Name: Wpływ neurotraumy wywołanej wybuchem na tętnice środkowe mózgowe gryzoni pod ciśnieniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę oceny reaktywności naczyniowej tętnic środkowych mózgowych szczurów po urazie mózgu wywołanym wybuchem. Protokół izolowanych segmentów tętniczych pozwala badać bezpośrednie skutki urazu na funkcję naczyń mózgowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały zakończone jako część zespołu wspieranego przez The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research i otrzymały nagrodę W81XWH-08-2-0132 od U.S. Army Medical Research and Material Command - Department of Defense.

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) University of Texas Medical Branch, placówkę akredytowaną przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Przygotowanie zwierząt do urazu spowodowanego falą uderzeniową ABS
<ol>
	<li>Włącz mechaniczny respirator objętościowy dla gryzoni i ustaw częstotliwość oddechów na 40–45 oddechów na min.</li>
	<li>Włącz termostatycznie sterowany koc grzewczy i przyklej na nim niebieską podkładkę.</li>
	<li>Podłącz wąż respiratora do respiratora.</li>
	<li>Przygotuj prowadnicę do intubacji endotrachealnej, laryngoskop, długą pęsetę, kaniulę (stylet), rurkę endotrachealną oraz patyczek nasączony 0,05 mL 1% Lidocaine HCl. Ułóż sprzęt na niebieskiej podkładce.</li>
	<li>Upewnij się, że węże komory indukcyjnej do znieczulenia gryzoni, respiratora, komory powietrznej i komory izofluranu są bezpiecznie podłączone do odpowiednich wtyczek lub gniazd. Zacisk komory indukcyjnej powinien być OTWARTY; zacisk respiratora powinien być ZAMKNIĘTY.</li>
	<li>W komorze powietrznej ustaw pokrętło powietrza pokojowego na 2 L/min, a pokrętło tlenu na 1 L/min.</li>
	<li>Włącz izofluran i ustaw pokrętło na 4% mieszaniny objętościowej.</li>
	<li>Uruchom stoper i umieść młodego dorosłego (≈3 miesiące), samca szczura Sprague-Dawley (350–400 g) w komorze indukcyjnej na 4–6 min.</li>
	<li>Zważ szczura w 2. minucie.</li>
	<li>Potwierdź pełne znieczulenie szczura, delikatnie uszczykując palce tylnej łapy. Jeśli nie zaobserwowano cofnięcia łapy, zmniejsz dopływ powietrza pokojowego do 1 L/min, tlenu do 0,4 L/min oraz izofluranu do 2% mieszaniny objętościowej.</li>
	<li>Włącz monitor temperatury z rektalnym teletermometrem.</li>
	<li>OTWÓR zacisk respiratora i ZAMKNIJ zacisk komory indukcyjnej.</li>
	<li>Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i umieść go na prowadnicy do intubacji endotrachealnej.</li>
	<li>Wykonaj intubację szczura. Wprowadź laryngoskop do pyska zwierzęcia, użyj długiej pęsety, aby odsunąć język, przemyj wnętrze gardła patyczkiem nasączonym lidokainą i delikatnie wprowadź kaniulę z rurką endotrachealną do tchawicy szczura.</li>
	<li>Po intubacji podłącz koniec węża respiratora do zewnętrznego końca rurki endotrachealnej; obserwuj i potwierdź, że szczur oddycha miarowo i bez trudności.</li>
	<li>Przywiąż rurkę endotrachealną, dbając o to, aby język nie znalazł się pod węzłem.</li>
	<li>Nałóż wazelinę na sondę teletermometru rektalnego i wprowadź ją bezpośrednio pod ogon.</li>
	<li>Wyjmij tackę na preparat z ABS z komory pomiarowej i umieść ją pod lampą grzewczą w celu ogrzania przed umieszczeniem na niej szczura.</li>
	<li>Ogól górną część skóry głowy szczura, zaczynając znad oczu aż do obszaru między uszami.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami standardową piankową zatyczkę do uszu na dwie identyczne połowy. Zacznij od środka podstawy zatyczki i tnij prosto do zaokrąglonego czubka. Wsuń po jednej połówce do każdego ucha, najpierw wzdłuż kanału słuchowego, aż do kontaktu z błoną bębenkową.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę rektalną. Po osiągnięciu temperatury 37 °C szczur jest gotowy do umieszczenia w tackce na preparat z ABS.</li>
	<li>Zabezpiecz szczura w tackce na preparat z ABS. Odłącz wąż respiratora od rurki endotrachealnej i szybko, lecz delikatnie, wsuń szczura do górnej części tacki, ostrożnie prowadząc głowę przez otwór uchwytu na głowę i gumowy kołnierz. Ponownie podłącz wąż respiratora do rurki endotrachealnej, sprawdź, czy gumowy kołnierz przylega bezpiecznie, ale nie zbyt ciasno do szyi i zweryfikuj, czy szczur leży w pozycji bocznej brzusznej (Rycina 3).</li>
	<li>Wyłącz izofluran i odłącz wąż respiratora od rurki endotrachealnej.</li>
	<li>Zablokuj i zabezpiecz tackę na preparat z ABS zawierającą znieczulonego szczura w komorze pomiarowej ABS.</li>
	<li>Delikatnie uszczykuj palce tylnej łapy za pomocą długiej pęsety co 3 s, aż do wywołania odruchu cofnięcia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia ABS Blast oraz indukcja TBI za pomocą fali uderzeniowej
UWAGA: Kroki protokołu 2.1–2.10 są zazwyczaj wykonywane równocześnie z krokami 1.1–1.22, tak aby ABS był gotowy do podania urazu wywołanego falą uderzeniową natychmiast po umieszczeniu i zabezpieczeniu szczura w komorze z próbką.
<ol>
	<li>Poluzuj pokrętło hydraulicznej pompy ręcznej (Rysunek 4A), aby umożliwić ucieczkę pozostałego uwięzionego powietrza z komory napędzającej (Rysunek 4B) i poluzować komorę w miejscu uszczelnienia.</li>
	<li>Poluzuj nakrętki (Rysunek 4C) na prętach gwintowanych (Rysunek 4D) otaczających komorę napędzającą, a następnie przesuń komorę w lewo, oddalając ją od komory rozprężnej (Rysunek 4E).</li>
	<li>Całkowicie wyjmij dwa pręty gwintowane wraz z odpowiadającymi im nakrętkami znajdujące się na górze komory napędzającej, aby umożliwić umieszczenie arkuszy mylaru pomiędzy komorą napędzającą a rozprężną.</li>
	<li>Ułóż w stos i sklej wzdłuż górnej krawędzi cztery docięte i wymierzone arkusze mylaru (długość 30 cm, szerokość 20 cm, grubość 0,004 in.), tworząc „membranę” z mylaru, używając kawałka taśmy maskującej o długości 2,54 cm. Używając drugiego kawałka taśmy, mocno przyklej górną krawędź membrany mylarowej do góry komory rozprężnej oraz nad środkiem otworu pomiędzy komorami napędzającą i rozprężną (Rysunek 4F).</li>
	<li>Przymocuj komorę napędzającą do membrany mylarowej, ponownie wkładając dwa pręty gwintowane do górnej części komory i ręcznie dokręcając wszystkie nakrętki otaczające komorę.</li>
	<li>Dopasuj dodatkowy blok stalowy do bloku hydraulicznej pompy ręcznej i komory napędzającej, aż zostaną stabilnie osadzone.</li>
	<li>Dokręć pokrętło hydraulicznej pompy ręcznej i potwierdź, że komora napędzająca pozostaje pod ciśnieniem i nie wykazuje wycieków, obserwując stałą wartość progową ciśnienia na manometrze hydraulicznym.</li>
	<li>Otwórz plik akwizycji wyzwalacza, który rejestruje przebiegi ciśnienia urządzenia wybuchowego ABS na komputerze sterującym urządzeniem.</li>
	<li>Poluzuj główne pokrętło zbiornika sprężonego powietrza (Rysunek 4G) na tyle, aby lekko otworzyć drogę powietrza.</li>
	<li>Obsługuj hydrauliczną pompę ręczną, aż wskaźnik manometru osiągnie czerwoną strzałkę wskazującą pożądany poziom ciśnienia w komorze wynoszący ≈5,000 psi.</li>
	<li>Zabeziecz i umieść zanarkotyzowane zwierzę na tacy okazowej ABS (Rysunek 4H) w pozycji bocznej brzusznej (Rysunek 3) i zablokuj tacę w komorze okazowej ABS (Rysunek 4I).</li>
	<li>Delikatnie uciśnij tylną łapę za pomocą długiej pęsety co 3 s, aż do wywołania odruchu wycofania.</li>
	<li>Kliknij Start na otwartej stronie akwizycji na komputerze urządzenia wybuchowego ABS.</li>
	<li>Po pojawieniu się na ekranie okna „Acquisitioning”, naciśnij i przytrzymaj wyzwalacz urządzenia wybuchowego ABS, aż nastąpi wybuch, który rozerwie membranę mylarową i zada szczurowi uraz wybuchowy ABS (20,9 psi ±1,14, 138 kPa ±7,9). Natychmiast po detonacji uruchom drugi stoper, aby monitorować czas (w minutach i sekundach), jaki upłynął po urazie.</li>
	<li>Zdejmij szczura z tacy okazowej ABS i przenieś go na niebieską podkładkę i koc grzewczy, kładąc go całkowicie na plecach w celu oceny supresji odruchu prostowania.</li>
	<li>Zapisz czas powrotu odruchu prostowania. Obserwując drugi stoper, odnotuj w minutach i sekundach czas po urazie, w którym szczur trzy kolejne razy przetoczy się z pleców na brzuch. Wróć szczura do anestetycznej komory bąbelkowej.</li>
	<li>Poluzuj pokrętło hydraulicznej pompy ręcznej, aby umożliwić poluzowanie i przemieszczenie komory napędzającej.</li>
	<li>Dokręć główne pokrętło zbiornika sprężonego powietrza, aby zamknąć drogę powietrza.</li>
</ol>
<img alt="Schemat systemu ekspozycji gryzoni na powietrze; przepływ powietrza, komora dla preparatu; konfiguracja badawcza, badania na zwierzętach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Umieszczenie szczura na tacy do preparatów ABS i wewnątrz ABS. Kierunek i orientacja zwierzęcia badawczego wewnątrz ABS. Po umieszczeniu w ABS zwierzę znajduje się w poprzecznej pozycji prone, przy czym grzbietowa powierzchnia głowy jest prostopadła do kierunku fali uderzeniowej (czerwone strzałki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ rury falowej; butle ze sprężonym powietrzem, komora z próbką, tłumik fali; dynamika ciśnienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat urządzenia rury falowej Advanced Blast Simulator (ABS). Główne komponenty ABS. A = hydrauliczna pompka ręczna; B = komora napędowa; C = nakrętki dociskowe; D = pręty gwintowane;  E = komora rozprężna; F = miejsce umieszczenia membrany z mylaru; G = butle ze sprężonym powietrzem; H = taca na próbki; I = komora z próbką.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowanie roztworu PSS dla tętnicy środkowej mózgu (MCA) gryzoni
UWAGA: Kroki protokołu 3.1–3.3 są zazwyczaj wykonywane równolegle z krokami 1.1–1.22, aby roztwór PSS był gotowy do użycia.
<ol>
	<li>Przygotować i wymieszać 1 000 mL fizjologicznego roztworu soli (PSS) o następującym składzie i stężeniach: 130 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; 5 mM glukozy; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.</li>
	<li>Równoważyć PSS mieszaniną gazową 21% O2 i 5% CO2 w równowadze z N2. Roztwór jest gotowy, gdy pH wynosi 7,4. 
	UWAGA: Wszystkie gazy pozyskano z butli z gazem sprężonym w wyżej wymienionych stężeniach.</li>
	<li>Napełnić butelki zbiorniki i przewody przygotowanym roztworem PSS, a pozostałą część roztworu schłodzić.</li>
</ol>
4. Wyobcywanie odcinków tętnicy środkowej mózgu (MCA) gryzoni
<ol>
	<li>Po udokumentowaniu czasu odruchu wyprostnego, należy umieścić szczura z powrotem w komorze indukcyjnej do znieczulenia. ZAMKNIJ zacisk prowadzący do respiratora i OTWÓRZ zacisk prowadzący do komory. Ustaw stężenie izofluranu na 4% objętości mieszaniny i pozostaw szczura w komorze przez 2–3 min, aż do uzyskania głębokiej narkozy.</li>
	<li>Po znieczuleniu szczura OTWÓR clamp prowadzący do respiratora i ZAMKNIJ clamp prowadzący do komory znieczulającej. Zredukuj stężenie izofluranu do 2% mieszaniny objętościowej i wyjmij zwierzę z komory. Połóż go na brzuchu na podgrzewanym kocu i ponownie podłącz koniec węża respiratora do zewnętrznego końca rurki endotrachealnej.</li>
	<li>Utrzymuj wentylację mechaniczną przy częstotliwości oddechów między 40 a 45 oddechów na minutę oraz znieczulenie przy stężeniu 2% w mieszaninie objętościowej przez 30 lub 60 minut bezpośrednio po urazie bTBI.</li>
	<li>Po upływie 30 lub 60 minut czasu przeżycia zwiększyć stężenie izofluranu do 4% objętości mieszaniny i prowadzić głęboką anestezję przez 5–6 min. Następnie bezzwłocznie przeprowadzić eutanazję poprzez dekapitację przy użyciu gilotyny przeznaczonej dla gryzoni. 
	UWAGA: W eksperymentach tych zwierzęta pozostawały pod narkozą i były wentylowane mechanicznie od momentu powrotu odruchu prostowania aż do dekapitacji. Jeśli badanie wymaga dłuższych punktów czasowych przeżycia, zwierzętom należy podać środki przeciwbólowe przed wybudzeniem z narkozy. </li>
	<li>Ostrożnie wyjmij mózg z czaszki. Używając ostrza skalpela nr 10, wykonaj centralne, pionowe nacięcie o długości 1,5 cala, sięgające kości, od góry ogolonej skóry głowy w dół aż do wyrostka kłykciastego potylicznego.</li>
	<li>Użyj małych kleszczy kostnych do otwarcia i oddzielenia skóry skalpu od kości czaszki.</li>
	<li>Za pomocą dużych kleszczy kostnych wyciąć i usunąć kość potyliczną, kość międzyparietalną oraz dolną połowę kości czołowej otaczających mózg.</li>
	<li>Po uwolnieniu mózgu z otaczającej go kości, należy go ostrożnie wydobyć z czaszki za pomocą szpatułki chirurgicznej. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas oddzielania mózgu od czaszki, aby uniknąć niepotrzebnego szarpania, gwałtownego poruszania lub odciągania delikatnych segmentów MCA od ściany czaszki.</li>
	<li>Umieść pobrany mózg w schłodzonym roztworze PSS znajdującym się w małej szklanej płytce Petriego, która spoczywa bezpośrednio na stałym bloku lodu.</li>
	<li>Ostrożnie usuń obie tętnice mózgu środkowej (MCA), zaczynając od koła Willisa. Kontynuuj usuwanie segmentu w kierunku bocznym i grzbietowym na odległość około 4–5 mm.</li>
	<li>Delikatnie oczyścić zebrane segmenty MCA o długości około 4–5 mm z wszelkiej tkanki łącznej przy użyciu mikropincety.</li>
	<li>Zamocuj tętnice środkowe mózgu (MCA) w arteriografie. Zakaniuluj proksymalny koniec każdego segmentu za pomocą pierwszej szklanej mikropipety (średnica ≈70 µm) i zabezpieczyć szwem nylonowym 10-0.</li>
	<li>Należy delikatnie przepłukać światła naczyń roztworem PSS, aby usunąć z nich pozostałości krwi oraz inne treści.</li>
	<li>Wprowadź drugą mikropipetę do kaniulacji dystalnego końca każdego segmentu, nie rozciągając segmentu MCA, a następnie zabezpiecz go szwem nylonowym 10-0.</li>
	<li>Po pomyślnym zamontowaniu segmentu tętnicy środkowej mózgu (MCA), należy umieścić komorę na stole mikroskopu odwróconego w celu powiększenia naczyń. Mikroskop jest wyposażony w kamerę wideo, monitor oraz skaler wideo skalibrowany za pomocą mikrometru optycznego do pomiarów średnicy tętnic.</li>
	<li>Napełnić każdy segment oraz otaczającą go kąpiel arteriograficzną stale cyrkulującym roztworem PSS, ogrzanym z temperatury pokojowej do 37 °C i wyrównano z mieszaniną gazów zawierającą 21% O22 oraz 5% CO22 na wadze N2.</li>
	<li>Równoważyć segmenty MCA pod ciśnieniem 50 mmHg przez 60 min, podnosząc butelki z rezerwuarem podłączone do mikropipet na odpowiednią wysokość nad segmentami. Przetworniki ciśnienia umieszczone między mikropipetami a butelkami z rezerwuarem pozwolą ocenić ciśnienie transmuralne w segmencie MCA, wskazując moment osiągnięcia pożądanego ciśnienia 50 mmHg.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu equilibracji zwiększyć ciśnienie wewnątrznaczyniowe do 100 mmHg poprzez ustawienie butelek z rezerwuarem na różnych wysokościach.</li>
	<li>Podaj 30 mM K+ (do potwierdzenia skurczu naczynia) poprzez perfusat luminalny i zmierz średnice tętnic. Około 10 min później podaj 10-5 Podano ACh (w celu rozszerzenia naczyń) i zmierzono średnice tętnic.</li>
	<li>Zbadaj reakcje rozszerzenia naczyń. Obniż butelki zbiorcze, aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrznaczyniowe ze 100 mmHg do 80 mmHg. Pozostaw segmenty MCA na 10 min w celu wyrównania ciśnienia. Zmierz średnice tętnic.</li>
	<li>Obniż ciśnienie wewnątrz naczyniowe z 80 mmHg do 60 mmHg. Pozostaw segmenty MCA na 10 min w celu wyrównania ciśnienia. Zmierz średnice tętnic.</li>
	<li>Obniż ciśnienie wewnątrz naczyniowe z 60 mmHg do 40 mmHg. Pozostaw segmenty MCA na 10 min w celu wyrównania ciśnienia. Zmierz średnice tętnic.</li>
	<li>Obniż ciśnienie wewnątrz naczyniowe z 40 mmHg do 20 mmHg. Pozostaw segmenty MCA na 10 min w celu wyrównania ciśnienia. Zmierz średnice tętnic.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podobnie jak w przypadku wszystkich protokołów i instrukcji, konieczne jest, aby pewne kroki związane z protokołem w tym konkretnym badaniu były przestrzegane tak dokładnie i precyzyjnie, jak to możliwe. Po wstępnej intubacji szczura ważne jest, aby upewnić się, że oddycha on stabilnie i bez trudności. Błędne wprowadzenie rurki dotchawiczej do przełyku zamiast tchawicy spowoduje zgrzytliwy, trudności w oddychaniu, krwawienie, a następnie obudzenie szczura z powodu niedostatecznego dostarczania środka znieczulającego do płuc.
Podczas przyklejania arkuszy membrany mylarowej nad środkiem otworu między sterownikiem a komorą rozprężną, konieczne jest, aby arkusze były wyśrodkowane i zakrywały cały otwór39,41. Niewłaściwe ustawienie arkuszy nad otworem spowoduje wyciek powietrza z komory sterownika, spadek ciśnienia wymaganego dla potencjału rozerwania membrany i odmowę podania obrażeń spowodowanych wybuchem. Niezbędne jest również prawidłowe umiejscowienie i bezpieczne zamocowanie stalowego bloku akcesoriów względem bloku pompy ręcznej układu hydraulicznego i komory sterownika, a także dokręcenie pokrętła pompy ręcznej hydraulicznej i potwierdzenie, że w komorze kierowcy nie ma wycieków. Odpowiednie umieszczenie bloku stalowego pozwala na szczelne przyleganie komory sterującej do komory rozprężnej, tworząc w ten sposób obowiązkowe uszczelnienie wymagane nad otworem komory przez arkusze membrany Mylar oraz między sterownikiem a komorą rozprężną.
Podczas przygotowań przed ekstrakcją w naczyniu MCA, gazowanie PSS wymaganą mieszaniną 21%O2 i 5% CO2 w równowadzeN2 równoważy roztwór i ułatwia uzyskanie niezbędnego neutralnego fizjologicznego pH potrzebnego dla działającego roztworu PSS 21,33,34.
Równoważenie segmentów pod stałym ciśnieniem przez 60 minut 21,32,33,34 jest niezwykle obowiązkowe, ponieważ ten krok pozwala segmentom zwęzić się zgodnie z maksymalnym dylatacją wykazaną podczas ich pierwszego pierwotnego zwiększania ciśnienia. Zdarzenie to demonstruje występowanie tonu spontanicznego, właściwości sugerującej zdrową tętnicę 32,33,34. Chociaż różne poziomy ciśnienia do równoważenia segmentów zostały wykorzystane w innych badaniach 33,34,42, to badanie oraz te Mathew i wsp.21, Golding i wsp.35 oraz Golding i wsp.43 zrównoważyły segmenty przy 50 mmHg. Podczas gdy równoważenie pobranych segmentów w dowolnym miejscu między 40 mmHg a 100 mmHg32 pozwala na pewną elastyczność i modyfikację na tym etapie protokołu, godzinny okres równowagi w tych parametrach ciśnienia ostatecznie potwierdza zdrowe tętnice potrzebne do kontynuacji eksperymentu.
Zachowanie szczególnej ostrożności podczas usuwania mózgu z czaszki oraz lewego i prawego segmentu MCA z Kręgu Willisa, przy jednoczesnym zachowaniu tych naczyń w stanie nienaruszonym, jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem całego protokołu. Nakłucie mózgu rongeurami kostnymi, rozdarcie lub poważne rozciągnięcie segmentów podczas usuwania lub przypadkowe pociągnięcie naczyń szpatułką chirurgiczną podczas wykopywania mózgu z czaszki ostatecznie doprowadzi do zniszczenia pobranych MCA, powodując niezdatne do użytku segmenty i zaprzestanie korzystania z tego zestawu tętnic, ostatecznie unieważniając cały eksperyment dla tego zwierzęcia.
Chociaż pomiar reakcji naczyń mózgowych na bodźce rozszerzające lub zwężające w segmentach MCA ex vivo pobranych po uderzeniu lub wybuchu TBI in vivo przyniósł sukces, metodologia ta nie jest pozbawiona trudności i/lub ograniczeń. Być może jedną z bardziej dostrzegalnych zawiłości związanych z badaniem konsekwencji TBI dla krążenia naczyń mózgowych jest oddzielenie jawnego wpływu TBI na naczynia krwionośne od ukrytych skutków spowodowanych różnymi materiałami i elementami generowanymi przez uszkodzony mózg44. Tej wyobrażalnej zagubienia można potencjalnie uniknąć, analizując ex vivo reakcje zwężające i rozszerzające naczynia krwionośne zebranych, perfundowanych i / lub ciśnieniowych MCA. W celu skrócenia czasu, w którym tętnice mózgowe in vivo są narażone na miejscowo uwalniany materiał wazoaktywny w miąższu przed śmiercią, pobranie tętnic mózgowych bezpośrednio po TBI może zmniejszyć stopień takich skutków przedłużonej ekspozycji. Badania ex vivo nad wyizolowanymi MCA dodatkowo dają perspektywę analizy mechanizmów urazowego uszkodzenia naczyń krwionośnych poprzez zastosowanie określonych agonistów receptorów i antagonistów lub renomowanych nośników uszkodzenia naczyniowego, które nie pozwoliłyby na tak skuteczną lub dyskryminującą analizę in vivo. Następnie ta metoda ex vivo może być połączona z ekspozycją ex vivo na leki w celu zbadania wynikowych reakcji miogennych (zwężenie naczyń krwionośnych lub rozszerzenie segmentu naczynia z powodu wewnątrznaczyniowej lub zewnątrznaczyniowej ekspozycji na lek).
Inne ograniczenia obejmują brutalne lub niecierpliwe usuwanie MCA z pobranego mózgu, co może skutkować przedwczesnym rozerwaniem naczyń, a tym samym unieważnieniem ich użytkowania. Ponadto, pozostawienie, aby upłynęło więcej niż kilka minut między eutanazją zwierzęcia, pobraniem naczyń i umieszczeniem ich w przygotowanym roztworze PSS, może również zanegować ich żywotność. Prawidłowo przeprowadzone i przestrzegane metody opisane w niniejszym protokole do testowania odpowiedzi miogennych MCA po bTBI trwają kilka godzin od początku do końca, a próby skrócenia czasu wymaganego do osiągnięcia sukcesu mogą zakończyć się niepowodzeniem eksperymentalnym. Jednak metoda ta jest wykonywana in vitro i wykorzystuje znacznie bardziej opłacalne oprzyrządowanie i sprzęt niż obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego in vivo w wysokiej rozdzielczości (MR)45,46 lub konwencjonalne techniki ultrasonografii dopplerowskiej/prędkościocytymetrii 47,48,49, które są również stosowane do badań naczyń krwionośnych.
Te odkrycia, że łagodne uszkodzenie bTBI jest związane z upośledzonymi reakcjami rozszerzającymi mózg na zmniejszone ciśnienie wewnątrznaczyniowe, mogą potencjalnie być funkcją skurczu naczyń krwionośnych 6,7 i hiperzwężenia VSMC50 wcześniej zgłaszanego po ekspozycji na blast, co ostatecznie prowadzi do wystąpień takich jak zmniejszona względna perfuzja mózgu. Dodatkowo, uszkodzenia wywołane wybuchem, utrudniające normalne reakcje rozszerzające naczynia krwionośne mózgu, mogą sprzyjać dalszemu zmniejszeniu perfuzji mózgowej w połączeniu z niedociśnieniem tętniczym, co jest częstym zjawiskiem podczas operacji bojowych.
Wyniki te wskazują, że bTBI powoduje zmianę mechanizmów ułatwiających kontrolę naczyń tętniczych. Chociaż zaobserwowano ostre upośledzenie naczyń mózgowych w tętniczej odpowiedzi miogennej na zmniejszenie ciśnienia wewnątrznaczyniowego przez co najmniej godzinę po urazie, nadal istnieją luki w informacjach dotyczących ostrej fazy po bTBI. Znaczenie określenia, jakie fizyczne i biochemiczne braki powodują urazy naczyń krwionośnych mózgu i narażenie mózgu na bTBI, może pomóc w określeniu poziomu sukcesu terapeutycznego i/lub rehabilitacyjnego bezpośrednio po urazie.

Podobne do tego powstałego w wyniku uderzenia (tj., urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) niepowiązanego z falą uderzeniową), urazowe uszkodzenie mózgu wywołane falą uderzeniową (bTBI) wiązano z uszkodzeniem naczyń mózgowych1 or zaburzone kompensacyjne reakcje naczyniowe mózgu na zdarzenia takie jak zmiany ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla (PaCO2)2,3,4 oraz tlenu (PaO2)5Ponadto ekspozycja na falę uderzeniową wywołała skurcz naczyń tętniczych w mózgu u zwierząt.6 oraz pacjenci po bTBI7,8Podczas klinicznego TBI9 or urazy wywołane uderzeniem cieczą (FPI)10,11,12 wiążą się z upośledzonymi odpowiedziami naczyniowymi mózgowia na zmiany ciśnienia tętniczego krwi (t. j., autoregulacja ciśnienia)9,10,11,12nadal istnieją wątpliwości dotyczące wpływu bTBI na zdolność autoregulacji ciśnienia naczyniowego w mózgu.
Krążenie mózgowe reaguje na zmiany systemowego ciśnienia tętniczego w celu utrzymania ciągłej dostawy tlenu i składników odżywczych do metabolicznie aktywnego mózgu13,14,15,16. Specyficzny rodzaj homeostazy, czyli autoregulacja17,18,19, zachodzi wtedy, gdy „narząd utrzymuje stały przepływ krwi pomimo zmian ciśnienia krwi (perfuzji) lub innych bodźców fizjologicznych bądź patologicznych”20. Tętnice mózgowe kurczą się lub rozszerzają w odpowiedzi na zmiany ciśnienia krwi, stężenia tlenku azotu (NO), lepkości krwi, PaCO2 oraz PaO2 i innych czynników4,11,16,21. Odpowiedź miogenna tętnic odnosi się do takich skurczów lub rozszerzeń. Naczyniowa odpowiedź miogenna, opisana po raz pierwszy przez Baylissa22 i będąca głównym mechanizmem przyczyniającym się do autoregulacji CBF, charakteryzuje się wazokonstrykcją w przypadku wzrostu ciśnienia perfuzyjnego i wazodylatacją w przypadku spadku ciśnienia perfuzyjnego14,17. Ta odpowiedź naczyniowa jest immanentną zdolnością tkanek kurczliwych (takich jak komórki mięśni gładkich naczyń, VSMC) do reagowania na rozciąganie i/lub zmiany w świetle naczynia i/lub napięciu ściany23,24,25,26,27,28,29. Gdy tętnice są rozciągane (np., podczas wzrostu ciśnienia wewnątrznaczyniowego), komórki VSMC kurczą się24,25,26,28.
Badania nad naczyniami oporowymi W badaniach ex vivo powszechnie stosuje się jedną z dwóch metod testowania właściwości farmakologicznych i fizjologicznych wyizolowanych naczyń oporowych: metodę pierścieniową (zawieszenia pierścienia) oraz metodę kaniulacji z nadciśnieniem. Metoda przygotowania naczynia w formie pierścienia polega na przełożeniu dwóch drutów wewnątrz światła segmentu naczynia, które utrzymują go w stałej pozycji. Pomiar siły działającej na druty utrzymywane izometrycznie pozwala ocenić stymulację komórek mięśni gładkich naczyń (VSMC). Technika ta wiąże się jednak z pewnymi zastrzeżeniami, przede wszystkim z nieuchronnym uszkodzeniem warstwy śródbłonka światła naczynia podczas przekładania przez nie drutów.30 or zróżnicowanym stopniem rozciągnięcia poddanego izolowanemu segmentowi, co z kolei prowadzi do rozszerzenia ściany naczynia, wpływając w ostateczności na jego wrażliwość na środki farmakologiczne31Metodyka przygotowania kanulowanego, ciśnieniowego naczynia wykorzystuje arteriograf składający się z dwóch oddzielnych komór, z których każda służy do umieszczenia tętnicy środkowej mózgu (MCA) pobranej od jednego zwierzęcia. Do każdego końca segmentu wprowadza się mikropipetę; koniec proksymalny segmentu zostaje przymocowany do mikropipety szwami, a światło naczynia jest delikatnie przepłukiwane fizjologicznym roztworem soli (PSS) w celu usunięcia krwi i innych substancji. Następnie koniec dystalny zostaje zabezpieczony szwami. Ciśnienie przezścianowe lub światła naczynia ustawia się poprzez podniesienie dwóch zbiorników przyłączonych do każdej pipety na odpowiednią wysokość powyżej każdego segmentu, przy czym zbiorniki te znajdują się na różnych wysokościach względem siebie.32,33,34,35,36Przetworniki ciśnienia rozmieszczone wzdłuż zbiorników i mikropipet służą do pomiaru ciśnienia perfuzyjnego, podczas gdy naczynia są powiększane przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w monitor, kamerę wideo i skaler, co umożliwia pomiar zewnętrznych średnic MCA. Choć obie metody są wartościowe, metodologia przygotowania kaniulowanego, ciśnieniowego naczynia lepiej naśladuje i pozwala badanym naczyniom na bycie bliższym ich in vivo warunki32,37.
Wpływ różnych rodzajów uderzeń (t. j., wpływ TBI (niepowiązanego z wybuchem) na reakcje naczyniowe mózgu był wcześniej badany w segmentach tętnic mózgowych21,35,36,38Stosując podobny protokół ex vivo dla MCA w zakresie pobierania, montowania i perfuzji naczyń, jak opisano w niniejszym badaniu, wcześniejsze prace odniosły sukces w badaniach nad powiązanymi mechanizmami dysfunkcji naczyń mózgowych po TBI. Golding i wsp.34 badano rozszerzenia naczyń zależne od śródbłonka w tętnicach środkowych mózgu (MCA) u dorosłych samców szczurów linii Long-Evans po ciężkim urazie czaszkowo-mózgowym (TBI) wywołanym kontrolowanym uderzeniem korowym (CCI). W drugim badaniu Golding i wsp.36 zbadano reaktywność naczyniową mózgu na hipotensję lub CO2 po pobraniu tętnic środkowych mózgu (MCA) od szczurów, u których wywołano łagodny uraz czaszkowo-mózgowy (CCI). Yu i wsp.38 podczas gdy Mathew et al. analizowali, czy zmiatacze nadtlenku azotku poprawiają reakcje rozkurczowe na obniżone ciśnienie wewnątrznaczyniowe w segmentach tętnicy środkowej mózgu (MCA) dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley poddanych FPI21 badano reakcje miogeniczne na hipotensję w tętnicach środkowych mózgu (MCA) pobranych po umiarkowanym, centralnym urazie penetrującym (FPI).
Aby dokładniej zbadać hipotezę, według której bTBI, podobnie jak nieblastowe TBI, prowadzi do upośledzenia reaktywności naczyniowej mózgu, przetestowano mechanizm przyczyniający się do zaburzeń autoregulacji poprzez pomiar odruchów rozszerzalności mięśniowej w odpowiedzi na obniżone ciśnienie wewnątrznaczyniowe ex vivo w izolowanych, ciśnieniowych segmentach MCA gryzoni (Rycina 1) pobranych od szczurów poddanych łagodnemu bTBI z użyciem modelu rury szokowej Advanced Blast Simulator (ABS) (Rycina 2 i Rycina 3) (patrz Rodriguez et al.39 Tabela 1), który wykorzystuje sprężone powietrze dostarczane bezpośrednio do komory napędowej w celu generowania fal nadciśnienia i podciśnienia typu Friedlandera40 (patrz Rodriguez et al.39 Rycina 1A).
<img alt="Schemat sieci tętniczej mózgu; zaznaczona MCA; badanie krążenia mózgowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Lokalizacja tętnic środkowych mózgu (MCA). Widok brzuszny mózgu szczura z zaznaczonym położeniem MCA w stosunku do tylnych tętnic mózgowych (PCA), wewnętrznych tętnic szyjnych (ICA), zewnętrznych tętnic szyjnych (ECA), tętnicy podstawnej (BA) oraz wspólnych tętnic szyjnych (CCA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ eksperymentalny dynamiki płynów przedstawiający urządzenie do tunelu aerodynamicznego do analizy przepływu powietrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Urządzenie do zaawansowanej symulacji wybuchu (ABS) w formie rury uderzeniowej. ABS wykorzystany do wywołania pierwotnych obrażeń powybuchowych u wszystkich zwierząt badawczych. 1 = komora napędowa; 2 = komora rozprężna; 3 = komora z próbką; 4 = tłumik fali odbitej; żółta gwiazdka = taca na próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany symulator wybuchu (ABS)</td><td>Dyn-FX Consulting, Ltd. i ORA, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Rurka szokowa symulująca wybuch używana do wywoływania urazów spowodowanych wybuchem&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorosłe szczury płci męskiej Sprague-Dawley&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Zwierzęta doświadczalne</td></tr><tr><td>Arteriograf</td><td>Living Systems Instrumentation, Inc.</td><td>Arteriograf</td><td>Montaż pobranych tętnic i pomiar średnicy światła&nbsp;</td></tr><tr><td>Rongeurs kostne, duże</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>Friedman Rongeur</td><td>Ekstrakcja mózgu z czaszki</td></tr><tr><td>Bone rongeurs, małe</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>Boynton Rongeur</td><td>Ekstrakcja mózgu z czaszki</td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Chlorek wapnia</td><td>Przygotowanie roztworu soli fizjologicznej dla śródmózgowia środkowego mózgu (PSS)</td></tr><tr><td>Zatyczki do uszu Zatyczki do uszu</td><td>3M</td><td>Piankowe zatyczki do uszu 1100 Klasa AL&nbsp;</td><td>Zapobiegaj uszkodzeniom błony bębenkowej ucha podczas korzystania z urządzenia do śrutowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>D-[+]-Glukoza</td><td>Preparat roztworu soli fizjologicznej środkowej tętnicy tętniczej (PSS) u gryzoni/gryzoni</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Piramal Enterprises Limited&nbsp;</td><td>Izofluran, USP</td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>Chlorek potasu</td><td>Preparat roztworu soli fizjologicznej środkowej tętnicy mózgowej (PSS) gryzoni</td></tr> <tr><td>MgSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Siarczan magnezu</td><td>Preparat roztworu soli fizjologicznej dla środkowej tętnicy mózgowej gryzoni (PSS)</td></tr><tr><td>Mikrokleszcze</td><td>Buxton Biomedical Inc.</td><td>Micro Wiązanie Fcps, 180 mm</td><td>Ekstrakcja mózgu z</td></tr><tr><td>czaszki Arkusze Mylar</td><td>Texas Art Supply</td><td>Mylar</td><td>Membrana używana do gromadzenia sprężonego powietrza podczas obróbki strumieniowo-ściernej</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Chlorek sodu</td><td>Przygotowanie roztworu soli fizjologicznej tętnicy środkowej mózgu u gryzoni (PSS)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>Wodorowęglan</td> <td>soduPrzygotowanie roztworu soli fizjologicznej dla środkowej tętnicy środkowej mózgu gryzoni (PSS)</td></tr><tr><td>Szew nylonowy</td><td>Ethicon</td><td>10-0 Szew nylonowy Ethilon monofilament 5" (13 cm)</td><td>Montaż pobranych tętnic i pomiar średnicy światła&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #10</td><td>Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej</td><td>Bard-Parker</td> 10 <td>Ekstrakcja mózgu z czaszki</td></tr><tr><td>Szpatułka chirurgiczna</td><td>Szpatułka do cementu chirurgicznego Delmaks Surgico</td><td>&nbsp;</td><td>Ekstrakcja mózgu z czaszki</td></tr><tr><td>Termometr&nbsp;</td><td>Physitemp Instruments, Inc.,&nbsp;</td><td>Termometr monitorujący Thermalert</td><td>Monitorowanie temperatury wewnętrznej ciała zwierzęcia doświadczalnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Wentylator objętościowy&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda, Inc.</td><td>Respirator dla małych zwierząt</td><td>Stały i stabilny oddech zaintubowanego zwierzęcia doświadczalnego</td></tr><tr><td>Koc wodny</td><td>Gaymar Industries, Inc.&nbsp;</td><td>Mul-T-Pad Podkładka do terapii temperaturowej</td><td>Utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia doświadczalnego&nbsp;</td></tr></tbody></table>

wpływ neurotraumy wywołanej wybuchem na tętnice środkowe mózgowe gryzoni pod ciśnieniem

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Chociaż przeprowadzono badania nad histopatologicznymi i behawioralnymi efektami ekspozycji na wybuch, mniej poświęcono je efektom naczyniowym na mózg. Wiadomo, że uderzeniowe (tj. niewybuchowe) urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) zmniejsza autoregulację ciśnienia w naczyniach mózgowych zarówno u ludzi, jak i zwierząt doświadczalnych. Hipotezę, że urazowe uszkodzenie mózgu wywołane wybuchem (bTBI), podobnie jak uderzenie TBI, powoduje upośledzenie reaktywności naczyniowej mózgu, przetestowano poprzez pomiar miogennych odpowiedzi rozszerzających na obniżone ciśnienie wewnątrznaczyniowe w segmentach środkowej tętnicy mózgowej (MCA) gryzoni u szczurów poddanych łagodnemu bTBI przy użyciu rurki szokowej Advanced Blast Simulator (ABS). Dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley zostały znieczulone, zaintubowane, wentylowane i przygotowane do Sham bTBI (identyczna manipulacja i znieczulenie, z wyjątkiem urazu postrzałowego) lub łagodnego bTBI. Szczury zostały losowo przydzielone do otrzymania pozorowanego bTBI lub łagodnego bTBI, a następnie ofiarowane 30 lub 60 minut po urazie. Bezpośrednio po bTBI oceniono czas tłumienia odruchu prostego (RR), zakończono eutanazję w punktach czasowych po urazie, pobrano mózg i pobrano poszczególne segmenty MCA, zamontowano je i poddano ciśnieniu. Ponieważ ciśnienie śródświetlne przenikające przez odcinki tętnicze zmniejszało się w krokach co 20 mmHg od 100 do 20 mmHg, mierzono i rejestrowano średnice MCA. Wraz ze spadkiem ciśnienia śródświetlnego, średnice MCA stale rosły znacznie powyżej wartości wyjściowej w grupach Sham bTBI, podczas gdy odpowiedzi rozszerzacza MCA były znacznie zmniejszone (p < 0,05) w obu grupach bTBI, o czym świadczą upośledzone, mniejsze średnice MCA odnotowane dla grup bTBI. Ponadto supresja RR w grupach bTBI była istotnie (p < 0,05) wyższa niż w grupach z pozorowanym bTBI. MCA pobrane z grup Sham bTBI wykazywały typowe właściwości rozszerzające naczynia krwionośne w celu zmniejszenia ciśnienia śródświetlnego, podczas gdy MCA zebrane po bTBI wykazywały znacznie upośledzone miogenne reakcje rozszerzające naczynia krwionośne na obniżone ciśnienie, które utrzymywały się przez co najmniej 60 minut po bTBI.

Średnie nadciśnienie bTBI dla wszystkich zwierząt w badaniu wynosiło 20.9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). Średni czas tłumienia odruchu prostowania (RR) u szczurów poddanych ekspozycji na falę uderzeniową ABS bTBI (5.37 min ±2.1) nie był istotnie dłuższy (p = 0.36, bTBI vs. grupa kontrolna) niż w grupie kontrolnej (5.10 min ±1.6).
W obu grupach pozorowanych (sham) 30 i 60 min średnice MCA zwiększyły się powyżej wartości bazowej w miarę zmniejszania ciśnienia w świetle naczynia ze 100 do 20 mmHg. W porównaniu z odpowiadającymi im grupami pozorowanymi, odpowiedzi rozszerzeniowe MCA na ciągłą wymuszoną redukcję ciśnienia wewnątrznaczyniowego w obserwowanych grupach ABS bTBI 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) i 60 min (p = 0,02, bTBI vs. sham) były znacząco zmniejszone po ekspozycji na wybuch (Rycina 5). Bardziej szczegółową dyskusję tych wyników można znaleźć w pracy Rodriguez et al.39.
Badania te wykazały, że łagodne bTBI znacząco upośledziło mózgowe kompensacyjne odpowiedzi rozszerzające na obniżone ciśnienie wewnątrz naczyniowe w segmentach MCA 30 i 60 min po łagodnym bTBI, podczas gdy zastosowane w tych badaniach łagodne poziomy fali uderzeniowej doprowadziły do czasu supresji RR (&lt;30 s) podobnego do tego u szczurów w grupie kontrolnej (sham-injured).
Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania. Odpowiedź miogeniczną na zmiany ciśnienia wewnątrznaczyniowego oceniano, obliczając procentową zmianę względem wartości bazowej (100 mmHg) dla każdego poziomu ciśnienia w świetle naczynia (80, 60, 40 i 20 mmHg). Do oceny różnic między wartościami bazowymi w grupie bTBI i grupie pozorowanej (sham) zastosowano nieparzyste testy t Studenta. Różnice w odpowiedziach rozszerzających MCA między grupami bTBI i pozorowaną oceniano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtórzeniami, testu wielokrotnych porównań Dunnetta oraz testu Bartletta dla równości wariancji.
Ze względu na spadek mocy statystycznej wynikający z wielokrotnego testowania, porównania w każdym konkretnym punkcie ciśnienia w eksperymentach MCA (np., między 100 a 80 mmHg lub między 60 a 40 mmHg itp.) nie przeprowadzono. Istotność przyjęto na poziomie p poziom ≤ 0,05. Wszystkie dane w tekście, w odniesieniowej tabeli oraz na rysunku przedstawiono jako średnie ± błędy standardowe średnich (SEM).
<img alt="Wykres ciśnienia wewnątrz naczyniowego względem średnicy MCA; porównanie efektów grupy sham i bTBI w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58792/58792fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wpływ bTBI na reakcje tętnicy środkowej mózgu (MCA) na obniżone ciśnienie wewnątrz naczyniowe. Reakcje rozszerzające na progresywne obniżanie ciśnienia wewnątrz naczyniowego wykazały upośledzenie odpowiedzi wazodylatacyjnej i były znacząco zredukowane w grupach bTBI 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) oraz 60 min (p = 0,02, bTBI vs. sham) (n = 6/grupa) po ekspozycji na blast w porównaniu do obu grup Sham (n = 12). W obu grupach sham (30 i 60 min) średnice MCA zwiększały się powyżej wartości bazowej w miarę obniżania ciśnienia w świetle naczynia ze 100 do 20 mmHg. Wartości przedstawiono jako średnie ± SEM. *p &lt; 0,05 vs. sham. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58792/58792fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół opisujący metody określania reaktywności naczyniowej ex vivo po pierwotnym uszkodzeniu mózgu (bTBI) przy użyciu izolowanych, ciśnieniowych, gryzoniowych segmentów środkowej tętnicy mózgowej (MCA). Indukcja bTBI odbywa się za pomocą rurki szokowej, znanej również jako urządzenie Advanced Blast Simulator (ABS).

Wpływ neurotraumy wywołanej wybuchem na tętnice środkowe mózgowe gryzoni pod ciśnieniem

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Metoda ta pomaga odpowiedzieć na pytanie, czy pourazowe uszkodzenie mózgu powoduje uszkodzenie naczyń mózgowych i czy zakres skutków rozciąga się na upośledzoną miogenną odpowiedź naczyniową. Izolowany preparat tętniczy pod ciśnieniem pozwala nam oddzielić bezpośrednie skutki ekspozycji na blasty na tętnice mózgowe od pośrednich skutków spowodowanych narażeniem na blast do mózgu. Izolowane i ciśnieniowe preparaty tętnicze mogą być stosowane do badania funkcji naczyń krwionośnych w różnych chorobach lub stanach, w tym udarze, nadciśnieniu, a następnie cukrzycy.Celem naszych badań jest zidentyfikowanie terapii, które utrzymują zdolność krążenia mózgowego do ochrony mózgu przed szkodliwymi skutkami krwotoku. Dzisiejsze procedury zademonstrują Maggie Parsley, zastępca dyrektora naszego laboratorium oraz Yaping Zeng, nasz główny technik badawczy. Aby przygotować zaawansowany symulator wybuchu lub ABS, użyj 2,54-centymetrowego kawałka taśmy maskującej, aby przykleić taśmę wzdłuż górnej krawędzi czterech ułożonych w stos wstępnie przyciętych arkuszy mylaru.Za pomocą drugiego kawałka taśmy przymocuj górną krawędź membrany Mylar do górnej części komory rozprężnej nad środkiem otworu między sterownikiem a komorami rozprężnymi. Wymień dwa pręty z każdym gwintem w górnej części komory i ręcznie dokręć wszystkie nakrętki kołpakowe otaczające komorę, aby zabezpieczyć komorę sterownika przed membraną Mylar. Dokręć pokrętło ręcznej pompy hydraulicznej i obserwuj stały próg ciśnienia na manometrze hydraulicznym, aby upewnić się, że w komorze kierowcy nie ma wycieków.Następnie otwórz plik akwizycji wyzwalacza, który rejestruje ślady ciśnienia urządzenia do strumieniowego napełniania ABS na komputerze urządzenia do strumieniowego usuwania ABS. Aby przygotować znieczulonego szczura do urazu, użyj długiej pęsety, aby ustawić język na bok i przetrzyj wzdłuż wnętrza gardła końcówką wacika nasączonego lidokainą, a następnie delikatnie włóż do tchawicy stylet zawierający rurkę dotchawiczą. Po zaintubowaniu włóż koniec węża respiratora do zewnętrznego końca rurki dotchawiczej i obserwuj oraz potwierdź, że szczur oddycha stabilnie i bez trudności.Następnie wyjmij tackę na próbki z ABS z komory na próbki i ogrzej ją pod lampą grzewczą. Podczas nagrzewania się tacki ogol górną część skóry głowy od góry oczu do przestrzeni między uszami i za pomocą nożyczek przeciąć piankową zatyczkę do uszu o standardowej wielkości od podstawy do zaokrąglonej końcówki na identyczne pionowe połówki. Następnie włóż przepołowiony kawałek do każdej końcówki dousznej, najpierw wzdłuż kanału słuchowego, aż do kontaktu z błoną bębenkową.Wyjmując wąż respiratora z rurki dotchawiczej, szybko, ale delikatnie wsuń szczura do górnego końca tacki na próbki, ostrożnie prowadząc głowę przez otwór uchwytu głowicy i gumowy kołnierz. Gdy szczur jest na miejscu, włóż ponownie wąż respiratora z powrotem do rurki dotchawiczej i sprawdź, czy gumowy kołnierz jest mocno zamocowany, ale nie ciasno wokół szyi i czy szczur leży w bocznej pozycji leżącej. Następnie zablokuj i zabezpiecz tackę na próbki ABS zawierającą znieczulonego szczura w komorze na próbki ABS i delikatnie ściskaj tylne palce łapy długimi pęsetami co trzy sekundy, aż zostanie wywołana reakcja odruchu wycofania.Kliknij Start na otwartej stronie akwizycji na komputerze urządzenia do wybuchu ABS, a następnie naciśnij i przytrzymaj spust urządzenia do wybuchu ABS w oknie akwizycji, aż wybuch nastąpi, rozrywając membranę Mylar i powodując uszkodzenie przez wybuch ABS. Zaraz po detonacji wybuchu uruchom drugi zegar, aby śledzić, ile czasu upływa w minutach i sekundach, zanim szczur wyprostuje się po urazie, i umieść szczura w pozycji leżącej na niebieskiej podkładce i rozgrzewce w celu oceny oceny tłumienia odruchów. Aby usunąć środkową tętnicę mózgową, użyj ostrza skalpela numer 10, aby wykonać centralne pionowe nacięcie o głębokości półtora cala od czubka ogolonej skóry głowy do kłykcia potylicznego i użyj małych rongeurów kostnych, aby otworzyć i oddzielić skórę głowy od kości czaszki.Używając dużych rongeurów kostnych, wytnij i wyciągnij potyliczną, międzyciemieniową i dolną połowę kości czołowych otaczających mózg i użyj szpatułki chirurgicznej, aby ostrożnie wydobyć mózg z czaszki, gdy zostanie ona uwolniona od otaczającej kości. Umieść pobrany mózg na małej szklanej szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór soli fizjologicznej (PSS) na bloku lodu pod mikroskopem preparacyjnym i ostrożnie usuń zarówno lewą, jak i prawą środkową tętnicę mózgową lub MCA, zaczynając od okręgu Willisa i kontynuując bocznie i grzbietowo przez około cztery do pięciu milimetrów. Za pomocą mikrokleszczyków delikatnie oczyścić pobrane segmenty MCA i zamontować tętnice na arteriografie.Zkaniuluj bliższy koniec każdego segmentu szklaną mikropipetą o średnicy 70 mikrometrów i zabezpiecz pipety nylonowymi szwami 10-O. Delikatnie perfunduj lampę za pomocą PSS, aby usunąć resztki krwi i kanulować dystalny koniec każdego segmentu za pomocą drugiej mikropipety bez rozciągania tkanki tętniczej. Zabezpiecz mikropipety drugim zestawem nylonowych szwów 10-O i umieść arteriograf na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę i monitor.Podnieś butelki z biustem podłączone do mikropipet na odpowiednią wysokość nad segmentami, aby zrównoważyć segmenty MCA pod ciśnieniem 50 milimetrów słupa rtęci przez 60 minut. Pod koniec okresu równowagi ustaw butelki na różnych wysokościach względem siebie, aby zbadać reakcje rozszerzające naczynia, opuść butelki w zbiorniku, aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrznaczyniowe do 80 milimetrów słupa rtęci i pozwól segmentom zrównoważyć się przez 10 minut. Następnie zmniejsz ciśnienie wewnątrznaczyniowe do 60, 40 i 20 milimetrów słupa rtęci, umożliwiając segmentom zrównoważenie się po każdej zmianie ciśnienia.Na tym reprezentatywnym wykresie średnica tętnicy jest przedstawiona na osi Y jako procentowa zmiana średnicy przy podstawowym ciśnieniu wynoszącym 100 milimetrów słupa rtęci. Na osi X pokazane są różne ciśnienia wewnątrznaczyniowe, przy których badano odpowiedzi rozszerzające tętnice. W grupie z pozorowanym urazem średnice MCA wzrosły powyżej wartości wyjściowej i nadal normalnie się rozszerzały, gdy ciśnienie śródświetlne zostało zmniejszone ze 100 do 20 milimetrów słupa rtęci.W przeciwieństwie do tego, reakcje rozszerzające MCA na ciągłe narzucone zmniejszenie ciśnienia wewnątrznaczyniowego w obserwowanych 30 i 60-minutowych grupach urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem były znacznie zmniejszone pod względem zdolności do rozszerzania się po ekspozycji na blast, co wskazuje na znaczne upośledzenie reakcji rozszerzających naczynia krwionośne mózgu na obniżone ciśnienie. Techniki ekstrakcji, odzyskiwania, montażu i obfitowania naczyń są niezwykle skomplikowane i należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować ostrożność podczas wykonywania tych procedur.

effects-blast-induced-neurotrauma-on-pressurized-rodent-middle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Logsdon, A. F.,  i wsp. Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni. (2020)Ten film pokazuje indukcję łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową w modelu mysim przy użyciu rurki do wstrząsu gazowego pod ciśnieniem. Wytworzona fala ciśnienia rozrywa membranę poliestrową, dostarczając falę uderzeniową do głowy myszy, która powoduje szybki ruch mózgu w czaszce, powodując łagodne urazowe uszkodzenie...

Generowanie łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową w modelu mysim

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Opisujemy wysoce powtarzalną metodę trwałego zamknięcia głównego naczynia krwionośnego mózgu gryzoni.  Technikę tę można osiągnąć przy bardzo niewielkim uszkodzeniu obwodowym, minimalnej utracie krwi, wysokim wskaźniku długoterminowego przeżycia i stałej objętości zawału współmiernej do populacji klinicznej ludzi.

Stała niedrożność naczynia mózgowego poprzez podwójne podwiązanie i przecięcie

Tutaj prezentujemy protokół do trwałego zamknięcia dystalnej tętnicy środkowej mózgu u starszych samic szczurów z jednoczesnym zamknięciem tętnic szyjnych w celu wygenerowania dużych zawałów korowych i utrzymujących się deficytów. Pokazujemy potwierdzenie wielkości zmiany za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego po 24 godzinach i 8 tygodniach po udarze.

Wykonywanie stałej dystalnej środkowej części mózgu z niedrożnością tętnicy szyjnej wspólnej u starszych szczurów w celu zbadania niedokrwienia kory mózgowej z trwałą niepełnosprawnością

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Przedstawione tutaj są metody wytwarzania powtarzających się ekspozycji na wybuchy o niskiej intensywności przy użyciu myszy.

Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Obecny protokół opisuje szczurzy model okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który zachowuje anatomiczną strukturę naczyń mózgowych bez powodowania uszkodzeń.

Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

Celem niniejszej pracy było ustalenie reprodukowalnej metody wykonywania kraniektomii z późniejszym trwałym, selektywnym zamknięciem tętnicy mózgowej środkowej u szczurów dla zastosowania w badaniach eksperymentalnych nad deficytami ruchowymi i przestrzenną pamięcią.

Selektywne i trwałe zatorowanie środkowej tętnicy mózgowej u szczurów: eksperymentalne podejście do badania niedoborów motorycznych i przestrzennej pamięci

Poznaj metodę oceny reaktywności naczyniowej tętnic środkowych mózgowych szczurów po urazie mózgu wywołanym wybuchem. Protokół izolowanych segmentów tętniczych pozwala badać bezpośrednie skutki urazu na funkcję naczyń mózgowych.

Wpływ neurotraumy wywołanej wybuchem na tętnice środkowe mózgowe gryzoni pod ciśnieniem

Przeglądaj więcej filmów