Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek
23 marca 2019
Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.
Metoda ta ułatwia powtarzalną sekcję i cięcie pni mózgów gryzoni w celu przechwycenia analizy rdzeniastej sieci oddechowej Mirian. Technika ta oferuje dużą elastyczność eksperymentalną, umożliwiając przygotowanie do nagrania zarówno odblokowania in vitro, jak i plastrów. Metoda ta może być wykorzystana w eksperymentach elektrofizjologicznych w celu zbadania obwodu sterowania neuronalnego, który generuje rytmy oddychania oraz zrozumienia patologii i rozregulowania oddychania u genetycznie zmodyfikowanych gryzoni.
Po wypreparowaniu neuraksji szybko przenieś izolowany tułów zwierzęcia do napowietrzonej komory preparacyjnej pod mikroskopem preparacyjnym i umieść tkankę grzbietową stroną do góry, tak aby koniec rostralny był skierowany do przodu komory. Przypnij tkankę na ramionach i najbardziej ogonowym końcu rdzenia kręgowego i wykonaj nacięcie śródstrzałkowe przez czaszkę po szwie ciemieniowym, aby uniknąć uszkodzenia kory i pnia mózgu pod czaszką. Zaczynając od szwu strzałkowego i pracując bocznie, odetnij szwy potyliczne czaszki, aby utworzyć płaty kości, które mogą zostać odbite i przypięte w celu zakotwiczenia i ustabilizowania rostralnej części czaszki.
Po odbiciu obu płatów czaszki należy wyciąć pozostałą część kory mózgowej, pozostawiając ogonową część móżdżku stosunkowo nienaruszoną, aby wykonać laminektomię grzbietową. Użyj mikro nożyczek sprężynowych i kleszczy, aby usunąć mięśnie otaczające czaszkę i kręgosłup. Usuń tkankę wzdłuż grzbietowej strony klatki piersiowej, pozostawiając żebra nienaruszone i ostrożnie odetnij boczne wyrostki blaszki kręgowej.
Po odcięciu tkanki pokrywającej most i rdzeń, robak, móżdżek, pęczeń i początek rdzenia kręgowego będą wyraźnie widoczne. Aby wykonać laminektomię brzuszną, umieść tkankę grzbietem do dołu i przypnij do klatki piersiowej i najbardziej ogonowego końca kręgosłupa. Użyj płatów czaszki, aby przygwoździć rostralną stronę tkanki i usuń brzuszną połowę klatki piersiowej, w tym mostek i wszystkie narządy jamy brzusznej.
Wypreparuj tkankę miękką przyczepioną do klatki piersiowej, aby odsłonić żebra i rdzeń kręgowy oraz usuń język, przełyk, tchawicę, krtań i wszystkie inne tkanki miękkie i mięśnie pokrywające podstawę czaszki i kręgosłup. Aby zidentyfikować twardą paletę, przeanalizuj tkankę pokrywającą tę prostokątną płytkę kostną u podstawy czaszki, która zawiera wgłębienie w kształcie litery V. Następnie przetnij wzdłuż linii środkowej palety, ostrożnie unosząc tkankę do góry i wykonaj cięcie poprzeczne, aby ją usunąć.
Aby rozpocząć laminektomię brzuszną, usuń blaszkę, odsłaniając brzuszną powierzchnię pnia mózgu i rdzeń kręgowy od pierwszego kręgu szyjnego do około siódmego kręgu piersiowego i odetnij od pięciu do 10 milimetrów wzdłuż obu stron kręgosłupa przy blaszce. Kiedy rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty, odetnij korzonki na około 20 do 25 milimetrów obustronnie, wzdłuż kręgosłupa do około T7 i ostrożnie podnieś krawędź rostralną C1, C2 i C3 za pomocą haczykowatych lub zgiętych kleszczy, aby umożliwić przecięcie pod kością w celu usunięcia trzech kręgów. Gdy pożądana długość rdzenia kręgowego zostanie odizolowana od kręgosłupa, wykonaj cięcie poprzeczne, aby usunąć tkankę rdzenia kręgowego.
Po usunięciu opony twardej umieść pień mózgu na środku platformy parafinowej na plastikowym bloku tnącym i użyj cienkich szpilek do owadów, przyciętych do długości nie większej niż jeden centymetr, aby przypiąć ogonowy koniec pnia mózgu przez dystalny rdzeń kręgowy. Następnie wyrównaj pokryty parafiną blok tnący z przypiętym pniem mózgu w uchwycie bloku wibratonowego, tak aby ostrze cięło prostopadle do powierzchni rostralnej pnia mózgu. Następnie wykonaj początkowy plasterek, aby usunąć od 200 do 300 mikrometrów nierównej tkanki zewnętrznej na najbardziej rostralnym końcu tkanki, dokonując w razie potrzeby niewielkich korekt, aby zapewnić liniowość PARP i małych nacięć, aby usunąć nierówną tkankę.
Korzonki językowo-gardłowe staną się widoczne na bocznej krawędzi pnia mózgu, wytnij od 300 do 500 mikrometrów wycinek pnia mózgu z tych rostralnych markerów neuroanatomicznych, aby uchwycić kompleks pre-Botzingera i związane z nim obwody transmisyjne. Wszystkie etapy procedury krojenia mają kluczowe znaczenie dla stworzenia powtarzalnego, żywotnego wycinka, ze wszystkimi niezbędnymi obwodami neuronalnymi we właściwej orientacji, aby wytworzyć solidny rytm. Wszystkie minimalnie niezbędne elementy obwodu neuronowego do generowania i przekazywania rytmu wdechowego można uchwycić w cienkim plasterku za pomocą tej metody.
W tym kompleks pre-Botzinger, neurony przedruchowe rzutujące do neuronów ruchowych podjęzykowych i korzonków nerwów podjęzykowych. Kompleks pre-Botzingera, korzonki nerwu podjęzykowego lub dwunastego nerwu czaszkowego oraz korzonki nerwowe C4 mogą być następnie wykorzystane do zapisu wdechowego. Kluczowym aspektem tej procedury jest staranna izolacja korzonków i potwierdzenie, że pień mózgu nie jest uszkodzony przed odcięciem ostatniego plasterka.
Zgodnie z tą procedurą, zapisy elektrofizjologii mogą być wykonywane przy użyciu metod patch clamp, nagrań pozakomórkowych lub elektrod ssących w celu rejestrowania aktywności elektrycznej wytwarzanej przez sieć. Wcześniej opublikowane protokoły zawierały niewiele szczegółów krok po kroku, co utrudniało nowym badaczom stosowanie tej metody bez podróżowania do innego laboratorium i spędzania czasu z doświadczonym badaczem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół dotyczący sekcji i krojenia pni mózgowych gryzoni w celu analizy medullarnego układu oddechowego. Metoda ma na celu poprawę powtarzalności w uzyskiwaniu żywych przekrojów nadających się do elektrofizjologicznych rejestracji obwodów nerwowych oddychania, szczególnie w zrozumieniu regulacji oddychania.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Analiza sieci oddechowej
Tło
- W pniu mózgu znajdują się kluczowe neurony odpowiedzialne za oddychanie.
- Poprzednie protokoły nie zawierały szczegółowych wskazówek dotyczących wykonywania metod sekcji i krojenia.
- Ten protokół rozwiązuje problem potrzeby klarowności i powtarzalności w przygotowywaniu przekrojów nerwowych.
Cel badania
- Zapewnienie kompleksowej metodologii przygotowywania przekrojów pnia mózgu.
- Ułatwienie badań nad nerwowym sterowaniem oddychaniem.
- Poprawa zrozumienia patologii oddychania w modelach genetycznych.
Stosowane metody
- Główną platformą są ex vivo preparaty przekrojów mózgu.
- Model biologiczny obejmuje pnie mózgowe gryzoni, koncentrując się na regionach oddechowych.
- Nie wspomniano o przepływach multiomicznych.
- Kluczowe kroki obejmują ostrożne sekcjonowanie, laminiektomię i przygotowanie przekrojów do rejestracji elektrofizjologicznych.
- Zarysowane są szczegółowe procedury krojenia w celu zapewnienia prawidłowej orientacji neuronów i ich funkcjonalności.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na rejestrację istotnych obwodów nerwowych odpowiedzialnych za generowane rytmy oddechowe.
- Udało się izolować i przygotować zespół pre-Bötzingera.
- Rejestracji elektrofizjologicznych udało się uchwycić rytmiczną aktywność nerwową, kluczową dla zrozumienia oddychania.
Wnioski
- To badanie pokazuje efektywną strategię przygotowania przekrojów pnia mózgu, kluczową dla badań oddechowych.
- Ulepszona metodologia wspiera lepszą powtarzalność w rejestracji wyjścia nerwowego.
- Wyniki pozwalają badaczom zbadać mechanizmy neuronowe leżące u podstaw kontroli oddychania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reproducible preparation of rhythmically-active rodent brainstem-spinal cord slices enables high-confidence interrogation of respiratory neural circuits in early discovery. This method supports mechanistic de-risking and target validation for neural pathways underlying respiratory rhythm generation, providing a robust platform for preclinical neuropharmacology and disease modeling. Enhanced reproducibility and transparency in slice preparation facilitate cross-lab standardization and portfolio-wide data comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of neuronal circuits driving inspiratory rhythm.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and interrogating specific neural populations.
- Facilitates hypothesis-driven studies of respiratory control in genetic models.
- Provides a reproducible system for evaluating neural targets implicated in respiratory disorders.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, viable brainstem slices for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes tissue preparation to improve assay reproducibility and quantitative output.
- Enables reliable screening of compounds affecting respiratory neural activity.
- Supports platform reuse for multiple experimental conditions and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro neural activity with disease-relevant respiratory phenotypes in rodent models.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of respiratory targets.
- Enables risk-adjusted advancement of neural circuit-modulating therapeutics.
- Supports translational biomarker development for respiratory function.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from mechanistic studies to lead identification and validation in respiratory neuroscience.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for respiratory rhythm generation.
- Screening: Provides reproducible, assay-ready neural tissue for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative electrophysiological measurements of neural output.
- Translational Research: Bridges in vitro neural activity with in vivo respiratory phenotypes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for cross-program neural circuit studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neural target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neural tissue preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in neuropharmacology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory and neural circuit-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in rodent neuroanatomy and dissection techniques.
- Demands access to electrophysiology instrumentation and precision slicing equipment.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different rodent strains or developmental stages.
- Practical limitations include the learning curve for new researchers and tissue viability constraints.
