Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozważaniach nad UCMSC, takie jak najlepsze źródło USMSC w terapii komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia konsekwentną izolację i energiczną proliferację UCMSC u wcześniaków i niemowląt urodzonych o czasie. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nieuleczalnych chorób.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozważania UCMSC, może być również stosowana do innych źródeł MSC, takich jak tkanka tłuszczowa, błona maziowa, skóra, miazga zębowa i tak dalej. Ogólnie rzecz biorąc, osoba, która dopiero zaczyna korzystać z tej metody, będzie miała problemy, ponieważ istnieje tak wiele różnic w etapach sekcji pępowiny i izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ te kroki są trudne do nauczenia, ponieważ istnieje kilka punktów, które można przeoczyć.

Aby rozpocząć preparację pępowiny, najpierw przygotuj metalową tacę, wysterylizowane nożyczki i kleszcze, dziesięciomililitrowe pipety, 25-mililitrowe pipety i dwie 60-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowych. Rozgrzej oczyszczone mieszanki enzymatyczne PBS, 500 mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i pożywki hodowlanej, do temperatury pokojowej. Usuń wcześniej odizolowaną pępowinę z 50-mililitrowej rurki w alpha MEM i umieść ją w plastikowej tacy.

Zważ pępowinę, a następnie użyj wysterylizowanych nożyczek, aby wyciąć pięć gramów pępowiny. Aby wysterylizować pępowinę, użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby zalać ją dziesięcioma mililitrami 70-procentowego etanolu. Następnie umyj przewód dwukrotnie, dodając dziesięć mililitrów PBS za pomocą dziesięciomililitrowej pipety.

Umieść umytą pępowinę w wysterylizowanym 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkanek i dodaj dziesięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i 0,5 mililitra oczyszczonych mieszanek enzymatycznych. Użyj wysterylizowanych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć przewód na dwa do trzech milimetrowych kawałków. Umieść naczynie w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie pokrój częściowo strawione kawałki na mniejsze kawałki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż homogenat stanie się lepki. Na koniec upewnij się, że homogenat łatwo przepływa przez pipetę o pojemności 25 mililitrów. Najpierw przygotuj cztery plastikowe probówki o pojemności 50 mililitrów w 500-mililitrowej butelce pożywki hodowlanej.

Użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby podzielić homogenat pępowiny na dwie plastikowe probówki o pojemności 50 mililitrów z około 7,5 mililitrami w każdej probówce. Następnie dodaj 20 mililitrów pożywki hodowlanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Zebrać każdy homogenat za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów i przefiltrować przez sitko o pojemności 100 mikrometrów umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 mililitrów.

Odwirować dwie probówki z filtratami o stężeniu 1000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant i wyrzucić go. Dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej do każdej probówki i ponownie zawiesić osady komórkowe.

Przenieś zawiesinę komórek na nową 60-milimetrową płytkę i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Aby wyhodować UCMSC, ogrzej PBS, trypsynę EDTA i pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej. Gdy komórki są przyczepione do płytki, usuń pożywkę i przemyj dwukrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i czerwone krwinki.

Dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i hoduj komórki, aż osiągną 90 do 100 procent zbieżności. Następnie umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami PBS, dodaj 0,5 mililitra trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do dziesięciu minut.

Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę. Dodaj zawiesinę komórek do nowej 100-milimetrowej płytki. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż osiągną 90 do 100 procent konfluencji.

Powtórz trypsynizację i dzielenie na dwie nowe płytki, aż do dziesiątego przejścia. Jako kryterium ich charakterystyki wykorzystano ekspresję markerów powierzchniowych UCMSC. Po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami i przeanalizowaniu za pomocą cytometrii przepływowej, okazały się dodatnie dla markerów sygnatury MSC, ale ujemne dla makrofagów monocytów, ujemne dla hematapoetycznych komórek macierzystych i komórek efitelialnych, ujemne dla komórek B, ujemne dla leukocytów i ujemne dla głównych markerów kompleksu zgodności tkankowej.

Aby ocenić zdolność USCMSC do różnicowania trójliniowego u wcześniaków i urodzonych o czasie, komórki zostały nakłonione do różnicowania się w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. UCMSC z powodzeniem różnicują się we wszystkie trzy typy komórek mezodermalnych, potwierdzając ich zdolność do różnicowania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że istnieją cztery kluczowe kroki.

Cięcie przewodu na dwa do trzech centymetrowych kawałków, cięcie na mniejsze kawałki, upewnienie się, że homogenat łatwo przepływa przez pipetę o pojemności 25 mililitrów i filtrowanie homogenatu przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.