Name: Indukcja i ocena mysiego modelu eksperymentalnej krótkowzroczności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę indukcji krótkowzroczności u myszy za pomocą specjalnych okularów montowanych na głowie. Technika umożliwia precyzyjne pomiary refrakcji i długości osiowej oka w badaniach okulistycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy M.T. Pardue za porady dotyczące SDOCT, F. Schaeffelowi za porady dotyczące pomiarów refrakcji i krzywizny rogówki, Panu Sanshouo za odtworzenie trójwymiarowych danych ramy, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; i Y. Wang za krytyczne dyskusje. Prace te zostały wsparte przez Grants inAid for Scientific Research (KAKENHI, numer 15K10881) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) dla TK. Prace te są również wspierane przez grant na badania nad krótkowzrocznością z Tsubota Laboratory, Inc. (Tokio, Japonia).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach Szkoły Medycznej Uniwersytetu Keio, przestrzegając Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych, Wytycznych Instytucjonalnych dotyczących Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Keio oraz wytycznych Badań na Zwierzętach: Raportowanie Eksperymentów In Vivo (ARRIVE) dotyczących wykorzystania zwierząt w badaniach.
1. Montaż okularów dla myszy
<ol>
	<li>Przygotuj części potrzebne do montażu okularów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a). Do każdej myszy przygotuj wszystkie elementy: jeden nylonowy kij montowany na głowie, jedną wyższą i jedną dolną tytanową ramkę, dwie soczewki o odpowiednich mocach w zależności od celu eksperymentu, jedną w rozmiarze M1,4 o długości 10 mm, jedną nakrętkę pod w rozmiarze M1,4, jedną podkładkę gładką pod w rozmiarze M1,4 o grubości 0,3 mm, oraz dwie sztuczne końcówki paznokci (tabela materiałów). 
	UWAGA: Istnieją dwa rodzaje ram o różnych wysokościach. W przypadku jednej myszy jako zestaw używana jest jedna wyższa ramka i jedna dolna ramka. Wyższe oprawki powinny być umieszczone nad dolnymi, aby pola widzenia były symetryczne. Oprawki i soczewki są specjalnie projektowane i produkowane przez autorską grupę badawczą. Można je uzyskać, kontaktując się z autorami korespondencyjnymi tego artykułu. Inne części można znaleźć w detalicznych sklepach z narzędziami.</li>
	<li>Zamontuj oprawkę na prawe i lewe oko osobno.
	<ol>
		<li>Ułóż końcówkę paznokcia tak, aby była skierowana na zewnątrz, aby uzyskać najlepszy efekt ochronny. Dostosuj kąt między czubkiem paznokcia a ramką tak, aby wynosił około 130°, aby uniknąć maskowania pola widzenia myszy (Rysunek 1b). Przyklej sztuczne końcówki paznokci do ramy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. 
		UWAGA: Opuszki paznokci mogą pomóc chronić obiektyw przed zarysowaniem przez mysz. Kierunek opuszków paznokci musi być przeciwny, ponieważ górna ramka i dolna ramka są używane odpowiednio dla prawego i lewego oka.</li>
		<li>Odczekaj co najmniej 12 godzin, aby klej całkowicie wyschł, a następnie za pomocą obcinacza do paznokci wyreguluj kształt końcówek paznokci na około 1 cm × 1 cm, przycinając i przycinając.</li>
		<li>Przyklej soczewkę do oprawki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Umieść obiektyw ręcznie na ramce i trzymaj oprawkę poziomo. Wstrzyknij klej cyjanoakrylowy od krawędzi soczewki i pozwól klejowi rozprzestrzenić się pod wpływem napięcia powierzchniowego. 
		UWAGA: Klej spowoduje erozję soczewki i wpłynie na jej przezroczystość, więc upewnij się, że klej dotyka tylko peryferyjnej części soczewki. Użyj soczewki płaskiej 0 dioptrii (D) jako soczewki kontrolnej i ujemnej, aby wywołać krótkowzroczność. Wpływ różnych mocy soczewek ujemnych (od –10 D do –50 D) został opisany w innym miejscu4. Aby zmaksymalizować indukcję krótkowzroczności, do wywoływania krótkowzroczności zalecana jest soczewka –30 D. FDM można również indukować za pomocą tego samego urządzenia, po prostu zmieniając soczewkę w nasadkę mikrorurki 1,5 ml jako dyfuzor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokręć w nylonowym patyczku razem z podkładką od płaskiej strony drążka. Przygotuj odpowiednio okulary i patyczki przed eksperymentem i zapas do dalszego użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c). 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Pomiary refrakcji i linii bazowej AL.
<ol>
	<li>Nałóż jedną kroplę środka rozszerzającego ognice zawierającego 5 mg/ml tropikamidu i 5 mg/ml chlorowodorku fenylefryny po każdej stronie gałki ocznej, aby rozszerzyć źrenicę. Odczekaj co najmniej 5 minut przed znieczuleniem ogólnym. 
	UWAGA: Rozszerzenie źrenicy w znieczuleniu ogólnym spowoduje odwracalną zaćmę, która wpływa na późniejszy pomiar. Zawsze rozszerzaj źrenicę przed znieczuleniem ogólnym i odczekaj co najmniej 5 minut. Jedna kropla (około 0,05 ml) środka zwiększającego źrenice źrenic wystarczy do rozszerzenia źrenicy oka myszy, podczas gdy więcej środka nie zaszkodzi następnym krokom.</li>
	<li>Umieść mysz w znieczuleniu ogólnym. Chwyć delikatnie tylną skórę myszy, aby mysz nie uderzała w oko, dopóki nie zostanie całkowicie znieczulona. Oceń, że głębokość znieczulenia ogólnego jest wystarczająca, jeśli mysz nie porusza się, gdy jest swobodnie położona na stole. 
	UWAGA: Do znieczulenia ogólnego u myszy o objętości 0,01 ml/g do wstrzykiwań dootrzewnowych stosuje się kombinację midazolamu (40 μg/100 μl), medetomidyny (7,5 μg/100 μl) i winianu butorfanolu (50 μg/100 μl). Ogólnie rzecz biorąc, myszy potrzebują mniej niż 5 minut, aby zasnąć. Długi czas znieczulenia ogólnego powoduje niską temperaturę ciała i spowolnione bicie serca. Aby uniknąć potencjalnego wpływu znieczulenia ogólnego na pomiar, zaleca się zakończenie wszystkich pomiarów w ciągu 10 minut po wstrzyknięciu środka znieczulającego. Butorfanol podany w koktajlu znieczulającym zapewnia około 4 godziny działania przeciwbólowego. Właściwa receptura na znieczulenie ogólne może się różnić w zależności od instytucji.</li>
	<li>Zmierz refrakcję oka myszy za pomocą fotorefraktora na podczerwień4,9,14. Dostosuj kierunek jednego z oczu myszy, aby pierwszy obraz Purkinjego znajdował się na środku źrenicy i zmierz załamanie wzdłuż osi optycznej. Po pomiarze zmierz przeciwległe oko za pomocą tych samych procedur (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a). 
	UWAGA: Na wartość zmierzoną dla załamania ma duży wpływ położenie oka myszy wzdłuż osi optycznej. Upewnij się, że pierwszy obraz Purkinjego jest wyrównany w zakresie ±3 stopnia od środka źrenicy. Stół warsztatowy systemu optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) może być używany do precyzyjnego dostrajania kierunku źrenicy w pomiarach refrakcji4.</li>
	<li>Zmierz AL oka myszy za pomocą systemu SD-OCT4,15,16. Zdefiniuj AL jako odległość od wierzchołka rogówki do najjaśniejszej granicy w pobliżu nerwu wzrokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2b). 
	UWAGA: Podobnie jak w przypadku pomiaru refrakcji, AL jest pod silnym wpływem kierunku oka myszy. Wierzchołek rogówki można potwierdzić za pomocą punktowego odbicia na powierzchni rogówki. Granica strony siatkówki będzie bardzo zamglona w miejscu nerwu wzrokowego. Dostosuj nieco kierunek, aby granica była wystarczająco wyraźna do pomiaru, ale nie za daleko od nerwu optycznego.</li>
</ol>
3. Utrwalenie ramki na czaszce myszy.
<ol>
	<li>Nałóż jedną kroplę 0,1% kropli do oczu z oczyszczonego hialuronianu sodu, aby zapobiec wysuszeniu każdego oka. 
	UWAGA: Kropla do oczu na powierzchni oka wpłynie na wartości pomiarów refrakcji i długości osiowej. Nie należy stosować kropli do oczu po znieczuleniu, dopóki nie zostaną wykonane wszystkie pomiary.</li>
	<li>Połóż podbródek znieczulonej myszy na zboczu wykonanym z gliny lub czegokolwiek, co może służyć jako poduszka, aby przednia płaszczyzna czaszki była pozioma.</li>
	<li>Wysterylizuj włosy i skórę głowy między uszami a oczami za pomocą bawełnianego wacika z 70% etanolem.</li>
	<li>Przetnij skórę między uszami i oczami, aby odsłonić czaszkę na około 0,8 cm2 za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Użyj płynu do trawienia zębów i bawełnianego wacika, aby usunąć okostną. Wysterylizuj nożyczki chirurgiczne i pęsetę 70% etanolem przed operacją każdej myszy. 
	UWAGA: Może być wymagane strzyżenie włosów i noszenie sterylnych rękawiczek. Przed tą procedurą należy zapoznać się z przepisami odpowiedniej komisji ds. opieki nad zwierzętami. W większości przypadków płyn do trawienia zębów można znaleźć jako jedną z nasadek w samoutwardzalnym systemie adhezji dentystycznej. Jeśli płyn do trawienia zębów nie jest dostępny, zamiast niego użyj 70% etanolu.</li>
	<li>Zmontuj zestaw ramek bez soczewki, aby pomóc zamocować drążek we właściwej pozycji. Umieść ramki na główce myszy. Ostrożnie wyreguluj położenie ramek, aby upewnić się, że oba oczy znajdują się pośrodku pustej ramki.</li>
	<li>Użyj samoutwardzalnego systemu kleju dentystycznego, aby przymocować patyczek do główki myszy. Uważaj, aby płyn z systemu przylegającego nie dostał się do oka myszy. 
	UWAGA: Metoda stosowania samoutwardzalnego systemu adhezji dentystycznej różni się w zależności od produktu. Zapoznaj się dokładnie z instrukcją. 
	UWAGA: Niektóre odczynniki w systemie adhezji dentystycznej mogą być toksyczne.</li>
	<li>Odczekaj około 5 minut i ostrożnie zdejmij ramkę i nakrętkę, nie zmieniając położenia drążka (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a).</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo chlorowodorek atipamezolu w dawce 0,75 mg/kg, aby pomóc myszy szybciej dojść do siebie po znieczuleniu. Umieść mysz w osobnej klatce, aż w pełni wyzdrowieje. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
4. Rozpoczęcie indukcji krótkowzroczności i jej późniejsze utrzymanie
<ol>
	<li>Odczekaj co najmniej 24 godziny po zabiegu, aby mysz mogła całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia. Chwyć kij i załóż oprawki z soczewkami. Indukcja rozpoczyna się w tym punkcie czasowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3b). 
	UWAGA: Aby zminimalizować dyskomfort podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i dać wystarczająco dużo czasu na koagulację systemu adhezjologicznego, zdecydowanie zaleca się założenie ramy po tym, jak myszy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia. Cement żywiczny systemu klejowego w pełni pokryje nacięcie skóry głowy. Dlatego nie jest potrzebne żadne specjalne leczenie pooperacyjne w celu zapobiegania infekcji i łagodzenia bólu pooperacyjnego. Zaraz po pierwszym założeniu oprawki myszy będą zbyt świadome istnienia soczewki i bardzo ją porysują. Ogólne zachowanie wróci do normy po kilku godzinach. Myszy z soczewkami mogą być trzymane w tej samej gęstości co normalne myszy.</li>
	<li>Zdejmij oprawkę i czyść soczewki i końcówki paznokci bawełnianymi wacikami co najmniej dwa razy w tygodniu, aby zachować przezroczystość soczewki. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby znieczulania myszy w celu wyjęcia i założenia ramy. Zapewnij myszom podparcie, na którym mogą siedzieć, zamiast zawieszać się podczas pracy z nimi, co może zmniejszyć stres.
	<ol>
		<li>Jeśli konieczny jest pomiar tymczasowy, umieść mysz w znieczuleniu i zmierz mysz zgodnie z wcześniejszym opisem. Indukcja może być kontynuowana po powrocie myszy do zdrowia po znieczuleniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyść klatkę co najmniej dwa razy w tygodniu. 
	UWAGA: Pomaga to zachować przejrzystość obiektywu. Pomocne może być również umieszczenie siatki między myszą a dnem klatki w celu filtracji resztek jedzenia.</li>
	<li>Monitoruj masę ciała i zachowanie brutto. Porównaj je z nietkniętymi myszami w tym samym wieku podczas całego procesu eksperymentalnego. 
	UWAGA: Z wyjątkiem niektórych zachowań związanych z drapaniem, nie stwierdzono żadnych znaczących zmian, w tym masy ciała, między myszami eksperymentalnymi a myszami nieleczonymi.</li>
</ol>

<ol><li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myopia+boom%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myopia boom.</a> Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).</li>
<li>Ohno-Matsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+Myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Asia-Pacific+Journal+of+Ophthalmology+%28Philadelphia%2C+Pa%29%22%5BJournal%5D)">Pathologic Myopia.</a> Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).</li>
<li>Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+deprivation+and+lens-induced+myopia%3A+are+they+different%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+%26+Physiological+Optics%22%5BJournal%5D)">Form deprivation and lens-induced myopia: are they different.</a> Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+murine+model+of+experimental+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient murine model of experimental myopia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2026(2018).</li>
<li>Torii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violet+Light+Exposure+Can+Be+a+Preventive+Strategy+Against+Myopia+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression.</a> EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).</li>
<li>Smith, E. L. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Long-Wavelength+Lighting+on+Refractive+Development+in+Infant+Rhesus+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).</li>
<li>Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wavelength+composition+and+temporal+modulation+of+ambient+lighting+strongly+affect+refractive+development+in+young+tree+shrews%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews.</a> Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+quantitative+profiling+of+differential+retinal+protein+expression+in+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+using+fluorescence+difference+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis.</a> Molecular Medicine Reports. , (2018).</li>
<li>Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+refractive+state+and+deprivation+myopia+in+two+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice.</a> Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).</li>
<li>Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+experimental+myopia+has+features+of+primate+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mouse experimental myopia has features of primate myopia.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).</li>
<li>Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head-mounted+goggles+for+murine+form+deprivation+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Head-Mounted+Spectacle+Frame+for+the+Study+of+Mouse+Lens-Induced+Myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia.</a> Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278(2016).</li>
<li>Siegwart, J. T. Jr, Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goggles+for+controlling+the+visual+environment+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Goggles for controlling the visual environment of small animals.</a> Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).</li>
<li>Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine-xylazine+anesthesia+causes+hyperopic+refractive+shift+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).</li>
<li>Chou, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+elongation+of+eye+size+in+DBA%2F2J+mice+compared+with+C57BL%2F6J+mice%3A+in+vivo+analysis+with+whole-eye+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+axial+length+measurements+in+mouse+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Assessment of axial length measurements in mouse eyes.</a> Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).</li>
</ol>

Konstrukcja okularów myszy została zgłoszona do opatentowania (zgłoszenie nr 201741349).

Aby upewnić się, że okulary są stabilnie zamocowane na główce myszy, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków w tym protokole. Okostna musi zostać całkowicie usunięta przed użyciem systemu adhezji dentystycznej. Krew na czaszce również należy ostrożnie oczyścić. Chociaż dopuszczalne jest niewielkie dostrojenie zaraz po nałożeniu kleju, nie należy często przesuwać patyczka, zanim system kleju nie wyschnie. Postępuj zgodnie z instrukcją systemu klejowego, a zwłaszcza z proporcjami każdego składnika końcowej mieszank...

Częstość występowania krótkowzroczności ostatnio znacznie wzrosła, podczas gdy mechanizm jej początku i progresji jest nadal w dużej mierze nieznany1. Najbardziej charakterystycznym fenotypem krótkowzroczności jest wydłużenie długości osiowej (AL), co zwiększa ryzyko powikłań siatkówkowych, a nawet ślepoty2. Aby lepiej zrozumieć patogenezę krótkowzroczności i opracować skuteczne metody leczenia, niezbędne są solidne modele zwierzęce krótkowzroczności i stabilna ocena fenotypu.
Krótko mówiąc, istnieją dwie metody wywoływania stanów krótkowzroczności u zwierząt: krótkowzroczność deprywacji formy (FDM) i krótkowzroczność wywołana soczewką (LIM)3. Ten pierwszy umieszcza dyfuzory przed okiem lub zszywa powiekę, aby zasłaniać obraz, co wpływa na prawidłowy rozwój gałki ocznej, powodując fenotyp krótkowzroczności. Ten ostatni umieszcza soczewki minusowe przed okiem, aby przesunąć punkt ogniskowy za siatkówkę. Siatkówka wykrywa przesunięcie ostrości i wydłuża gałkę oczną, aby ponownie wyrównać siatkówkę i punkt ogniskowy. W przypadku FDM, po zamknięciu powieki lub zamocowaniu dyfuzora przed okiem, prawie nie jest wymagana dalsza konserwacja. W przypadku LIM soczewkę należy zdjąć do czyszczenia, aby pozostała przezroczysta. Tak więc FDM jest stosunkowo łatwy do technicznego wywołania. Jednak mechanizmy FDM i LIM są różne, a to, która metoda lepiej naśladuje krótkowzroczność u człowieka, jest nadal przedmiotem dyskusji3. Jedną z mocnych stron LIM jest silniejszy fenotyp w porównaniu z FDM, przynajmniej w przypadku myszy4.
Zwierzęta, które były wykorzystywane do wywoływania krótkowzroczności, to pisklęta5, małpy6, ryjówki drzewne7, świnki morskie8, oraz myszy4. Biorąc pod uwagę możliwość manipulacji genetycznej, obfitość dostępnych przeciwciał i niskie koszty hodowli, myszy mogły być pierwszym wyborem jako zwierzęcy model krótkowzroczności. Jednak w porównaniu z innymi większymi zwierzętami, mocowanie soczewek lub dyfuzorów przed okiem myszy jest stosunkowo trudne, szczególnie w przypadku młodych myszy, na przykład zaraz po odsadzeniu. W przypadku eksperymentów, które wymagają miejscowego podawania leku lub wielu tymczasowych pomiarów oka, konieczne jest również, aby ramka była zdejmowana. Kolejnym wyzwaniem jest niewielka zmiana morfologiczna gałki ocznej myszy, która wymaga wyrafinowanych technik i urządzeń do oceny. Do tej pory różne protokoły indukcji i pomiarów stosowane w różnych zespołach badawczych utrudniają porównywanie i powtarzanie wyników w różnych laboratoriach. Potrzebny jest standardowy protokół ze szczegółami.
Poprzednie prace opisywały wiele metod mocowania soczewek lub dyfuzorów przed okiem myszy, takich jak klejenie9, stitching10 i ramka gogli montowanych na głowie11,12. Połączyliśmy istniejące gogle montowane na głowie technics11,12,13 z naszą nowo zaprojektowaną ramą, aby opracować ulepszony protokół wywoływania solidnej i skutecznej eksperymentalnej krótkowzroczności u myszy. Protokół można zastosować u młodych myszy wkrótce po odsadzeniu w 21. dniu po urodzeniu (p21). Zoptymalizowaliśmy również procesy w celu stabilnej i precyzyjnej oceny fenotypów, w tym refrakcji i AL. Mamy nadzieję, że ten ustandaryzowany protokół pomoże uczynić myszy krótkowzroczne łatwiej dostępnym modelem do badań nad krótkowzrocznością.

<table><tbody><tr><td>śruba</td><td>NBK</td><td>SNZS-M1.4-10</td><td></td></tr><tr><td>podkładka</td><td>MonotaRO</td><td>42166397</td><td></td></tr><tr><td>nakrętka</td><td>MonotaRO</td><td>42214243</td><td></td></tr><tr><td>kij</td><td>DMM Marka nie</td><td></td><td>zaprojektowana przez autorów i wyprowadzona przez drukarkę 3D wypożyczoną od DMM Make.</td></tr><tr><td>rama</td><td>DMM Make</td><td>none</td><td>zaprojektowana przez autorów i wyprowadzona przez drukarkę 3D wypożyczoną od DMM Make.</td></tr><tr><td></td><td>soczewki RAINBOW CONTACT LENS</td><td>brak</td><td>dostosowany do myszy do użytku przez firmę</td></tr> klej <tr><td>cyjanoakrylowy</td><td>OK MODEL</td><td>MP 20g</td><td></td></tr><tr><td>klej dentystyczny żywica cementowa</td><td>SUN MEDICAL</td><td>super bond</td><td>zawiera płyn trawiący używany do usuwania okostnej czaszki myszy</td></tr><tr><td>fotorefraktor na podczerwień</td><td>Steinbeis Transfer Center</td><td>brak</td><td>zaprojektowany i oferowany przez dr Franka Schaeffela z University of T&uuml; bingen</td></tr><tr><td>Domena spektralna OCT</td><td>Leica</td><td>R4310</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamid, roztwór chlorowodorku penylefryny</td><td>Santen</td><td>Mydrin-P</td><td></td></tr><tr><td>midazolam</td><td>Sandoz K.K.</td><td>Komponenty SANDOZ</td><td>do znieczulającego</td></tr><tr><td>medetomidyny&nbsp;</td><td>Składniki Orion Corporation</td><td>Domitor</td><td>do znieczulającego</td></tr><tr><td>winianu butorfanolu&nbsp;</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>Vetorphale</td><td>składniki do środka znieczulającego</td></tr>: <tr><td>0,1 % oczyszczony hialuronian sodu</td><td>Santen</td><td>Hyaleina</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek atipamezolu</td><td>Zenoaq</td><td>antisedan</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena mysiego modelu eksperymentalnej krótkowzroczności

Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

Mysi model krótkowzroczności może być potężnym narzędziem do badań nad krótkowzrocznością, ze względu na stosunkowo łatwą manipulację genetyczną. Jednym ze sposobów wywołania krótkowzroczności u zwierząt jest umieszczanie przezroczystych soczewek ujemnych przed oczami na tygodnie (krótkowzroczność wywołana soczewką, LIM). Jednak istniejące protokoły indukcji i oceny różnią się w zależności od laboratorium. W tym miejscu opisaliśmy bardzo praktyczną i powtarzalną metodę indukowania LIM u myszy przy użyciu nowo zaprojektowanych okularów. Metoda stabilnie mocuje soczewkę przed okiem myszy, jednocześnie umożliwiając zdjęcie soczewki w celu oczyszczenia lub miejscowego podania leku. Fenotyp jest solidny i wydajny, a wariancja jest niewielka. Opisana tutaj metoda może być stosowana u myszy zaraz po odsadzeniu, co wydłuża możliwy czas trwania eksperymentów. Udzieliliśmy również porad technicznych dotyczących osiągania powtarzalnych wyników w pomiarach refrakcji i długości osiowej. Mamy nadzieję, że opisany tutaj protokół krok po kroku oraz szczegółowy artykuł pomogą naukowcom w płynniejszym przeprowadzaniu eksperymentów z krótkowzrocznością i umożliwią porównywanie danych między laboratoriami.

Najpierw sprawdź, czy wszystkie niezbędne części są przygotowane (Rycina 1a). Przykład gotowych okularów pokazano na Rycina 1b. Oprócz głównego elementu oprawek i nakrętki, wszystkie inne części są jednorazowe dla każdego mysza. Komplet gotowych okularów przedstawiono na Rycina 1c. Zmień kąt pomiędzy dwiema oprawkami, aby dopasować je do myszy w różnym wieku.
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

W tym protokole opisujemy pełny proces eksperymentalnego wywoływania krótkowzroczności u myszy przy użyciu nowo zaprojektowanych okularów oraz technikę potrzebną do osiągnięcia stabilnych i powtarzalnych wyników pomiarów parametrów oka.

Indukcja i ocena mysiego modelu eksperymentalnej krótkowzroczności

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące indukowania i oceny krótkowzroczności wywołanej soczewką u myszy. Na przykład jak stabilizować soczewki. Głównym etapem numer jeden tej techniki jest to, że wszystkie kroki zostały zoptymalizowane i ustandaryzowane, co pozwala na uzyskanie precyzyjnych, powtarzalnych i porównywalnych wyników w różnych laboratoriach.Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie mają trudności, ponieważ bardzo trudno jest stabilnie przykleić okulary do głów myszy bez żadnej praktyki. Dla każdej myszy przygotuj następujące elementy. Jeden nylonowy kij montowany na głowie.Jedna wyższa i jedna niższa rama tytanowa. Dwie soczewki o odpowiednich mocach w zależności od celu eksperymentu. Jedna śruba o długości M1.4 o długości 10 mm.Jedna nakrętka do w rozmiarze M1.4. 1 podkładka gładka do w rozmiarze M1.4 o grubości 0,3 milimetra. I dwie sztuczne końcówki paznokci.Aby zamontować odpowiednią oprawkę okularów, ułóż końcówkę paznokcia tak, aby była skierowana na zewnątrz, aby uzyskać najlepszy efekt ochronny. I dostosuj kąt między czubkiem paznokcia a ramką do około 130 stopni, aby uniknąć maskowania pola widzenia myszy. Za pomocą kleju

inducement-and-evaluation-of-a-murine-model-of-experimental-myopia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę wywoływania zapalenia powierzchni oka i dysfunkcji gruczołów Meiboma w modelu mysim. Stymulacja układu odpornościowego myszy za pomocą immunogenu, a następnie ponowna stymulacja tym samym immunogenem sprzyja zapaleniu powierzchni oka, które powoduje zatkanie wydzielania gruczołów Meiboma przez aggNET wytwarzane przez neutrofile i prowadzi do zespołu suchego oka.

Metoda wywoływania stanu zapalnego powierzchni oka w modelu mysim

W tym filmie znieczulony szczur przechodzi zabieg okulistyczny, w którym kulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory pod wpływem pola magnetycznego w celu zablokowania kąta tęczówkowo-rogówkowego. Blokada ta blokuje siatkę beleczkową, uniemożliwiając drenaż cieczy wodnistej i prowadząc do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, uszkadzając komórki zwojowe siatkówki i nerw wzrokowy. W ten sposób rozwija się stan podobny do jaskry.

Eksperymentalna indukcja jaskry przez niedrożność kąta tęczówkowo-rogówkowego w modelu mysim

Źródło: Jiang, X., et al. Indukcja i ocena mysiego modelu eksperymentalnej krótkowzroczności. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia procedurę wywoływania krótkowzroczności u myszy poprzez instalację niestandardowej ramki obiektywu. Rama jest przymocowana do odsłoniętej czaszki za pomocą kleju dentystycznego, a wklęsłe soczewki są wprowadzane, aby przesunąć punkt ogniskowy za siatkówkę. Taka konfiguracja stymuluje wydłużanie gałki ocznej, co prowadzi do krótkowzroczności.

Rozwój krótkowzroczności w modelu mysim poprzez rozogniskowanie wywołane soczewką

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Prezentujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do oka szczura, w celu modelowania jaskry. Prowadzi to do silnego wzrostu ciśnienia i rozległej śmierci neuronów. Protokół ten jest łatwy do wykonania, nie wymaga wielokrotnych wstrzyknięć i zapewnia stabilny, długotrwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Pokazujemy wpływ sieciowania twardówki z ryboflawiną i UVA na osiowo wydłużone oko królika. Wydłużenie osiowe wywołano u 13-dniowych królików nowozelandzkich (samca i samicy) poprzez zszycie ich prawych powiek (tarsorrhaphy).

Sieciowanie twardówki za pomocą ryboflawiny i promieniowania ultrafioletowego-A w celu zapobiegania krótkowzroczności osiowej w modelu królika

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.

Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Poznaj metodę indukcji krótkowzroczności u myszy za pomocą specjalnych okularów montowanych na głowie. Technika umożliwia precyzyjne pomiary refrakcji i długości osiowej oka w badaniach okulistycznych.

Indukcja i ocena mysiego modelu eksperymentalnej krótkowzroczności

Przeglądaj więcej filmów