Name: Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z pępowiny od wcześniaków i niemowląt donoszonych. Technika zapewnia spójną izolację i intensywną proliferację komórek z potencjałem terapeutycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (numer grantu: 25461644) i Young Scientists (B) (numery grantów: 15K19614, 26860845, 17K16298) JSPS KAKENHI.

Użycie próbek ludzkich do tego badania zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Kobe University Graduate School of Medicine (zatwierdzenie nr 1370 i 1694) i przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Izolacja i kultura UC-MSC
UWAGA: UC-MSC zostały pomyślnie wyizolowane, wyhodowane i rozszerzone (więcej niż przejście numer 4) z ponad 200 UC poddanych temu protokołowi. Spośród ponad 200 UC, 100% wykazało udaną izolację UC-MSC, mniej niż 5% wykazało przypadkowe zanieczyszczenie, mniej niż 15% wykazało zatrzymanie wzrostu, a ponad 80% wykazało udaną ekspansję UC-MSC.
<ol>
	<li>Zbieranie UC.
	<ol>
		<li>Przygotować plastikową probówkę o pojemności 50 ml, aseptyczne nożyczki i butelkę o pojemności 500 ml minimalnej pożywki niezbędnej (alpha MEM) modyfikowanej alfa w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aseptycznie wyciąć WZJG nożyczkami chirurgicznymi o długości około 5-10 cm i pobrać go wkrótce po urodzeniu przez cesarskie cięcie.</li>
		<li>Natychmiast umieść UC w plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj do niej 20-30 ml alpha MEM.</li>
		<li>Przechowuj UC w temperaturze pokojowej (RT) do czasu transportu do laboratorium. 
		nuta: Aseptyczne WZJG można przechowywać w podłożu bez surowicy w temperaturze pokojowej do 2 dni. Dlatego WZJG uzyskane z sąsiednich szpitali można odebrać, jeśli zostanie dostarczone do laboratorium w ciągu 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj UC.
	<ol>
		<li>Przygotować plastikową tackę, wysterylizowane nożyczki i kleszcze, pipety 10 ml, pipety 25 ml, dwie szalki do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), oczyszczone mieszanki enzymów (patrz tabela materiałów, rozpuszczone za pomocą sterylnego PBS w stężeniu 13 jednostek Wünscha/ml i przechowywane w temperaturze -80 °C) oraz butelkę o pojemności 500 ml ze zredukowaną pożywką surowicy (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Rozgrzać PBS, oczyszczone mieszanki enzymów, zredukowaną pożywkę surowicy i pożywkę hodowlaną [alfa MEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (AA) przechowywanego w temperaturze 4 °C] do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Wyjmij UC z rurki i umieść go w plastikowej tacy.</li>
		<li>Zważ i wypreparuj 5 g UC wysterylizowanymi nożyczkami.</li>
		<li>Wlej 10 ml 70% etanolu do UC w celu sterylizacji za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Umyj UC 10 ml PBS dwukrotnie za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Umieść UC w wysterylizowanym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 1).</li>
		<li>Dodać 10 ml zredukowanej pożywki surowicy do naczynia.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml oczyszczonych mieszanek enzymatycznych, aby osiągnąć końcowe stężenie około 0,62 jednostki Wünscha/ml. 
		nuta: Wykazano, że stosowanie oczyszczonych mieszanek enzymatycznych zamiast tradycyjnej kolagenazy poprawia wydajność i żywotność UC-MSC wyizolowanych z UC.</li>
		<li>Pokrój UC na 2-3 mm kawałki za pomocą wysterylizowanych nożyczek i kleszczy (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 2). 
		nuta: Proces ten trwa około 30 minut.</li>
		<li>Inkubować kawałki UC w temperaturze 37 °C przez 30 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Pokrój częściowo strawione kawałki UC na mniejsze kawałki, które łatwo przepływają przez pipetę o pojemności 25 ml. 
		nuta: Proces ten trwa około 30 minut.</li>
		<li>Mniejsze kawałki UC inkubować w temperaturze 37 °C przez 15-45 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . 
		nuta: Inkubację należy kontynuować, aż homogenaty staną się lepkie. Całkowity czas trawienia wynosi około 120 minut. Jednak w przypadku stosowania WZJG u wcześniaków czas trawienia może ulec skróceniu, ponieważ są one łatwo krojone i trawione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizolować UC-MSC.
	<ol>
		<li>Przygotuj cztery plastikowe probówki o pojemności 50 ml i butelkę o pojemności 500 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Podziel homogenat UC na dwie plastikowe probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml, z około 7,5 ml w każdej probówce.</li>
		<li>Dodaj 20 ml pożywki hodowlanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Przefiltruj każdy homogenat UC przez sitko o pojemności 100 μm umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml, używając pipety o pojemności 25 ml do zebrania komórek pochodzących z UC. 
		nuta: Każdy z tych procesów trwa około 15 minut, ponieważ strawiony roztwór UC jest lepki.</li>
		<li>Odwirować dwie probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić go.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w dwóch probówkach z 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę o średnicy 60 mm i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura UC-MSC.
	<ol>
		<li>Rozgrzej PBS, trypsynę-EDTA (0,25 w/v%) i pożywkę hodowlaną (alfa MEM zawierającą 10% FBS i 1% AA) do RT.</li>
		<li>Gdy komórki są przymocowane do płytki o średnicy 60 mm, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj dwukrotnie 5 ml PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i czerwonych krwinek. 
		nuta: Przyczepione komórki zwykle pojawiają się po 3-5 dniach od początkowego posiewu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 4).</li>
		<li>Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 aż do 90-100% zgrywy. 
		nuta: Zwykle trwa to 7-14 dni po wstępnym poszyciu.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 5 ml PBS, dodaj 0,5 ml trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
		<li>Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj 9 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę o średnicy 100 mm i wyhodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1, krok 5).</li>
		<li>Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 aż do 90-100% zgrywy. 
		nuta: Zwykle trwa to 4-8 dni po wstępnym poszyciu.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS, dodaj 1 ml trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
		<li>Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj 9 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową na dwie nowe płytki o średnicy 100 mm i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1, krok 5).</li>
		<li>Powtarzaj subkulturę (podziały 1:2) aż do dziesiątego przejścia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 5). 
		nuta: Ponieważ komórki hodowane w warunkach mniej zlewających się mają tendencję do wcześniejszego zatrzymania proliferacji, ważne jest, aby pasażować komórki ze stosunkiem podziału 1:2.</li>
		<li>Użyj komórek w piątym do ósmym pasażu do analizy markerów powierzchniowych komórek, testu różnicowania komórek i innych eksperymentów. 
		nuta: Aby utrzymać energiczną proliferację tak długo, jak to możliwe, komórki są na ogół hodowane w ponad 70-80% zlewających się warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyrażenie znacznika powierzchni UC-MSC
<ol>
	<li>Przygotować komórki na płytce o średnicy 100 mm i dysocjować je za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
	<li>Dodać 9 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i wyrzucić go.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórkowe w 10 ml PBS i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten etap mycia dwukrotnie.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu cytometrii przepływowej (FCM) (PBS zawierający 2 mM EDTA i 10% odczynnik blokujący) na poziomie ~1 × 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść 50-100 μl zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml; dodać przeciwciała sprzężone z fikoerytryną (PE) przeciwko CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 lub HLA-DR; i inkubować na lodzie przez 45 minut.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć komórki buforem FCM i dodać 50-100 μl 0,2% roztworu barwnika o żywotności (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, dwukrotnie przemyć komórki buforem FCM i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Przepuść ogniwa przez FCM i przeanalizuj uzyskane wyniki za pomocą oprogramowania FCM zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Zróżnicowanie trójliniowe UC-MSC
<ol>
	<li>Wykonaj adipogenezę.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 5 × 103 komórek/ml.</li>
		<li>Umieścić 1 ml zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez ~24 godziny.</li>
		<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do różnicowania adipogenicznego (patrz tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-3 tygodnie. Zmieniaj pożywkę różnicującą adipogenną dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS i trzykrotnie 60% izopropanolem.</li>
		<li>Przygotować 0,5% roztwór czerwieni olejowej O, rozpuszczając 84 mg czerwonej oliwy O w 10 ml 100% izopropanolu i dodając 6,7 ml wody destylowanej. Plamić komórki 1 ml 0,5% roztworu czerwieni olejowej O w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie 60% izopropanolem i uwidocznij pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj osteogenezę.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 1 ×10 4 komórek/ml.</li>
		<li>Umieścić 1 ml zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez ~24 godziny.</li>
		<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do różnicowania osteogenicznego (patrz tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 1-2 tygodnie. Zmieniaj pożywkę różnicującą kości dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Przygotować 2% roztwór czerwieni S alizaryny, rozpuszczając 200 mg czerwieni alizarynowej S w 10 ml wody destylowanej. Barwić komórki 1 ml 2% roztworu czerwieni czerwonej alizarynowej S w temperaturze pokojowej przez 3 min.</li>
		<li>Umyj studzienki trzykrotnie PBS i wizualizuj pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj chondrogenezę.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 1,6 × 107 komórek/ml.</li>
		<li>Umieścić kroplę zawiesiny komórkowej o objętości 5 μl na środku studzienki na 12-dołkowej płytce (kultury mikromasowe) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-3 godziny.</li>
		<li>Delikatnie dodać 1 ml chondrogennej pożywki różnicującej (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 4-7 dni. Zmieniaj pożywkę do różnicowania chondrogennego dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Przygotować 0,05% roztwór błękitu toluidynowego, rozpuszczając 250 mg błękitu toluidynowego w 500 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,1. Zabarwić komórki 1 ml 0,05% roztworu błękitu toluidynowego w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS i wizualizuj pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells%3A+Revisiting+History%2C+Concepts%2C+and+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li>
<li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BMesenchymal%26%2334%3B+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">34;Mesenchymal&#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li>
<li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+proliferative+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+umbilical+cord+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.</a> Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).</li>
<li>Manochantr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+amnion%2C+placenta%2C+Wharton%27s+jelly+and+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Internal+Medicine+Journal%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.</a> Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).</li>
<li>Arutyunyan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+Cord+as+Prospective+Source+for+Mesenchymal+Stem+Cell-Based+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy.</a> Stem Cells International. 6901286, (2016).</li>
<li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Wharton%27s+Jelly%3A+The+Rich%2C+but+Enigmatic%2C+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li>
<li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li>
<li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194(2017).</li>
<li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751(2017).</li>
<li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li>
<li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li>
<li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li>
<li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li>
<li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells%3A+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MSCs mogą być izolowane z różnych tkanek i są niejednorodną populacją komórek, z których nie wszystkie wyrażają te same markery fenotypowe. W tym miejscu przedstawiliśmy protokół, który kieruje pobieraniem i sekcją WZJG od wcześniaków i niemowląt urodzonych o czasie oraz umożliwia izolację i hodowlę UC-MSC. Postępując zgodnie z tym protokołem, udało nam się wyizolować UC-MSC, które spełniają kryteria ISCT19 od płodów/niemowląt urodzonych w 19-40 tygodniu ciąży i wykazaliśmy, że reprezentują one ni...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są pierwotnie izolowane i charakteryzowane ze szpiku kostnego (BM)1,2, ale mogą być również uzyskane z szerokiej gamy tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, mazi maziowej, skóry, miazgi zębowej i przydatków płodu3. MSCs są rozpoznawane jako niejednorodna populacja komórek, która może namnażać się i różnicować w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Ponadto MSCs posiadają zdolność migracji do miejsc urazów, tłumienia i modulowania odpowiedzi immunologicznej oraz przebudowy i naprawy urazów. Obecnie MSCs z różnych źródeł cieszą się rosnącym zainteresowaniem jako źródło terapii komórkowej przeciwko wielu nieuleczalnym chorobom, w tym chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi, zawale mięśnia sercowego i zawałowi mózgu4,5.
Chociaż BM jest najlepiej scharakteryzowanym źródłem MSC, inwazyjność aspiracji BM etycznie ogranicza jego dostępność. Zdolność do namnażania i różnicowania MSCs uzyskanych z BM na ogół zmniejsza się wraz z wiekiem dawcy. W przeciwieństwie do tego, płodowe MSC uzyskane z przydatków płodu, takich jak łożysko, krew pępowinowa (UCB) i pępowina (UC), mają zalety, w tym mniej etycznych obaw dotyczących pobierania próbek oraz solidną zdolność do proliferacji i różnicowania6,7. Wśród przydatków płodu, które są zwykle wyrzucane jako odpady medyczne, UCB i UC są uważane za narząd płodu, podczas gdy łożysko jest uważane za płódź. Ponadto od łożyska i UCB należy pobrać i pobrać je dokładnie w momencie porodu noworodka, natomiast łożysko i UC można pobrać i przetworzyć po porodzie. W związku z tym UC jest obiecującym źródłem MSC dla terapii komórkowej8,9.
Ludzkie UC zaczyna rozwijać się wraz z postępującą ekspansją jamy owodniowej w 4-8 tygodniu ciąży, kontynuuje wzrost do 50-60 cm długości i może być izolowane przez cały okres porodu noworodka10. Aby uzyskać wgląd w patofizjologię chorób nieuleczalnych, używamy MSC pochodzących z UC (UC-MSC) od niemowląt urodzonych w różnym wieku ciążowym11,12. W tym protokole opisujemy, jak izolować i charakteryzować UC-MSC od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

<table><tbody><tr><td>Plastikowa tubka 50 ml</td><td>AS One Coporation, Osaka, Japonia</td><td>Violamo 1-3500-22</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>AGC Techno Glass, Tokio, Japonia</td><td>Iwaki 3815-012</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 60 mm</td><td>AGC Techno Glass, Tokio, Japonia</td><td>Iwaki 3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (100 &mu; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Falcon 35-2360</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mu; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Falcon 35-2350</td><td></td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japonia</td><td>135-15175</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka w surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td><td>OPTI-MEM Gibco 31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Gibco 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japonia</td><td>209-16941</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara BIO, Shiga, Japonia</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone mieszanki enzymatyczne</td><td>Roche, Mannheim, Niemcy</td><td>Liberase DH Research Grade 05401054001</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD14</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347497</td><td>Partia: 3220644, RRID: mysie</td></tr><tr><td>przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z AB_400312 PE przeciwko CD19</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>340364</td><td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD34</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555822</td><td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD45</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555483</td><td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD73</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>550257</td><td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD90</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555596</td><td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD105</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>560839</td><td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko HLA-DR</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347367</td><td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td></tr><tr><td>Izotyp IgG1 k myszy sprzężony z PE</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555749</td><td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>Izotyp IgG2a k myszy</td> PE <td>Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555574</td><td>Partia: 3035934, RRID: AB_ 395953</td></tr><tr><td>Izotyp IgG2b k myszy sprzężony z PE</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555743</td><td>Partia: 3098896, RRID: AB_396086</td></tr><tr><td>Barwnik żywotności</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>Fixable Viability Stain 450 562247</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japonia</td><td>Block Ace UKB80</td><td></td></tr><tr><td>FCM</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSAria&nbsp; III Sorter</td><td></td>komórek</tr><tr><td>Oprogramowanie FCM</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSDiva</td> Pożywka <td></td></tr><tr><td>do różnicowania adipogennego</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do różnicowania osteogennego</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezy A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>Różnicowanie chondrogenne Średnie&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Zestaw do różnicowania chondrogenezy A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Polyscience, Warrigton, PA</td><td>16% Ultraczysty formaldehyd EM Grade #18814</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony O</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Arizarin Red S</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td></td><td></td>198161</tr><tr><td>Microscope</td><td>Keyence, Osaka, Japonia</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają znaczny potencjał terapeutyczny i przyciągają coraz większe zainteresowanie w dziedzinie biomedycyny. MSCs są pierwotnie izolowane i charakteryzowane ze szpiku kostnego (BM), a następnie pozyskiwane z tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, błony maziowej, skóry, miazgi zębowej i przydatków płodu, takich jak łożysko, krew pępowinowa (UCB) i pępowina (UC). MSCs to niejednorodna populacja komórek zdolna do (1) przylegania do tworzywa sztucznego w standardowych warunkach hodowli, (2) ekspresji markera powierzchni CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19- /HLA-DR- fenotypy oraz (3) trójliniowe różnicowanie na adipocyty, osteocyty i chondrocyty, zgodnie z aktualną definicją Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT). Chociaż BM jest najpowszechniej stosowanym źródłem MSC, inwazyjny charakter aspiracji BM etycznie ogranicza jego dostępność. Zdolność do namnażania i różnicowania MSCs uzyskanych z BM na ogół zmniejsza się wraz z wiekiem dawcy. W przeciwieństwie do tego, płodowe MSCs uzyskane z UC mają zalety, takie jak energiczna proliferacja i zdolność różnicowania. Nie ma obaw etycznych związanych z pobieraniem próbek WZJG, ponieważ są one zwykle uważane za odpady medyczne. Ludzkie WZJG zaczyna rozwijać się wraz z ciągłym wzrostem jamy owodniowej w 4-8 tygodniu ciąży i rośnie aż do osiągnięcia 50-60 cm długości i może być izolowane przez cały okres porodu. Aby uzyskać wgląd w patofizjologię chorób nieuleczalnych, wykorzystaliśmy MSC pochodzące z WZJG (UC-MSC) od niemowląt urodzonych w różnym wieku ciążowym. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę UC-MSC od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Procedury od pobrania pępowiny (UC) do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) przedstawiono w podsumowaniu na Ryc. 1. Pępowinę o długości około 5-10 cm można pobrać od wszystkich noworodków urodzonych przez cesarskie cięcie. Pępowina zaczyna rozwijać się w 4-8 tygodniu ciąży i stale rośnie, osiągając długość 50-60 cm, co pokazano na Ryc. 2. W pępowinie znajdują się dwie tętnice (A), jedna żyła (V), wyściółka pępowiny...

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozważaniach nad UCMSC, takie jak najlepsze źródło USMSC w terapii komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia konsekwentną izolację i energiczną proliferację UCMSC u wcześniaków i niemowląt urodzonych o czasie. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nieuleczalnych chorób.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozważania UCMSC, może być również stosowana do innych źródeł MSC, takich jak tkanka tłuszczowa, błona maziowa, skóra, miazga zębowa i tak dalej. Ogólnie rzecz biorąc, osoba, która dopiero zaczyna korzystać z tej metody, będzie miała problemy, ponieważ istnieje tak wiele różnic w etapach sekcji pępowiny i izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ te kroki są trudne do nauczenia, ponieważ istnieje kilka punktów, które można przeoczyć.Aby rozpocząć preparację pępowiny, najpierw przygotuj metalową tacę, wysterylizowane nożyczki i kleszcze, dziesięciomililitrowe pipety, 25-mililitrowe pipety i dwie 60-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowych. Rozgrzej oczyszczone mieszanki enzymatyczne PBS, 500 mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i pożywki hodowlanej, do temperatury pokojowej. Usuń wcześniej odizolowaną pępowinę z 50-mililitrowej rurki w alpha MEM i umieść ją w plastikowej tacy.Zważ pępowinę, a następnie użyj wysterylizowanych nożyczek, aby wyciąć pięć gramów pępowiny. Aby wysterylizować pępowinę, użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby zalać ją dziesięcioma mililitrami 70-procentowego etanolu. Następnie umyj przewód dwukrotnie, dodając dziesięć mililitrów PBS za pomocą dziesięciomililitrowej pipety.Umieść umytą pępowinę w wysterylizowanym 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkanek i dodaj dziesięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i 0,5 mililitra oczyszczonych mieszanek enzymatycznych. Użyj wysterylizowanych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć przewód na dwa do trzech milimetrowych kawałków. Umieść naczynie w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie pokrój częściowo strawione kawałki na mniejsze kawałki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż homogenat stanie się lepki. Na koniec upewnij się, że homogenat łatwo przepływa przez pipetę o pojemności 25 mililitrów. Najpierw przygotuj cztery plastikowe probówki o pojemności 50 mililitrów w 500-mililitrowej butelce pożywki hodowlanej.Użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby podzielić homogenat pępowiny na dwie plastikowe probówki o pojemności 50 mililitrów z około 7,5 mililitrami w każdej probówce. Następnie dodaj 20 mililitrów pożywki hodowlanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Zebrać każdy homogenat za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów i przefiltrować przez sitko o pojemności 100 mikrometrów umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 mililitrów.Odwirować dwie probówki z filtratami o stężeniu 1000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant i wyrzucić go. Dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej do każdej probówki i ponownie zawiesić osady komórkowe.Przenieś zawiesinę komórek na nową 60-milimetrową płytkę i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Aby wyhodować UCMSC, ogrzej PBS, trypsynę EDTA i pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej. Gdy komórki są przyczepione do płytki, usuń pożywkę i przemyj dwukrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i czerwone krwinki.Dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i hoduj komórki, aż osiągną 90 do 100 procent zbieżności. Następnie umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami PBS, dodaj 0,5 mililitra trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do dziesięciu minut.Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę. Dodaj zawiesinę komórek do nowej 100-milimetrowej płytki. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż osiągną 90 do 100 procent konfluencji.Powtórz trypsynizację i dzielenie na dwie nowe płytki, aż do dziesiątego przejścia. Jako kryterium ich charakterystyki wykorzystano ekspresję markerów powierzchniowych UCMSC. Po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami i przeanalizowaniu za pomocą cytometrii przepływowej, okazały się dodatnie dla markerów sygnatury MSC, ale ujemne dla makrofagów monocytów, ujemne dla hematapoetycznych komórek macierzystych i komórek efitelialnych, ujemne dla komórek B, ujemne dla leukocytów i ujemne dla głównych markerów kompleksu zgodności tkankowej.Aby ocenić zdolność USCMSC do różnicowania trójliniowego u wcześniaków i urodzonych o czasie, komórki zostały nakłonione do różnicowania się w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. UCMSC z powodzeniem różnicują się we wszystkie trzy typy komórek mezodermalnych, potwierdzając ich zdolność do różnicowania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że istnieją cztery kluczowe kroki.Cięcie przewodu na dwa do trzech centymetrowych kawałków, cięcie na mniejsze kawałki, upewnienie się, że homogenat łatwo przepływa przez pipetę o pojemności 25 mililitrów i filtrowanie homogenatu przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.

isolation-characterization-human-umbilical-cord-derived-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Opisujemy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowania w linię mięśni szkieletowych.

Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

To badanie przedstawia unikalną procedurę sekcji w celu zachowania integralności galarety Whartona (WJ), co skutkuje mniej uszkodzonym WJ oraz większą ilością i żywotnością pobranych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta wykazuje lepszą wydajność i zdolność proliferacyjną w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny o wysokiej wydajności i niskich uszkodzeniach

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z pępowiny od wcześniaków i niemowląt donoszonych. Technika zapewnia spójną izolację i intensywną proliferację komórek z potencjałem terapeutycznym.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Przeglądaj więcej filmów