Name: Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny cytotoksyczności limfocytów CAR T wobec sferoidów nowotworowych w czasie rzeczywistym. Technika łączy zaawansowaną mikroskopię z immunologicznym testem wrażliwości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantów #244388, #254817 i #284983; Norweskie Towarzystwo Onkologiczne (#6829007); Norweski Region Zdrowia Południowo-Wschodni w ramach grantu #17/00264-6 i #2016006.

1. Generowanie sferoidów z linii komórkowej raka jelita grubego
<ol>
	<li>Przemyć monowarstwy komórek HCT 116 (stabilnie transdukowane w celu ekspresji klastra różnicowania 19 (CD19) i białka zielonej fluorescencji (GFP)) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o długości 25 cm2 lub 10 ml dla kolby o średnicy 75 cm2). Dodać trypsynę (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cmlub 1 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek za pomocą kompletnego podłoża Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycyna; 10 ml dla 25 cm2 lub 20 ml dla kolby 75 cm2).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w ilości 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 5 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.</li>
	<li>Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 5 x 103 komórek/ml.</li>
	<li>Pokryj 96-dołkową okrągłą płytkę dolną 100 μl/basenik 100 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj dwukrotnie PBS i pozostaw płytkę do wyschnięcia.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych pokrytych PLL za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Przenieść płytkę do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności).</li>
	<li>Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz opcję Zaplanuj nabycie | Uruchom Dodaj naczynie | Skanowanie zgodnie z harmonogramem | Utwórz naczynie: nowe.</li>
	<li>Wybierz Typ skanowania: Sferoidalny. Wybierz interesujące Cię kanały: Faza + Jasne Pole (aby śledzić wzrost sferoid), Zielony (aby śledzić sygnał guza, czas akwizycji 300 ms) i Czerwony (aby śledzić apoptozę, czas akwizycji 400 ms).
	<ol>
		<li>Wybierz żądane powiększenie: 10x.</li>
		<li>Wybierz model płyty i jej położenie w szufladzie. Wybierz położenie studni do zobrazowania. Wprowadź opis eksperymentu: nazwę, typ komórek, liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W ustawieniach analizy wybierz opcję Odłóż analizę na później. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw Dodaj skany co do 4 godzin i Łącznie do 24 godzin. Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania).</li>
	<li>Sprawdzaj co 2 dni pod kątem wzrostu sferoid, logując się do oprogramowania do obrazowania.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i kliknij dwukrotnie żądany eksperyment. Wybierz opcję Jasne pole w panelu kanałów obrazu, a następnie użyj narzędzia Zmierz cechy obrazu, aby zmierzyć średnicę sferoid. Sferoida potrzebuje 6 dni, aby osiągnąć pożądany rozmiar: 0,5 mm średnicy. Dodać 50 μl kompletnej pożywki RPMI na dołek w 4 dniu, aby ograniczyć efekt parowania pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja komórek T CD19 CAR
<ol>
	<li>Ekspansja limfocytów T CD19 CAR 
	nuta: Stabilną ekspresję limfocytów T CD19 CAR uzyskano przez masową transdukcję retrowirusową zdrowych PBMC dawcy, jak opisano wcześniej16. Konstrukt retrowirusowy kodujący CD19 CAR to CAR drugiej generacji i składa się z łańcucha scFv fmc63, zawiasu CD8 i domeny transbłonowej, domeny kostymulującej 4-1BB i wreszcie domeny CD3ζ.
	<ol>
		<li>Aby się namnażać, hoduj transdukowane limfocyty T w obecności kulek magnetycznych anty-CD3/28 ze stosunkiem komórek do kulek 1:1 przez 10-11 dni. Podczas ekspansji komórki znajdują się w kompletnym pożywce (X-VIVO 15, 5% wymiana surowicy i 100 U/ml rekombinowana ludzka IL-2). 
		nuta: Idealna gęstość dla efektywnej ekspansji wynosi od 1 do 2 x 106 komórek/ml. W zależności od początkowej liczby, komórki mogą być namnażane w kolbach (25 cm2 kolby do 20 ml, 75 cm2 kolby do 40 ml objętości całkowitej) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).</li>
		<li>Jako ujemną grupę kontrolną dla następujących testów, należy uwzględnić nietransdukowane PBMC (będą określane jako Mock) do protokołu ekspansji równolegle do limfocytów T CD19 CAR.</li>
		<li>W dniu 3 i później należy codziennie dodawać świeżą pożywkę i w razie potrzeby dzielić komórki do większej liczby kolb hodowlanych.</li>
		<li>W dniach 10–11 odwirować komórki w stężeniu 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i połączyć wszystkie komórki w jedną probówkę o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić komórki w ~30 ml świeżej kompletnej pożywki.</li>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 50 ml zawierającą zawieszone komórki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne od pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Odczekaj 2–3 minuty, aż koraliki zbiorą się z boku tuby.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki, nie dotykając stref zbierania kulek magnetycznych.</li>
		<li>Powtórz czynności dotyczące usuwania kulek (2.1.5–2.1.7) jeszcze raz, aby ograniczyć liczbę kulek w końcowej pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Ponownie zawieś i policz komórki, dostosuj gęstość do 1 do 2 x 106 komórek/ml w pełnym podłożu.</li>
		<li>Odpocznij komórki przez co najmniej 4 godziny do nocy. Następnie należy je bezpośrednio zamrozić w temperaturze -80 °C i następnego dnia przenieść do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Alternatywnie można przedłużyć odpoczynek do nocy w celu natychmiastowego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola ekspresji CD19 CAR na pierwotnych limfocytach T
	<ol>
		<li>Policz liczbę rozszerzonych limfocytów T, ponieważ liczby mogą się nieznacznie różnić po nocnej hodowli lub umiarkowanie po zamrożeniu/rozmrożeniu.</li>
		<li>Przenieś 5 x 105 komórek z pierwotnych limfocytów T CD19 i Mock do oddzielnych probówek cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przemyć komórki 200 μl buforu przepływowego (2% FBS w PBS) i odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut. Powtórz kroki mycia, aby pozbyć się wszelkich artefaktów spowodowanych przez pożywkę hodowlaną.</li>
		<li>Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (Biotyna Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')₂ Fragment Specific), wykonując rozcieńczenie 1:200 w buforze przepływowym.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszaniny przeciwciał na probówkę i inkubować na lodzie przez 15 minut. Powtórzyć poprzedni etap płukania dwukrotnie, aby usunąć nadmiar przeciwciał.</li>
		<li>Przygotować przeciwciało drugorzędowe (Streptawidyna-PE) w postaci rozcieńczenia 1:400 w buforze przepływowym.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszanki przeciwciał na probówkę i inkubować na lodzie przez 15 minut. Powtórz poprzedni etap mycia dwukrotnie, aby pozbyć się nadmiaru przeciwciał.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu przepływowego na probówkę i przeanalizować go na cytometrze przepływowym.</li>
		<li>Użyj makiet limfocytów T, aby ustawić ujemną i dodatnią bramkę i odpowiednio przeanalizować limfocyty T transdukowane przez CD19 CAR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 3D Test zabijania sferoidów nowotworowych
<ol>
	<li>Po 6 dniach lub gdy sferoidy osiągną pożądany rozmiar, wyjmij płytkę z inkubatora. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 100 μl/studzienkę kompletnego podłoża RMPI 1640 z płytek sferoidalnych.
	<ol>
		<li>Na tym etapie należy skierować końcówki w kierunku wewnętrznej ścianki płyty z 96 dołkami, unikając kontaktu z dnem studni, aby zminimalizować zakłócenia sferoid. Pozostała objętość powinna wynosić około 100 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór czerwonej aneksyny V w stosunku 1:200, mieszając 50 μl czerwonej aneksyny V z 9,95 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Dodać 100 μl/basenik czerwonego roztworu załącznika V w stosunku 1:200.</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora (37°C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 15 minut.</li>
	<li>Zbierz transdukowane limfocyty T CAR CD19 do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj je przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 2 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.</li>
	<li>Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 2 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozować 100 μl/studzienkę do 96-dołkowej płytki sferoidalnej z okrągłym dnem za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Przenieść płytkę z powrotem do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności).</li>
	<li>Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz opcję Zaplanuj nabycie.
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu skanowania i wybierz Edytuj oś czasu. Kliknij prawym przyciskiem myszy grupę skanowania i usuń ją. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw Dodaj skany co do 1,5 godziny i Łącznie do 24 godzin.</li>
		<li>Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania). Wybierz opcję Zapisz zaplanowane skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Automatyczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Zaloguj się do pobrania, wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i wybierz opcję Uruchom analizę. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy | Typ analizy: sferoidalna. Zaznacz kanały obrazu do analizy (Faza + Jasne pole, Zielony i Czerwony).</li>
	<li>Wybierz co najmniej 10 reprezentatywnych obrazów: zazwyczaj 1 na warunek i co najmniej 3 punkty czasowe (początek, środek i koniec akwizycji).</li>
	<li>Podgląd domyślnej procedury analizy dla całego stosu obrazów.</li>
	<li>Zmodyfikuj parametry maski jasnego pola. Typowe parametry to: Czułość 10, Wypełnienie otworu 1 000 μm2, minimalna powierzchnia 1 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.</li>
	<li>Zmodyfikuj parametry zielonej maski (GFP). Typowe parametry to: Segmentacja cylindra o promieniu 200 μm i progu 3 GCU, Oddzielenie krawędzi, Wypełnienie otworu 5 000 μm2, Dostosuj rozmiar -2 pikseli, Obszar min 3 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.</li>
	<li>Zmodyfikuj parametry czerwonej maski (załącznik V). Typowe parametry to: Segmentacja cylindra o promieniu 150 μm i progu 2 GCU, Oddzielenie krawędzi, Wypełnienie otworu 5 000 μm2, Dostosuj rozmiar 0 pikseli, Obszar min 1 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.</li>
	<li>Uruchom analizator.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu analizy wyodrębnij interesujący Cię pomiar. Wybierz analizowany plik, a następnie opcję Metryki wykresu. Wybierz interesujące Cię metryki, skan i studnię. Zazwyczaj całkowite natężenie czerwieni i zieleni w granicach jasnego pola daje najdokładniejsze pomiary, ograniczając sygnał fluorescencji do granic sferoid określonych przez maskę jasnego pola (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Wyodrębnij wybrane metryki w kilku formatach plików, klikając "Eksportuj dane".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do wyodrębniania obrazów i filmów, wybierając analizowany plik, a następnie wybierz opcję Eksportuj obrazy i filmy. Dostępne są dwie opcje: "Tak jak wyświetlono", aby pobrać obrazy i filmy widziane w oprogramowaniu do obrazowania (zwykle obrazy złożone), lub "Jako przechowywane", aby pobrać nieprzetworzone dane do analizy zewnętrznej za pomocą oprogramowania innej firmy.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li>
<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie sferoid jako innowacyjnego narzędzia do walidacji przyszłego leczenia nowotworów stało się w ostatnich latach dziedziną rosnącego zainteresowania. Sferoidy stanowią etap pośredni między klasyczną analizą 2D in vitro a oceną in vivo. Metoda ta jest również bardzo obiecująca, jeśli chodzi o ich siłę działania pod względem naśladowania mikrośrodowiska guza, a także profilowania genów7. Protokół przedstawiony w tej publikacji został zaadaptowany z Saheen et al....

Adoptywny transfer komórek (ACT) reprezentuje leczenie raka nowej generacji. Polega ona na wstrzyknięciu pacjentowi komórek efektorowych (limfocytów T lub NK). Komórki te mogą być genetycznie modyfikowane za pomocą receptora, który poprowadzi je do celu, guza, i zniszczy go. Ostatnio okazało się, że takie podejście jest wykonalne, gdy chimeryczny receptor antygenowy (CAR) skierowany przeciwko markerowi limfocytów B CD19 został wprowadzony do limfocytów T pacjenta w celu zabicia jego/jej raka1. W przypadku CAR, który jest sztucznym receptorem, konstrukcja składa się ze specyficznych fragmentów przeciwciała, domeny wiążącej antygen zredukowanej do jednostki oznaczonej jako fragment zmiennej pojedynczego łańcucha (scFv), połączonej z domenami sygnalizacyjnymi komórek T. Chociaż istnieje kilka konstrukcji, najczęściej stosowane wersje określane jako konstrukcje CAR drugiej generacji, składają się z CD3z do sygnalizacji TCR i jednej domeny kostymulacyjnej (CD28, 4-1BB, OX40 itp.)1,2. Dziedzina immunoterapii skierowała większość swojej uwagi na tę nową formę ACT, gdy komórki CAR-T CD19 skutecznie leczyły wielu pacjentów z nowotworami złośliwymi komórek B3,4. Po tym sukcesie naukowcy próbowali wykorzystać podobne projekty, celując w inne epitopy guzów litych, ale z ograniczonym powodzeniem. Niestety, niedobór antygenów specyficznych dla nowotworu i ostrzejsze mikrośrodowiska guza sprawiły, że limfocyty CAR T były mniej skuteczne w przypadku guzów litych5.
Obecnie, najczęściej stosowane strategie walidacji in vitro opierają się na systemach dwuwymiarowych (2D), które rozwiązują tylko część już wspomnianych wyzwań związanych z guzami litymi. Klasycznie systemy 2D in vitro obejmują mieszaninę limfocytów CAR T i docelowych linii komórek nowotworowych jako monowarstw w celu oceny funkcjonalności i swoistości tych komórek efektorowych. Chociaż strategie te są ważnymi i istotnymi częściami badań, nie uwzględniają one złożonej morfologii i trójwymiarowej (3D) struktury komórek nowotworowych6. Komórki nowotworowe hodowane w systemach 3D, określane jako sferoidy, nabywają nowe cechy fenotypowe poprzez zmiany w profilu ekspresji genów7, co może wpływać na rozpoznawanie przez przekierowane komórki efektorowe. Birgersdotter i współpracownicy wykazali, że linia komórkowa chłoniaka Hodgkina (HL), gdy jest hodowana tylko w modelu hodowli 3D, uzyskuje profil ekspresji genu, który jest podobny do pierwotnych próbek guza8. W związku z tym sferoidy lub podobne metodologie hodowli 3D oferują bardziej odpowiednie modele in vitro w przeciwieństwie do standardowych systemów 2D. Takie systemy są również podobne do badań in vivo, które są postrzegane jako ostatni krok w procesie walidacji danego CAR. Biorąc pod uwagę, że systemy 2D nie naśladują morfologii klastrów nowotworowych, sferoidy oferują podobne formacje do oceny funkcjonalności limfocytów CAR T przed modelami in vivo. W jednym z badań Pickl i in. stwierdzili, że sferoidalny model komórek nowotworowych z nadekspresją ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2) wykazywał podobne profile sygnałowe do modeli in vivo9. To dodatkowo potwierdza, że sferoidy oferują bardziej odpowiednią i bliską in vivo ocenę limfocytów CAR T. Dodatkowo, walidacja limfocytów T CAR w odniesieniu do sferoidów może pomóc w bardziej krytycznej ocenie ich skuteczności i zapobiec przedwczesnemu przejściu niektórych projektów do badań in vivo10; W ten sposób przyczyniamy się do badań związanych z etyką poprzez składanie w ofierze mniejszej liczby zwierząt. Co więcej, protokoły wykorzystujące sferoidy nie są droższe od klasycznych systemów 2D i znacznie szybsze w porównaniu z klasycznymi badaniami in vivo. Podsumowując, można przewidzieć, że włączenie badań sferoidalnych wkrótce stanie się standardową praktyką łączącą badania in vitro i in vivo.
Tutaj prezentujemy przygotowanie sferoidów z linii komórkowej raka jelita grubego HCT 116. Ta linia komórkowa została zmodyfikowana w celu ekspresji ludzkiej cząsteczki CD19, aby uczynić ją wrażliwą na limfocyty T CD19 CAR i zapewnić jasną ocenę zabijania przy użyciu klinicznie zwalidowanego konstruktu CAR.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>silny>Numer partii:</mocny> RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&s2; obszar wzrostu kolby</td><td>VWR</td><td>430639</td><td><mocny>Numer partii: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&s2; termosy</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Numer partii: 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Numer partii: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Numer partii: 1926384</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Numer partii: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Numer partii: 1904924A</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Numer partii:</mocna> 1886513</td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa, okrągłodenna</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td>< > Numer partii: 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 z gentamycyną L-Gln, czerwień fenolowa, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Numer partii: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Wymiana surowicy komórek odpornościowych</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Numer partii: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Numer partii: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Number partii: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Numer partii: < / mocny> 89094-672</td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td><silny>Numer partii:</silny> 19317044</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td><silny>Numer partii: 4016990 <silny>RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment kozioł anty-mysi IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Numer partii: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td></td> <td>554061Numer partii: 5191579: RRID: </silny> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Linia raka jelita grubego</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów car t

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunoterapia stała się dziedziną rosnącego zainteresowania w walce z rakiem, który w inny sposób byłby nieuleczalny. Spośród wszystkich metod immunoterapeutycznych najbardziej spektakularne wyniki uzyskano za pomocą przekierowanego receptora antygenowego chimerycznego (CAR) limfocytów T, w szczególności w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej B u dzieci (B-ALL). Klasyczne metody walidacji limfocytów CAR T opierają się na wykorzystaniu testów swoistości i funkcjonalności limfocytów CAR T w stosunku do komórek docelowych w zawiesinie i w modelach ksenoprzeszczepów. Niestety, obserwacje dokonane in vitro są często oddzielone od wyników uzyskanych in vivo i można by oszczędzić wiele wysiłku i zwierząt, dodając kolejny krok: wykorzystanie hodowli 3D. Produkcja sferoid z potencjalnych komórek docelowych, które naśladują strukturę 3D komórek nowotworowych, gdy są one wszczepiane do modelu zwierzęcego, stanowi idealną alternatywę. W tym miejscu przedstawiamy niedrogą, niezawodną i łatwą metodę wytwarzania sferoid z transdukowanej linii komórek jelita grubego jako narzędzie walidacyjne dla adoptywnej terapii komórkowej (przykładem są tutaj limfocyty T CD19 CAR). Metoda ta jest połączona z zaawansowanym systemem obrazowania na żywo, który może śledzić wzrost sferoidów, cytotoksyczność komórek efektorowych i apoptozę komórek nowotworowych.

Jak widać na Rysunku 1, kluczowe jest sprawdzenie za pomocą cytometrii przepływowej poziomu ekspresji CD19 CAR na limfocytach T (Rysunek 1A) oraz poziomu CD19 na liniach komórkowych nowotworu HCT16 (Rysunek 1B). Rysunek 2 przedstawia wynik typowego eksperymentu ze sferoidami. Zautomatyzowane urządzenie do obrazowania wykonuje zdjęcia w czterech różnych kanałach: w polu j...

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie immunoterapii dotyczące oceny cytotoksyczności komórek odpornościowych wobec komórek nowotworowych o strukturze 3D. Głównymi zaletami tej metody jest to, że jest prosta i łączy w sobie zaawansowaną technologię obrazowania oraz czuły test immunologiczny. Zacznij od przemycia interesującej nas linii komórek raka jelita grubego pięcioma mililitrami PBS i usunięcia komórek z dna kolby 0,5 mililitra trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem zneutralizować enzym dysocjacji komórek za pomocą 10 mililitrów kompletnej pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej kompletnej pożywki do liczenia i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,5 razy 10 do trzecich komórek na mililitr. Następnie wysiewaj 200 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej i umieść płytkę w automatycznym aparacie do obrazowania w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i wilgotnością 95%.Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji aparatu i wybierz Zaplanuj nabycie, Wystrzel, Dodaj statek, Skanuj zgodnie z harmonogramem i Utwórz nowy statek. Następnie wybierz typ skanowania Spheroid i wybierz odpowiednie kanały jasnego pola i fluorescencji, które Cię interesują. Ustaw powiększenie na 10 razy i wybierz model płytki oraz jej położenie w szufladzie aparatu obrazowego.Wybierz położenie studzienek, które mają być zobrazowane, i wprowadź opis eksperymentu, w tym nazwę, typ komórek i liczbę komórek. Aby skonfigurować analizę, wybierz opcję Odłóż analizę na później, kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu, a następnie wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw opcję Dodaj skany co do czterech godzin i Łącznie do 24 godzin. Następnie ustaw czas rozpoczęcia na co najmniej godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania.Aby sprawdzić postęp wzrostu sferoidy, co dwa dni loguj się do oprogramowania do obrazowania i wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany. Kliknij dwukrotnie interesujący Cię eksperyment i wybierz opcję Brightfield w panelu Image Channels (Kanały obrazu). Następnie użyj narzędzia Measure Image Features, aby zmierzyć średnicę sferoid, dodając 50 mikrolitrów kompletnego podłoża na studzienkę w czwartym dniu, aby ograniczyć wszelkie efekty parowania pożywki.Gdy sferoidy osiągną odpowiedni rozmiar eksperymentalny, ostrożnie ustaw płytkę pod kątem i użyj wielokanałowej pipety, aby delikatnie usunąć 150 mikrolitrów kompletnego podłoża z każdej studzienki, nie naruszając sferoid. Następnie zastąpić odrzuconą pożywkę 50 mikrolitrami roztworu załącznika V czerwonego w proporcji jeden do 200 i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut. Odwiruj transdukowane komórki T CAR CD19 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach kompletnego podłoża.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr całkowitego stężenia podłoża. Następnie dodaj 100 mikrolitrów limfocytów T CAR CD19 do każdej studzienki zawierającej sferoidę i zwróć płytkę do automatycznego aparatu do obrazowania. W oprogramowaniu do akwizycji wybierz opcję Zaplanuj pobieranie i kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu skanowania.Wybierz opcję Edytuj oś czasu i kliknij prawym przyciskiem myszy grupę skanowania, aby ją usunąć. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw Dodaj skany co 1 1/2 godziny i Łącznie do 24 godzin. Następnie ustaw czas rozpoczęcia obrazowania na co najmniej godzinę po rozpoczęciu inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania i wybierz opcję Zapisz zaplanowane skanowanie.Aby przeprowadzić automatyczną analizę obrazu, w oprogramowaniu do skanowania wybierz opcję View Recent Skans (Wyświetl ostatnie skany) i Launch Analysis (Uruchom analizę). Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy i typ analizy Spheroid, a następnie ustaw kanały obrazu, które mają być analizowane. Wybierz co najmniej 10 reprezentatywnych obrazów i wyświetl podgląd domyślnej procedury analizy na całym stosie obrazów.Zmodyfikuj parametry maski jasnego pola i wyświetl podgląd stosu obrazów, upewniając się, że wybrane parametry prawidłowo wykrywają sferoidy. Zmodyfikuj parametry zielonej maski i wyświetl podgląd stosu obrazów, aby upewnić się, że wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy. Zmodyfikuj parametry czerwonej maski i wyświetl podgląd stosu obrazów, aby upewnić się, że wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.Zadbaj o to, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i czułości do specyficzności, pamiętając, że nie będziesz w stanie znaleźć zestawu parametrów, który pozwoli uchwycić każde zdarzenie w każdym punkcie czasowym. Następnie uruchom analizator. Po zakończeniu analizy wyodrębnij interesujący Cię pomiar i wybierz analizowany plik oraz opcję metryk wykresu.Wybierz interesujące Cię metryki, skan i studnię. Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby wyodrębnić wybrane metryki w kilku formatach plików. Następnie, aby wyodrębnić obrazy, wybierz analizowany plik i wybierz opcję Eksportuj obrazy i filmy.Ekspresję CD19 CAR na transdukowanych limfocytach T i ekspresję CD19 na transdukowanych komórkach raka jelita grubego można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj można zaobserwować wynik typowego eksperymentu sferoidalnego. W przeciwieństwie do pozorowanych limfocytów T, limfocyty T CD19 CAR są w stanie specyficznie zabijać sferoidy pochodzące z linii komórkowej raka jelita grubego, znacznie zmniejszając liczbę żywych komórek nowotworowych.Śledzenie ewolucji całkowitych sygnałów zielonych i czerwonych w granicach sferoidów w czasie ujawnia, że wkrótce po wstrzyknięciu limfocytów T CD19 CAR rozmiar sferoid szybko się kurczy wraz ze wzrostem sygnału apoptozy. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak testy toksyczności, testy migracji komórek lub pomiary struktury sferoidalnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiednio badań przesiewowych leków, ruchliwości limfocytów T lub tworzenia sferoidów.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

W tym filmie demonstrujemy test powtarzalnego wyzwania nowotworowego, aby ocenić potencjał powtarzalnych komórek T CAR podczas dużego obciążenia komórek nowotworowych. Ponadto limfocyty CAR T można analizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia różnych subpopulacji komórek CAR T w próbce.

Powtarzalny test prowokacyjny nowotworu: Test hodowli in vitro w celu oceny limfocytów T chimerycznego receptora antygenowego (CAR) pod kątem powtarzalnego potencjału zabijania guza

Ten film demonstruje metodę monitorowania aktywności komórek CAR T przeciwko komórkom nowotworowym poprzez pomiary impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Śledzenie zmian impedancji ocenia skuteczność limfocytów CAR T w indukowaniu cytolizy komórek nowotworowych, dostarczając informacji na temat ich zdolności cytotoksycznych.

Test cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym w celu oceny siły działania limfocytów CAR T

Ten film demonstruje test in vitro oceniający cytotoksyczne działanie limfocytów CAR T na sferoidy guza 3D wyrażające białka fluorescencyjne. W tej ocenie wykorzystuje się czerwoną sondę fluorescencyjną Annexin V, która wiąże się z odsłoniętymi resztami fosfatydyloseryny na zewnętrznym płatku apoptotycznych komórek rakowych po interakcjach z komórkami CAR T. Czerwona fluorescencja emitowana przez sondę pomaga w odróżnieniu tych komórek od zdrowych emitujących zieloną fluorescencję.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności limfocytów CAR T wobec sferoid nowotworowych

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny...

Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Poznaj metodę oceny cytotoksyczności limfocytów CAR T wobec sferoidów nowotworowych w czasie rzeczywistym. Technika łączy zaawansowaną mikroskopię z immunologicznym testem wrażliwości.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Przeglądaj więcej filmów