami polietyleniminy i chitozanem w wariantowych proporcjach N / P, nie zaobserwowano żadnej znaczącej interferencji z aktywnością enzymatyczną.Z drugiej strony, kinetyka enzymu HRP dramatycznie się zmieniła po związaniu się z origami DNA. Ważne jest, aby zacząć od dobrze oczyszczonych struktur origami DNA. Istnieje stabilniejsza nić, która może również wiązać się z polikacjami.Są one trudne do oddzielenia od polipleksów origami DNA. Nasze cząsteczki powlekające są również wykorzystywane w zastosowaniach terapii genowej. Oznacza to, że nanostruktury DNA mogą być w przyszłości wykorzystywane do zmiany genomu organizmów żywych.Do barwienia żelem agarozowym zwykle stosuje się cząsteczki, które interkalują DNA i są potencjalnie mutagenne. Podczas barwienia DNA należy postępować zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa obowiązującymi w laboratorium.

gene-therapy-inspired-polycation-coating-for-protection-dna-origami

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy, w jaki sposób origami DNA można wykorzystać do zaprojektowania robota zdolnego do wyczuwania sygnałów biologicznych i reagowania poprzez zmianę kształtu, a następnie przekazywanego do pożądanego efektu.

Projektowanie bioresponsywnego robota z DNA Origami

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

Opisano powtarzalne procesy czyszczenia substratów używanych w badaniach origami DNA, w tym czyszczenie RCA na stole i derywatyzację tlenku krzemu. Zilustrowano protokoły przygotowania powierzchni, osadzania origami DNA, parametrów suszenia i prostych konfiguracji eksperymentalnych.

Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Opisujemy szczegółowy protokół opartego na origami łączenia złotych nanoprętów w chiralne metamolekuły plazmoniczne z silnymi reakcjami chiroptycznymi. Protokół nie ogranicza się do konfiguracji chiralnych i może być łatwo dostosowany do wytwarzania różnych architektur plazmonicznych.

Składanie złotych nanoprętów w chiralne metamolekuły plazmoniczne za pomocą szablonów DNA Origami

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.

Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Ten protokół demonstruje pomiary jednocząsteczkowego wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana (SERS) za pomocą nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z kolokalizowaną mikroskopią sił atomowych (AFM) i pomiarami Ramana.

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj technikę powlekania DNA origami chitozanem i LPEI, aby chronić nanostruktury przed degradacją enzymatyczną w środowisku biologicznym. Metoda zwiększa pobór komórkowy i umożliwia funkcjonalizację powierzchni.

Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami

Przeglądaj więcej filmów