Name: Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę preparacji wycinków pnia mózgu gryzoni do elektrofizjologicznych badań sieci oddechowej. Technika umożliwia rejestrację rytmicznej aktywności neuronów kontrolujących oddychanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.B.P jest laureatem letniego stypendium badawczego Uniwersytetu Loma Linda.

<ol><li>Hilaire, G., Duron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+the+Mammalian+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Maturation of the Mammalian Respiratory System.</a> Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).</li>
<li>Pinkerton, K. E., Joad, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Respiratory+System+and+Critical+Windows+of+Exposure+for+Children%27s+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health.</a> Environmental Health Perspectives. 108, 6(2000).</li>
<li>Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+a+brainstem+region+that+may+generate+respiratory+rhythm+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals.</a> Science. 254, 726-729 (1991).</li>
<li>Smith, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+neonatal+and+adult+mammals%3A+the+hybrid+pacemaker-network+model%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model.</a> Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).</li>
<li>Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lesioning+of+the+cat+pre-B%C3%B6tzinger+complex+in+vivo+eliminates+breathing+but+not+gasping%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping.</a> The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).</li>
<li>Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Respiratory+Rhythm+Generation+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+Complex%3A+II.+Populations+of+Coupled+Pacemaker+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Coupling+and+Excitatory+Synaptic+Transmission+between+Rhythmogenic+Respiratory+Neurons+in+the+PreB%C3%B6tzinger+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex.</a> Journal of Neuroscience. 20, 113(2000).</li>
<li>Rousseau, J. -P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+on+Isolated+Brainstem-spinal+Cord+Preparations+from+Newborn+Rodents+Allows+Neural+Respiratory+Network+Output+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53071(2015).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).</li>
<li>Koizumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Imaging%2C+Spatial+Reconstruction%2C+and+Biophysical+Analysis+of+a+Respiratory+Motor+Circuit+Isolated+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).</li>
<li>Danneman, P., Mandrell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Negro, C. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+Calcium+Current-Mediated+Pacemaker+Neurons+and+Respiratory+Rhythm+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation.</a> Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).</li>
<li>Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Kernel+for+Respiratory+Rhythm+Generation+in+a+Novel+Preparation%3A+The+Pre-B%C3%B6tzinger+Complex+%22Island%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island".</a> Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).</li>
<li>Funk, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+respiratory+rhythm+generating+networks+in+neonatal+mice+lacking+NMDAR1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene.</a> Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).</li>
<li>Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunctions+induced+by+prenatal+nicotine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).</li>
<li>Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+induced+functional+inactivation+of+neonatal+respiratory+neurones+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro.</a> NeuroReport. 6, 165-168 (1994).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Sensitivity+to+Neuromodulator-Activated+Signaling+Pathways+at+Physiological+%5BK%2B%5D+of+Confocally+Imaged+Respiratory+Center+Neurons+in+On-Line-Calibrated+Newborn+Rat+Brainstem+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices.</a> Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).</li>
<li>Rybak, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+ponto-medullary+respiratory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the ponto-medullary respiratory network.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex+inspiratory+center+in+calibrated+%27sandwich%27+slices+from+newborn+mice+with+fluorescent+Dbx1+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons.</a> Physiological Reports. 2, (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (1997).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adaptacja przedstawionego tutaj protokołu do przepływu pracy en bloc lub slice jest korzystna dla laboratoriów i badań, które chciałyby wykorzystać preparaty en bloc rdzenia kręgowego pnia mózgu i/lub cienkie plasterki do zapisów elektrofizjologicznych. Przedstawiona metoda preparacji i plasterków, w połączeniu z metodami opisanymi wcześniej przez innych 17,18,19, pozwoli na powtarzalne przygotowanie wytrzymałej i żywotnej tkanki, którą można szeroko dostosować do szeregu eksperymentów z wykorzystaniem tyłomózgowia gryzo...

Sieć neuronowa układu oddechowego pnia mózgu stanowi żyzną dziedzinę do zrozumienia ogólnych cech rytmicznych sieci neuronowych. W szczególności zainteresowanie dotyczy rozwoju oddychania noworodków przez gryzonie i zrozumienia, jak rozwija się rytm oddychania. Można to zrobić przy użyciu podejścia wielopoziomowego, w tym pletyzmografii in vivo całych zwierząt, nagrań nerwów en bloc in vitro oraz nagrań in vitro slice, które zawierają generator rytmu oddechowego. Redukcjonistyczne zapisy in vitro en bloc i slice są korzystną metodą do wykorzystania podczas badania mechanizmów stojących za rytmogenezą oddechową i obwodami neuronalnymi w obszarze pnia mózgu i rdzenia kręgowego rozwijających się gryzoni. Rozwijający się układ oddechowy obejmuje około 40 typów komórek, charakteryzujących się wzorcem zapłonu, w tym komórki centralnego układu oddechowego1,2. Centralna sieć oddechowa obejmuje grupę rytmicznie aktywnych neuronów zlokalizowanych w rdzeniu rostralnym brzuszno-bocznym1,3. Rytmogeneza oddechowa ssaków jest generowana przez autorytmiczną sieć interneuronów nazwaną kompleksem preBötzingera (pBC), która została zlokalizowana eksperymentalnie za pomocą zarówno warstwowych, jak i en bloc preparatów rdzenia mózgowo-rdzeniowego noworodków ssaków3,4,5,6,7,8. Region ten pełni podobną funkcję do węzła zatokowo-przedsionkowego (SA) w sercu i generuje wdechowy system pomiaru czasu do napędzania oddychania. Z pBC rytm wdechowy jest przenoszony do innych obszarów pnia mózgu (w tym do jądra ruchowego podjęzykowego) i rdzeniowych pul motorycznych (takich jak przeponowe neurony ruchowe, które napędzają przeponę)9.
Aktywność rytmiczną można uzyskać za pomocą preparatów en bloc rdzenia kręgowego pnia mózgu lub wycinków z różnych populacji komórek, w tym korzonków nerwowych C3-C5, korzeni nerwowych XII, jądra ruchowego podjęzykowego (XII MN), neuronów przedruchowych podjęzykowych (XII pMN) oraz pBC3,10,11,12. Chociaż te metody gromadzenia danych odniosły sukces w kilku laboratoriach, wiele protokołów nie jest przedstawionych w sposób, który byłby w pełni odtwarzalny dla nowych badaczy wkraczających w tę dziedzinę. Uzyskanie żywotnych i rytmicznie aktywnych preparatów en bloc i plastrów wymaga szczególnej dbałości o szczegóły na wszystkich etapach protokołu rozwarstwiania i krojenia plastrów. Poprzednie protokoły obszernie opisywały różne procedury rejestracji i elektrofizjologii, ale brakowało im szczegółów w najbardziej krytycznej części uzyskania żywej preparatyki tkankowej: wykonaniu sekcji pnia mózgu i rdzenia kręgowego oraz procedury cięcia.
Efektywne uzyskanie rytmicznie aktywnego i zdolnego do wykonywania en bloc lub slice zapisów elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego wymaga, aby wszystkie kroki były wykonywane poprawnie, ostrożnie i szybko (zazwyczaj cała procedura związana tutaj może być wykonana w około 30 minut). Punkty krytyczne protokołu elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego, które nie zostały wcześniej dobrze opisane, obejmują preparację korzonków nerwowych i procedurę krojenia wibratomu. Protokół ten jest pierwszym, który krok po kroku wizualnie komunikuje sekcję pnia mózgu i rdzenia kręgowego zarówno dla nowych badaczy, jak i ekspertów w tej dziedzinie. Protokół ten dokładnie wyjaśnia również techniki chirurgiczne, punkty orientacyjne i inne procedury, aby pomóc przyszłym badaczom w standaryzacji plastrów i preparatów en bloc, aby zawierały dokładnie takie obwody, jakie są pożądane w każdym eksperymencie. Przedstawione tutaj procedury mogą być stosowane zarówno u nowonarodzonych szczeniąt szczurów, jak i myszy.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 i byk; H2O</td><td>Sigma Aldrch</td><td>S9638-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7774-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła Lampa halogenowa 150 W</td><td>AmScope</td><td>H2L50-AY</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>M-60</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 1000 Plus</td><td>Vibratome</td><td>W3 69-0353</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna</td><td>Kanetic</td><td>MB-B-DG6C</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Miecz Klasyczne ostrza o podwójnej krawędzi</td><td>Wilkinson</td><td>97573</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2779</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #10</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel Handel #3</td><td>Narzędzia do nauki o sztuce</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe proste&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz o wąskim wzorze Ząbkowany/prosty</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania; Proste</td><td>nożyczki Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 3" Zakrzywione</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 0</td><td>Narzędzia do nauki pięknej/8840604</td><td>26000-35&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 0, SS</td><td>Narzędzia do nauki</td> o owadach <td>26001-35</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 00</td><td>Narzędzia do nauki o</td> owadach <td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 00, SS</td><td>Narzędzia do nauki</td> o owadach <td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 000</td><td>Narzędzia do</td><td></td> nauki o owadach, 000, <td></td></tr><tr><td>SS</td><td>Narzędzia do nauki o</td> owadach <td>26001-25</td><td></td></tr><tr><td>Minutien szpilki, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minien, 0,15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minimien, 0,2 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue prep Parafin&nbsp;</td><td>fisher</td><td>T56-5</td><td></td></tr><tr><td>Grafitowy&nbsp;</td><td>rybak&nbsp;</td><td>G67-500</td><td></td></tr><tr><td>Tworzywo sztuczne Delrin&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3HMT2</td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge Igła podskórna</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Rytm wdechowy ssaków jest generowany przez sieć neuronalną w obszarze rdzenia zwanym kompleksem preBötzingera (pBC), która wytwarza sygnał napędzający rytmiczne skurcze mięśni wdechowych. Rytmiczna aktywność neuronalna generowana w pBC i przenoszona do innych pul neuronalnych w celu kierowania mięśniami oddechowymi może być badana przy użyciu różnych podejść, w tym nagrań nerwów en bloc i nagrań przekrojów poprzecznych. Jednak wcześniej opublikowane metody nie opisały dokładnie procesu rozwarstwiania pnia mózgu i rdzenia kręgowego w sposób przejrzysty i powtarzalny dla przyszłych badań. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy przegląd metody stosowanej do powtarzalnego wycinania rytmicznie aktywnych wycinków pnia mózgu zawierających niezbędne i wystarczające obwody neuronalne do generowania i przekazywania napędu wdechowego. Praca ta opiera się na wcześniejszych protokołach elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wiarygodnego uzyskania żywotnych i rytmicznie aktywnych warstw do rejestrowania wyjścia neuronalnego z pBC, podjęzykowych neuronów przedruchowych (XII pMN) i podjęzykowych neuronów ruchowych (XII MN). Prezentowana praca rozszerza poprzednio opublikowane metody, dostarczając szczegółowych, krok po kroku ilustracji sekcji, od całego szczeniaka szczura, do wycinka in vitro zawierającego korzonki XII.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu pozwala badaczowi zainteresowanemu uzyskaniem rytmicznie aktywnych skrawków pnia mózgu na powtarzalne i niezawodne wycięcie żywotnego, stabilnego skrawka, który umożliwi rejestrację fikcyjnego sygnału motorycznego przez wiele godzin. Dzięki tej metodzie w cienkim skrawku można zachować wszystkie niezbędne elementy obwodów neuronalnych odpowiedzialnych za generowanie i przesyłanie rytmu inspiracyjnego. Elementy te obejmują: kompleks preBötzinge...

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Metoda ta ułatwia powtarzalną sekcję i cięcie pni mózgów gryzoni w celu przechwycenia analizy rdzeniastej sieci oddechowej Mirian. Technika ta oferuje dużą elastyczność eksperymentalną, umożliwiając przygotowanie do nagrania zarówno odblokowania in vitro, jak i plastrów. Metoda ta może być wykorzystana w eksperymentach elektrofizjologicznych w celu zbadania obwodu sterowania neuronalnego, który generuje rytmy oddychania oraz zrozumienia patologii i rozregulowania oddychania u genetycznie zmodyfikowanych gryzoni.Po wypreparowaniu neuraksji szybko przenieś izolowany tułów zwierzęcia do napowietrzonej komory preparacyjnej pod mikroskopem preparacyjnym i umieść tkankę grzbietową stroną do góry, tak aby koniec rostralny był skierowany do przodu komory. Przypnij tkankę na ramionach i najbardziej ogonowym końcu rdzenia kręgowego i wykonaj nacięcie śródstrzałkowe przez czaszkę po szwie ciemieniowym, aby uniknąć uszkodzenia kory i pnia mózgu pod czaszką. Zaczynając od szwu strzałkowego i pracując bocznie, odetnij szwy potyliczne czaszki, aby utworzyć płaty kości, które mogą zostać odbite i przypięte w celu zakotwiczenia i ustabilizowania rostralnej części czaszki.Po odbiciu obu płatów czaszki należy wyciąć pozostałą część kory mózgowej, pozostawiając ogonową część móżdżku stosunkowo nienaruszoną, aby wykonać laminektomię grzbietową. Użyj mikro nożyczek sprężynowych i kleszczy, aby usunąć mięśnie otaczające czaszkę i kręgosłup. Usuń tkankę wzdłuż grzbietowej strony klatki piersiowej, pozostawiając żebra nienaruszone i ostrożnie odetnij boczne wyrostki blaszki kręgowej.Po odcięciu tkanki pokrywającej most i rdzeń, robak, móżdżek, pęczeń i początek rdzenia kręgowego będą wyraźnie widoczne. Aby wykonać laminektomię brzuszną, umieść tkankę grzbietem do dołu i przypnij do klatki piersiowej i najbardziej ogonowego końca kręgosłupa. Użyj płatów czaszki, aby przygwoździć rostralną stronę tkanki i usuń brzuszną połowę klatki piersiowej, w tym mostek i wszystkie narządy jamy brzusznej.Wypreparuj tkankę miękką przyczepioną do klatki piersiowej, aby odsłonić żebra i rdzeń kręgowy oraz usuń język, przełyk, tchawicę, krtań i wszystkie inne tkanki miękkie i mięśnie pokrywające podstawę czaszki i kręgosłup. Aby zidentyfikować twardą paletę, przeanalizuj tkankę pokrywającą tę prostokątną płytkę kostną u podstawy czaszki, która zawiera wgłębienie w kształcie litery V. Następnie przetnij wzdłuż linii środkowej palety, ostrożnie unosząc tkankę do góry i wykonaj cięcie poprzeczne, aby ją usunąć.Aby rozpocząć laminektomię brzuszną, usuń blaszkę, odsłaniając brzuszną powierzchnię pnia mózgu i rdzeń kręgowy od pierwszego kręgu szyjnego do około siódmego kręgu piersiowego i odetnij od pięciu do 10 milimetrów wzdłuż obu stron kręgosłupa przy blaszce. Kiedy rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty, odetnij korzonki na około 20 do 25 milimetrów obustronnie, wzdłuż kręgosłupa do około T7 i ostrożnie podnieś krawędź rostralną C1, C2 i C3 za pomocą haczykowatych lub zgiętych kleszczy, aby umożliwić przecięcie pod kością w celu usunięcia trzech kręgów. Gdy pożądana długość rdzenia kręgowego zostanie odizolowana od kręgosłupa, wykonaj cięcie poprzeczne, aby usunąć tkankę rdzenia kręgowego.Po usunięciu opony twardej umieść pień mózgu na środku platformy parafinowej na plastikowym bloku tnącym i użyj cienkich szpilek do owadów, przyciętych do długości nie większej niż jeden centymetr, aby przypiąć ogonowy koniec pnia mózgu przez dystalny rdzeń kręgowy. Następnie wyrównaj pokryty parafiną blok tnący z przypiętym pniem mózgu w uchwycie bloku wibratonowego, tak aby ostrze cięło prostopadle do powierzchni rostralnej pnia mózgu. Następnie wykonaj początkowy plasterek, aby usunąć od 200 do 300 mikrometrów nierównej tkanki zewnętrznej na najbardziej rostralnym końcu tkanki, dokonując w razie potrzeby niewielkich korekt, aby zapewnić liniowość PARP i małych nacięć, aby usunąć nierówną tkankę.Korzonki językowo-gardłowe staną się widoczne na bocznej krawędzi pnia mózgu, wytnij od 300 do 500 mikrometrów wycinek pnia mózgu z tych rostralnych markerów neuroanatomicznych, aby uchwycić kompleks pre-Botzingera i związane z nim obwody transmisyjne. Wszystkie etapy procedury krojenia mają kluczowe znaczenie dla stworzenia powtarzalnego, żywotnego wycinka, ze wszystkimi niezbędnymi obwodami neuronalnymi we właściwej orientacji, aby wytworzyć solidny rytm. Wszystkie minimalnie niezbędne elementy obwodu neuronowego do generowania i przekazywania rytmu wdechowego można uchwycić w cienkim plasterku za pomocą tej metody.W tym kompleks pre-Botzinger, neurony przedruchowe rzutujące do neuronów ruchowych podjęzykowych i korzonków nerwów podjęzykowych. Kompleks pre-Botzingera, korzonki nerwu podjęzykowego lub dwunastego nerwu czaszkowego oraz korzonki nerwowe C4 mogą być następnie wykorzystane do zapisu wdechowego. Kluczowym aspektem tej procedury jest staranna izolacja korzonków i potwierdzenie, że pień mózgu nie jest uszkodzony przed odcięciem ostatniego plasterka.Zgodnie z tą procedurą, zapisy elektrofizjologii mogą być wykonywane przy użyciu metod patch clamp, nagrań pozakomórkowych lub elektrod ssących w celu rejestrowania aktywności elektrycznej wytwarzanej przez sieć. Wcześniej opublikowane protokoły zawierały niewiele szczegółów krok po kroku, co utrudniało nowym badaczom stosowanie tej metody bez podróżowania do innego laboratorium i spędzania czasu z doświadczonym badaczem.

preparation-rhythmically-active-vitro-neonatal-rodent-brainstem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Ten film pokazuje nagrania elektrofizjologiczne izolowanych preparatów rdzenia mózgowo-rdzeniowego od nowonarodzonych gryzoni. Preparat umieszcza się w komorze rejestracyjnej, a wyrzuty wdechowe z pnia mózgu rejestruje się w warunkach natlenienia i niedotlenienia za pomocą czwartego korzenia nerwu brzusznego w rdzeniu kręgowym.

Zapisy elektrofizjologiczne preparatów pnia mózgu i rdzenia kręgowego od nowonarodzonego gryzonia

Centralny napęd oddechowy znajduje się w pniu mózgu. Spontaniczny sygnał motoryczny układu oddechowego z izolowanego rdzenia kręgowego pnia mózgu jest rejestrowany poprzez umieszczenie elektrody na czwartym korzeniu brzusznym. To eksperymentalne podejście jest cenne dla badań farmakologicznych lub oceny wyzwań oddechowych i manipulacji genetycznych dotyczących rytmicznych zachowań motorycznych.

Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Poznaj metodę preparacji wycinków pnia mózgu gryzoni do elektrofizjologicznych badań sieci oddechowej. Technika umożliwia rejestrację rytmicznej aktywności neuronów kontrolujących oddychanie.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Przeglądaj więcej filmów