Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji
15 marca 2019
Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.
W tym filmie opisujemy prostą i skuteczną metodę wizualizacji i analizy repertuaru przeciwciał na poziomie globalnym. Możliwe jest opisanie całego repertuaru limfocytów B u poszczególnych osób i ich dynamicznych zmian w odpowiedzi na stymulację immunologiczną. Metoda ta może być stosowana do analizy próbek patologicznych od pacjentów z pojawiającymi się infekcjami wirusowymi oraz do uzyskania danych o niespotykanym dotąd wglądzie w patogenezę infekcji.
Jednym z najbardziej ekscytujących obszarów zastosowania jest kontrola szczepionek. Skuteczność szczepionki można ocenić, analizując dynamikę globalnego repertuaru przeciwciał u osób, którym podano szczepionkę. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą potrzebować zoptymalizować warunki PCR, ponieważ skuteczność amplifikacji genu przeciwciała zależy od rodzajów materiałów wyjściowych.
Fla-cher do identyfikacji amplikonów immunoglobulin. Ważne jest, aby pokazać te działania wizualnie. Procedurę zademonstrują pani Sayuri Yamaguchi i pan Hanbing Xue, technik i doktorant z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj tkankę ośmiotygodniowej czarnej myszy C57 i przepuść ją przez siatkę ze stali nierdzewnej z dwoma mililitrami PBS, aby uzyskać rozproszone komórki. Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i wiruj pod ciśnieniem 600 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dodać 800 mikrolitrów buforu lizującego ACK do osadu.
Inkubować na lodzie przez dwie minuty, aby zlizować czerwone krwinki w tkance. Następnie umyj komórki tkanki trzykrotnie, używając trzech mililitrów PBS do każdego prania. Ponownie odwirować w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i dodać 800 mikrolitrów odczynnika izotiocyjanianu fenolu/guanidyny do osadu i dokładnie odwirować. Inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i wstrząsaj ręcznie przez 15 sekund.
Inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Odwirować przy 12 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby oddzielić fazy. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki.
Dodaj jedną objętość 70% etanolu. Krótko odwirować i nałożyć tę mieszaninę na kolumnę wirową krzemionki. Eluuj RNA za pomocą 30 do 100 mikrolitrów wody.
Następnie użyj fluorometru, aby określić ilościowo początkowe stężenie RNA. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Najpierw zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA od dwóch do 10 mikrogramów całkowitej matrycy RNA przy użyciu startera 5'RACE CDS i oligonukleotydu SMART-PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
W przypadku immunoglobuliny mysiej PCR amplifikuje cDNA za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności, przy użyciu uniwersalnego startera do przodu i starterów odwrotnych specyficznych dla klasy immunoglobulin, jak opisano w protokole tekstowym. W przypadku immunoglobuliny ludzkiej należy przeprowadzić pierwszy PCR przy użyciu uniwersalnego startera do przodu i specyficznych dla klasy immunoglobulin starterów odwrotnych z sekwencjami znaczników. Dołącz sekwencje indeksowe dla każdej próbki za pomocą drugiego PCR przy użyciu starterów sekwencji indeksowej.
Następnie poddaj elektroforezę jednemu z produktów PCR na 2% żelu agarozowym. Wizualizuj prążki DNA na transiluminatorze UV i wytnij plasterek żelu zawierający szerokie pasmo od 600 do 800 par zasad. Dodać 10 mikrolitrów roztworu wiążącego błonę na 10 miligramów plastra żelu.
Wymieszaj i inkubuj w temperaturze od 50 do 65 stopni Celsjusza, aż plastry żelu całkowicie się rozpuszczą. Następnie przenieś roztwór żelu na kolumnę wirową z membraną krzemionkową. Przemyć kolumnę raz buforem płuczącym i wymyć DNA 50 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz
.Za pomocą fluorometru oznacz ilościowo oczyszczone amplikony i połącz amplikony z każdej klasy immunoglobulin w równych ilościach do sekwencjonowania NGS. Następnie użyj elektroforezy mikrokapilarnej z chipem do wymiarowania DNA, aby określić rozmiar i stężenie bibliotek. Przechowuj biblioteki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Najpierw wygeneruj przykładowy arkusz kalkulacyjny przebiegu sekwencjonowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozmrozić wkład z odczynnikiem i biblioteki. Przygotować 0,2 normalnego roztworu wodorotlenku sodu i rozcieńczyć biblioteki, aby uzyskać pożądane stężenia molowe.
Następnie przepłukać i osuszyć celę przepływową i dodać 600 mikrolitrów rozcieńczonego i zdenaturowanego roztworu bibliotecznego do studzienki wkładu z odczynnikiem i rozpocząć sekwencjonowanie. Perspektywę repertuaru przeciwciał mysich jako całości można uzyskać z komórek lub tkanek, takich jak śledziona, szpik kostny, węzeł chłonny lub krew. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki repertuaru łańcuchów lekkich IgM, IgG1, IgG2c i immunoglobulin z naiwnej śledziony myszy.
Na wykresie V(D)J przegrupowania za pomocą 3D V(D)J rozmiar każdej kuli reprezentuje względną liczbę odczytów. Innymi słowy, reprezentuje liczbę mRNA przeciwciał w całych komórkach B. Siatka 3D składa się ze 110 genów V łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, 12 genów łańcucha ciężkiego D immunoglobuliny i czterech genów J łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, które są wyrównane, aby odzwierciedlić ich kolejność na chromosomie.
Wykres 2D VJ pokazuje profil rearanżacji VJ w repertuarze IGL. Długość każdego słupka reprezentuje względną liczbę odczytów. Oś X reprezentuje 101 genów łańcucha lekkiego immunoglobuliny V-kappa i trzy geny łańcucha lekkiego immunoglobuliny V-lambda, a oś Y reprezentuje cztery geny łańcucha lekkiego immunoglobuliny J-kappa i trzy geny łańcucha lekkiego immunoglobuliny J-lambda.
Perspektywa repertuaru przeciwciał ludzkich jako całości może być analizowana z różnych tkanek, w tym komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub tkanek patologicznych. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki repertuaru IgM, IgG całkowitego, IgA, IgD, IgE i IgL z prawidłowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Podobnie jak w modelu mysim, profil repertuarowy przegrupowania V(D)J jest pokazany na wykresie 3D V(D)J, w którym rozmiar każdej kuli reprezentuje względną liczbę odczytów.
Siatka 3D składa się z 56 genów ciężkiego łańcucha V immunoglobuliny, 27 genów ciężkiego łańcucha D immunoglobuliny i sześciu genów J łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, ustawionych w kolejności, w jakiej pojawiają się na chromosomie. Profil przegrupowania VJ w repertuarze IgL jest przedstawiony na wykresie 2D VJ, w którym długość każdego taktu reprezentuje względną liczbę odczytów. Oś X reprezentuje 41 genów łańcucha lekkiego immunoglobuliny V-kappa i 32 geny łańcucha lekkiego immunoglobuliny V-lambda, a oś Y reprezentuje pięć genów łańcucha lekkiego immunoglobuliny J-kappa i pięć genów łańcucha lekkiego immunoglobuliny J-lambda.
W materiale badawczym tego protokołu można wykorzystać niewielką liczbę komórek posortowanych za pomocą cytometrii przepływowej, a nawet kriosekcji próbek patologicznych. Konieczna będzie jednak staranna optymalizacja warunków PCR. Ponieważ informacje wyjściowe tego protokołu są ogromne, znajomość bioinformatyki pomogłaby w znalezieniu struktury sieci przeciwciał.
To doprowadziłoby do głębokiego zrozumienia układu odpornościowego.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę analizy i wizualizacji repertuarów przeciwciał z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji. Podejście to umożliwia badanie repertuarów limfocytów B oraz zachodzących w nich zmian w odpowiedzi na stymulację immunologiczną, dostarczając informacji na temat skuteczności szczepionek i patogenezy chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Genomika
- Patologia
Wstęp
- Zrozumienie repertuarów przeciwciał jest kluczowe dla oceny odpowiedzi immunologicznej.
- Sekwencjonowanie nowej generacji umożliwia kompleksową analizę genów przeciwciał.
- Metoda ta może być stosowana zarówno w próbkach zdrowych, jak i patologicznych.
- Zdobyte informacje mogą być wykorzystane w opracowywaniu szczepionek oraz strategii leczenia chorób.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do wizualizacji i analizy repertuarów przeciwciał.
- Ocena dynamiki odpowiedzi przeciwciał w różnych kontekstach.
- Zapewnienie podstaw do oceny skuteczności szczepionek.
Zastosowane metody
- Disekcja i przetwarzanie tkanki mysiej w celu pozyskania limfocytów B.
- Ekstrakcja RNA i synteza cDNA w celu amplifikacji genów przeciwciał.
- Sekwencjonowanie nowej generacji zamplifikowanych genów przeciwciał.
- Wizualizacja danych dotyczących repertuaru przeciwciał za pomocą wykresów 3D i 2D.
Główne wyniki
- Skuteczna amplifikacja i sekwencjonowanie genów przeciwciał z próbek mysich i ludzkich.
- Wizualizacja wzorców rearanżacji V(D)J w repertuarach przeciwciał.
- Wykazanie dynamicznych zmian w odpowiedziach przeciwciał po szczepieniu.
- Wgląd w skład repertuarów przeciwciał w zdrowiu i chorobie.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne ramy do analizy repertuarów przeciwciał.
- Wyniki mogą pogłębić zrozumienie odpowiedzi immunologicznych i pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Podejście to jest możliwe do zastosowania w różnych obszarach badawczych, w tym w opracowywaniu szczepionek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kompleksowe profilowanie repertuarów przeciwciał mysich i ludzkich z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji (NGS) umożliwia uzyskanie bezprecedensowego wglądu w różnorodność immunologiczną i dynamikę odpowiedzi. Możliwość ta ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka na wczesnym etapie odkrywania leków, wspierania oceny szczepionek oraz dostarczania informacji dla badań translacyjnych nad chorobami o podłożu immunologicznym. Analiza repertuarów o wysokiej rozdzielczości zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych w biofarmaceutycznych procesach rozwoju opartych na immunologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia globalną analizę różnorodności limfocytów B oraz mechanizmów odpowiedzi immunologicznej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie wykorzystania genów V(D)J i ekspansji klonalnej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania leków ukierunkowanych na immunologię.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia ilościowe, wysokoprzepustowe odczyty częstości genów przeciwciał w celu standaryzacji analizy.
- Umożliwia powtarzalne profilowanie repertuarów immunologicznych w różnych próbkach biologicznych i warunkach.
- Wspiera skalowalne przesiewanie interwencji szczepionkowych lub terapeutycznych poprzez monitorowanie przesunięć w repertuarze.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące repertuaru immunologicznego z biomarkerami istotnymi dla choroby oraz strategiami stratyfikacji pacjentów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez monitorowanie dynamiki odpowiedzi immunologicznej na stymulację lub patologię.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w immunoterapii i opracowywaniu szczepionek w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda profilowania repertuaru przeciwciał oparta na NGS integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania translacyjne, umożliwiając podejmowanie decyzji opartych na danych na wielu etapach procesu opracowywania.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia mapowanie różnorodności przeciwciał o wysokiej rozdzielczości do weryfikacji hipotez i wyjaśniania ścieżek sygnałowych.
- Skrining: Dostarcza ilościowe i powtarzalne wyniki do monitorowania odporności oraz weryfikacji gotowości testów.
- Analityka: Generuje wielkoskalowe zestawy danych sekwencyjnych i wizualizacje (wykresy 3D V(D)J, wykresy 2D VJ) do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany w repertuarze ze stanami chorobowymi lub odpowiedziami na szczepionki, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalną i adaptacyjną platformę do analizy repertuaru immunologicznego w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w programach celowanych immunologicznie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w profilowaniu immunologicznym i wspiera skalowalność wysokoprzepustową.
- Wartość strategiczna: Poprawia procesy podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie rzetelnych danych o odpowiedzi immunologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów w dziedzinie immunologii i szczepionek z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu bibliotek NGS, optymalizacji PCR oraz analizie bioinformatycznej.
- Wymaga dostępu do platform sekwencjonowania wysokoprzepustowego i infrastruktury obliczeniowej.
- Konieczna jest standaryzacja przetwarzania próbek i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów próbek, w tym sortowanych komórek i tkanek patologicznych, po optymalizacji protokołu.
- Znajomość bioinformatyki jest niezbędna do zarządzania i interpretacji wielkoskalowych zbiorów danych repertuarowych.
