Name: Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj metodę oznaczania podzbiorów komórek Treg w grasicy, śledzionie i węźle chłonnym trzustki myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej w różnych stanach chorobowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane finansowo przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, EXODIAB, Szwedzką Fundację Diabetologiczną, Szwedzki Fundusz Diabetologiczny dla Dzieci, SEB Diabetesfonden i O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autorzy pragną również podziękować Per-Ola Carlsson i Stellan Sandler za ich wsparcie i dyskusje.

Lokalna komisja etyki zwierząt na Uniwersytecie w Uppsali zatwierdziła eksperymenty na zwierzętach.
1. Pobieranie organów od zwierząt
<ol>
	<li>Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Umieść grasice i śledziony w 20 ml fiolkach scyntylacyjnych lub 15 ml stożkowych probówkach wypełnionych 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Umieść PDLN w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1 ml RPMI 1640. Użyj całej grasicy i śledziony oraz wszystkich PDLNs. 
	nuta: Narządy powinny być trzymane na lodzie przez cały czas trwania zabiegu, a badacz powinien starać się być szybki podczas przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek, zwłaszcza podczas pracy z tkanką grasicy, ponieważ grasicze komórki odpornościowe mogą szybko ulec degradacji w wysokich temperaturach.</li>
</ol>
2. Izolacja pojedynczej komórki z grasicy i śledziony
<ol>
	<li>Dokładnie ściśnij grasicę i śledzionę pęsetą, aby uwolnić komórki odpornościowe. Wyrzuć pozostałą torebkę grasicy i śledziony.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby utworzyć osad. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Aby zlizować czerwone krwinki, należy ponownie zawiesić zawiesinę komórek w 5 ml 0,2 M NH4Cl i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Delikatnie odwracać probówki do góry nogami co 2 minuty. Dodać 5 ml HBSS pod koniec inkubacji, aby zatrzymać lizę.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w około 5 ml HBSS. Napełnij probówki HBSS.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w około 5 ml HBSS. Napełnij probówki HBSS.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml HBSS w przypadku grasicy i 10 ml w przypadku śledziony.</li>
	<li>Przenieść 1 ml zawiesiny komórek grasicy i 500 μl zawiesiny komórek śledziony do 5 ml okrągłodennych probówek z nakrętkami do sitka komórkowego. Nanieść zawiesinę komórek na nasadki sitka do komórek. 
	nuta: W nasadce znajduje się nylonowa siatka o grubości 35 μm. W każdej probówce zebrano około 5-10 milionów komórek.</li>
</ol>
3. Izolacja pojedynczej komórki z PDLN
<ol>
	<li>Umieść sterylną metalową siatkę o grubości 250 μm na stożkowej probówce o pojemności 15 ml w stojaku. Opłucz siatkę 1 ml RPMI.</li>
	<li>Przenieś węzły chłonne na metalową siatkę i przetrzyj je przez siatkę za pomocą pęsety. Nałóż 1 ml RPMI na metalową siatkę, aby spłukać komórki do probówki. Powtórz jeszcze 3 razy i usuń siatkę.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml RPMI. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek do probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nakrętkami do sitka komórkowego. Nanieść zawiesinę komórkową na nasadki sitka do komórek.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Odwirować zawiesiny komórkowe grasicy, PDLN i śledziony w temperaturze 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami powierzchniowymi w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (bufor FACS): 0,75 μg/100 μl przeciwciała CD4 sprzężonego z FITC, 0,60 μg/100 μl przeciwciała CD8 sprzężonego z APC-H7, 0,30 μg/100 μl przeciwciała CD25 sprzężonego z PE, 5 μl (1:20) przeciwciała Nrp1 sprzężonego z APC. Inkubować probówki na lodzie przez 40 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu FACS do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Utrwalić i przepuszczalnie komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 500 μl buforu utrwalającego permeabilizację (PFB). 
	nuta: PFB przygotowuje się przez zmieszanie 1 części koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z 3 częściami rozcieńczalnika utrwalającego/przepuszczalnego.</li>
	<li>Przechowywać probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. 
	nuta: Działa również 1 godzinna inkubacja.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do przemywania permeabilizacji (PWB). Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	nuta: PWB otrzymuje się przez rozcieńczenie buforu permeabilizacyjnego (10x) do 1:10 w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi w 100 μl PWB: 0,30 μg/100 μl przeciwciała Foxp3 sprzężonego z PE-Cy7, 4 μl (1: 25) przeciwciała Helios sprzężonego z PacificBlue. Inkubować probówki na lodzie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 500 μl PWB do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PWB. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Bramkuje pojedyncze komórki na podstawie bocznego obszaru rozproszenia, wysokości i szerokości oraz obszaru rozproszenia do przodu, wysokości i szerokości. Uruchom milion zdarzeń do analizy.</li>
	<li>Eksportuj pliki FCS eksperymentów i analizuj je za pomocą oprogramowania do analizatora cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu wyizolowaliśmy pojedyncze komórki z grasicy, PDLN i śledziony myszy NOD oraz zbadaliśmy ekspresję Helios i Nrp1 w komórkach Treg CD4 + CD8-CD25 + Foxp3 + za pomocą cytometrii przepływowej. W niniejszym badaniu wykorzystano myszy NOD, które są mysim modelem cukrzycy typu 1. W poprzednim badaniu użyliśmy dzikich szczepów myszy CD-1 i C57BL / 6, aby zbadać, czy Helios czy Nrp1 jest lepszym markerem do odróżniania komórek tTreg od komórek pTreg. W tym badaniu zastosow...

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są kluczowe dla homeostazy układu odpornościowego. Komórki Treg są definiowane przez ekspresję antygenów powierzchniowych CD4 i CD25 oraz czynnika transkrypcyjnego widelca P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi i wsp. po raz pierwszy wykazali, że CD25 ulega konstytutywnej ekspresji na komórkach supresorowych T u myszy4, co dostarczyło pionierskiej obserwacji do identyfikacji ludzkich komórek Treg. Limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w tolerancji immunologicznej, wywierając zdolność supresyjną poprzez różne mechanizmy, w tym cytolizę poprzez wydzielanie granzymów w celu wywołania apoptozy, zużycia cytokin i hamowania poprzez ekspresję cytotoksycznego antygenu limfocytów T 45. Dodatkowo mogą wydzielać cytokiny hamujące, takie jak transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), interleukina-10 (IL-10) i IL-355. Komórki Treg mogą naturalnie pochodzić z grasicy, w którym to przypadku są oznaczone jako komórki Treg pochodzące z grasicy (tTreg) lub mogą być indukowane w narządach obwodowych, w takim przypadku nazywane są komórkami Treg indukowanymi obwodowo (pTreg).
Helios, członek rodziny czynników transkrypcyjnych Ikaros, został uznany za marker do odróżniania komórek tTreg od komórek pTreg6. Później dwie inne grupy poinformowały, że Neuropilina 1 (Nrp1), receptor semaforyny III, może służyć jako marker powierzchniowy dla komórek tTreg w pewnych warunkach7,8. Niemniej jednak Singh i in. wykazali, że Helios jest lepszym markerem w tym kontekście u naiwnych myszy9.
Podzbiory komórek Treg odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy układu odpornościowego oraz w ochronie przed autoimmunizacją i infekcjami. Dlatego ważne jest, aby określić liczbę i proporcje tych populacji zarówno w tkankach limfoidalnych, jak i nielimfatycznych. Aby to osiągnąć, należy przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z tych narządów. Szereg protokołów zostało opisanych lub wykorzystanych w poprzednich badaniach. Głównie automatyczne dysocjatory były używane we wcześniej opublikowanych raportach10,11. Korzystanie z automatycznych dysocjatorów jest wygodne i oszczędza czas, ale jest to kosztowna procedura. Dlatego zastosowaliśmy metodę manualną do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z mysich gruczołów grasiczycy, węzłów chłonnych drenujących trzustkę (PDLN) i śledziony od myszy z normoglikemiczną cukrzycą bez otyłości (NOD) i wyizolowaliśmy pojedyncze komórki z tych narządów. Metoda ta została wykorzystana w naszych poprzednich badaniach i stwierdziliśmy, że ręczna metoda przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki jest tak samo skuteczna jak metoda automatycznej dysocjacji9,12,13,14. Ponadto zastosowaliśmy cytometrię przepływową do określenia proporcji komórek Treg CD4 + CD8-CD25 + Foxp3 + oraz podzbiorów komórek Treg tTreg i pTreg. Komórki tTreg i pTreg zostały wyróżnione przy użyciu Helios i Nrp1 jako markerów komórki tTreg. Nasze wyniki wskazują zatem, że ręczna metoda przygotowania pojedynczych komórek działa wydajnie, a przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek mogą być dalej wykorzystywane do badań z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td> NOD <td>Panierka w domu</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnego</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Zawiera koncentrat utrwalający/przepuszczalny, rozcieńczalnik do utrwalania/przepuszczalności i bufor do permeabilizacji (10x)</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia cytometrii przepływowej eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD25 (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Szczur anty-mysie CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało sprzężone z neuropiliną-1 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne FOXP3 (FJK-16s), PE-cyjanina7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue przeciwciało anty-mysie/ludzkie przeciwciało Helios</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem z sitkiem do komórek</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &micro; m Nylonowa siatka jest wbudowana w dwupozycyjną nasadkę zatrzaskową</td></tr><tr><td>Probówka 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe fiolki scyntylacyjne</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów t w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Nasz układ odpornościowy składa się z wielu różnych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T regulatorowych (Treg). Komórki Treg można podzielić na dwa podzbiory, komórki Treg pochodzące z grasicy (tTreg) i komórki Treg indukowane obwodowo (pTreg). Są one obecne w różnych narządach naszego ciała i można je odróżnić za pomocą określonych markerów, takich jak Helios i Neuropilin 1. Doniesiono, że komórki tTreg są funkcjonalnie bardziej supresyjne niż komórki pTreg. Dlatego ważne jest, aby określić proporcję zarówno komórek tTreg, jak i pTreg podczas badania heterogenicznych populacji komórek. W tym miejscu pobraliśmy grasice, węzły chłonne drenujące trzustkę i śledziony od nieotyłych myszy z cukrzycą o normoglikemii, aby odróżnić komórki tTreg od komórek pTreg za pomocą cytometrii przepływowej. Ręcznie przygotowaliśmy zawiesiny pojedynczych komórek z tych narządów. Do barwienia komórek użyto sprzężonych z fluorochromem przeciwciał powierzchniowych CD4, CD8, CD25 i neuropiliny 1. Trzymano je na noc w lodówce. Następnego dnia komórki wybarwiono wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami Foxp3 i Helios sprzężonymi z fluorochromem. Markery te wykorzystano do scharakteryzowania dwóch podzbiorów komórek Treg. Protokół ten przedstawia prosty, ale praktyczny sposób przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony oraz wykorzystania ich do późniejszej analizy cytometrii przepływowej.

Aby zbadać ekspresję Nrp1 i Helios w komórkach tTreg oraz pTreg, przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek z grasicy, węzłów chłonnych drenujących opuszkę (PDLN) oraz śledziony myszy NOD z normoglikemią, które następnie barwiono markerami komórek Treg: CD4, CD25, Foxp3, Helios i Nrp1 w celu analizy cytometrycznej. Wyniki przeanalizowano zgodnie z przedstawionymi reprezentatywnymi strategiami bramkowania (Rysunek 1). Stwierdzono, że w trzech badanych organac...

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Protokół ten pomaga w badaniu roli komórek odpornościowych w poszczególnych narządach w zdrowiu i patologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to technika opłacalna, ponieważ jest to technika ręczna. Procedurę zademonstruje Zhengkang Luo, doktorant z mojego laboratorium.Na początek umieść grasice i śledziony myszy poddanych wcześniej eutanazji w 20 ml fiolkach scyntylacyjnych lub 15 ml stożkowych probówkach wypełnionych 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka. Umieść węzły chłonne drenujące trzustkę w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1 ml RPMI-1640. Upewnij się, że używasz całej grasicy i śledziony oraz wszystkich PDLN.Utrzymuj narządy na lodzie przez cały czas trwania zabiegu. Za pomocą nożyczek dokładnie ściśnij grasicę i śledzionę, aby uwolnić komórki odpornościowe. Pozostałe kapsułki grasicy i śledziony należy wyrzucić.Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 433 g i 4 stopni Celsjusza przez pięć minut, a supernatant wyrzucić. Aby poddać lizie krwinek czerwonych, należy zawiesić zawiesinę komórkową w 5 ml 0,2-molowego chlorku amonu i inkubować w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.Delikatnie odwracaj rurki co dwie minuty. Pod koniec inkubacji dodać 5 ml HBSS, aby zatrzymać lizę. Odwirować probówki w temperaturze 433 razy g i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w około 5 ml HBSS. Następnie napełnij probówki HBSS. Powtórz ten proces, od odwirowania próbek do napełnienia probówki HBSS, jeden raz.Odwirować probówki jeszcze raz w temperaturze 433 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w HBSS. Zaopatrzyć się w probówki okrągłodenne o pojemności 5 ml z nakrętkami z sitkiem do komórek.Przenieść 1 ml zawiesiny komórek grasicy i 500 mikrolitrów zawiesiny komórek śledziony do probówek, nakładając zawiesinę na nasadki sitka do komórek. Najpierw umieść stożkową probówkę o pojemności 15 ml w stojaku. Umieść sterylną metalową siatkę o grubości 250 mikrometrów na probówce.Opłucz siatkę 1 ml RPMI. Następnie przenieś węzły chłonne na metalową siatkę i użyj pęsety, aby zmielić je przez siatkę. Nałóż 1 ml RPMI na siatkę, aby spłukać komórki do probówki.Powtórz ten proces przenoszenia i mielenia węzłów chłonnych trzy razy dla każdej próbki, a następnie usuń siatkę. Odwirować probówki w temperaturze 433 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w około 5 ml RPMI.Następnie napełnij rurki RPMI. Powtórz ten proces, od odwirowania próbek do napełnienia probówki RPMI, jeden raz. Ponownie odwirować probówki w temperaturze 433 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml RPMI. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek do probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml z nakrętkami z sitkiem do komórek. Najpierw odwiruj zawiesinę komórkową z próbek grasicy, śledziony i PDLN w temperaturze 433 g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant. Wybarwić komórki przeciwciałami powierzchniowymi zgodnie z opisem w protokole tekstowym i inkubować probówki na lodzie przez 40 minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS do każdej probówki.Odwirować w temperaturze 433 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a supernatant wyrzucić. Powtórz ten proces, dodając bufor, odwirowując i odrzucając supernatant jeden raz. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu utrwalającego przepuszczalność, aby utrwalić i przepuszczalność komórek.Przełóż probówki do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia odwiruj probówki w temperaturze 433 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu do przemywania przepuszczalności.Ponownie odwirować komórki w temperaturze 433 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Wybarwić komórki przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubuj probówki na lodzie przez 1 godzinę.Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do przemywania przepuszczalności do każdej probówki. Wirować w temperaturze 433 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu do przemywania przepuszczalności.Odwirować jeszcze raz w temperaturze 433 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 mikrolitrach buforu FACS. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tym badaniu pojedyncze komórki są izolowane z grasicy, PDLN i śledziony myszy z normalnym glikemią NOD i są barwione markerami komórek Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios i neuropiliną-1 do analizy cytometrii przepływowej. Wyniki są analizowane i przedstawiane tutaj jako reprezentatywne strategie bramkowania. Uważa się, że odsetek komórek Helios-dodatnich wśród komórek Treg CD4-dodatnich, CD8-ujemnych, CD25-dodatnich, Foxp3-dodatnich jest wyższy niż komórek Nrp1-dodatnich we wszystkich trzech narządach.Obserwuje się, że ponad 80% komórek Treg w grasicy wykazuje ekspresję Helios, która jest wyższa niż w PDLN i śledzionie. Obserwuje się, że odsetek komórek NrP1-dodatnich wśród komórek Treg Helios-dodatnich jest wyższy w PDLN niż w grasicy lub śledzionie. Większość komórek Treg Nrp1-dodatnich również wyraża Helios, a proporcja komórek Helios-dodatnich wśród komórek Treg Nrp1-dodatnich jest wyższa w grasicy i śledzionie niż w PDLN.Łącznie wyniki te wskazują, że Helios jest lepszym markerem do wykrywania limfocytów T Treg niż Nrp1. Węzły chłonne są małe, ale niektóre markery wewnątrzkomórkowe wymagają dużej liczby komórek, aby dać dobry sygnał w cytometrii przepływowej. Po tej procedurze nie można wykonać innych metod, ponieważ komórki są już wybarwione i martwe.Ale cztery markery komórkowe zwierzęcia można zastąpić w celu zbadania innych typów komórek odpornościowych.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Jest to szybka i kompleksowa metoda immunofenotypowania mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) oraz wzbogacania populacji leukocytów Gr-1+ z śledziony mysiej. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową oraz sortowanie komórek AutoMACS w celu wyizolowania żywych leukocytów Gr-1+ przed sortowaniem MDSC metodą FACS do późniejszych analiz in vivo oraz in vitro.

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

W tym filmie opisujemy protokół izolacji pojedynczych komórek z mysich węzłów chłonnych drenujących trzustkę (PDLNs) oraz charakterystykę regulatorowych limfocytów T (Treg) z populacji pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Tregi są identyfikowane na podstawie pozytywnej ekspresji markerów powierzchniowych komórek CD4, CD25 i Nrp1 wraz z jądrowymi czynnikami transkrypcyjnymi Foxp3 i Helios.

Identyfikacja podzbiorów regulatorowych limfocytów T z węzłów chłonnych drenujących mysią trzustkę

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Poznaj metodę oznaczania podzbiorów komórek Treg w grasicy, śledzionie i węźle chłonnym trzustki myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej w różnych stanach chorobowych.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów