Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Celem tego protokołu wideo jest ustanowienie źródłowego i skutecznego protokołu izolacji i hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy embrionalnej. Cześć, nazywam się Maryam Sadeghi-Zadeh. Jestem studentką studiów magisterskich na kierunku Biologia Komórkowa i Molekularna w Royan Institute.

Dzisiaj ja i mój kolega chcemy pokazać, jak pobrać nerwowe komórki macierzyste z 13 eminencji zwojowej zarodka myszy. Cześć, nazywam się Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Jestem studentką studiów magisterskich na kierunku Biologia Komórkowa i Molekularna na Wydziale Komórek Macierzystych Royan Institute for Biotechnology.

Cześć, nazywam się Reza Dehghani-Varnamkhasti. Studiuję również biologię komórkową i molekularną w Royan Institute. Zabiegi chirurgiczne obejmują pobranie każdych 13 zarodków myszy z macicy.

Przecięcie przedniej części ciemiączka zarodka za pomocą wygiętej końcówki igły w celu wyjęcia mózgu z czaszki. Mikropreparacja izolowanego mózgu w celu pobrania wyniosłości zwojowej. Dysocjacja pobranej tkanki w pożywce dla nerwowych komórek macierzystych w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

I wreszcie, posiewanie komórek w kulturze zawiesinowej w celu wytworzenia komórek nerwowych. Oczyść i zdezynfekuj skórę brzucha, spryskując ją 70% etanolem. Kontroluj skórę w górę brzucha, a następnie przetnij skórę i podkreśl twarz nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy.

Usuń nożyczkami rogi macicy zawierające zarodki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml zimnego buforu MEM HEPES. Umieść stożkową rurkę pod okapem z przepływem laminalnym. Otwórz korek pod maską.

Wyjmij rogi macicy z probówki i spłucz trzy razy wystarczającą ilością świeżego zimnego buforu HEPES MEM, aby usunąć zanieczyszczenia i krew. Przenieść tkankę macicy na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą od 7 do 10 ml zimnego buforu HEPES MEM. Otwórz rogi macicy za pomocą cienkich nożyczek i przenieś zarodki do nowego naczynia zawierającego od 7 do 10 ml zimnego buforu HEPES MEM.

Teraz umieść 10-centymetrową szalkę z zarodkami pod mikroskopem preparacyjnym w celu przeprowadzenia operacji mikrosekcji. Zegnij końcówkę igły strzykawki, naciskając jej końcówkę na stalowy uchwyt ostrza skalpela. Zegnij końcówkę igły, aż końcówka zostanie zgięta pod kątem od 70 do 90 stopni.

Sprawdź końcówkę igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby zobaczyć zagięcie na końcu igły. Oczywiście zarodki mają w tym pozycję boczną. Nie zmieniając ich położenia, przytrzymywały szyję i ciało zarodka cienkimi kleszczami, a następnie wbiły zgiętą część igły głęboko w przód ciemiączka głowy zarodka.

Wystąpiłoby tam niewielkie krwawienie lub skrzep krwi. Przesuń końcówkę igły powierzchownie, podczas gdy zgięta część znajduje się wewnątrz wybrzuszenia w kierunku czoła, a następnie w kierunku tyłu głowy. Upewnij się, że przecinasz skórę i czaszkę, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem mózgu.

Popchnij skórę końcówką igły na boki, aby odsłonić mózg. Wbić igłę od bocznej strony skóry do spodu ramy od bocznej strony skóry do obszaru pod mózgiem. A następnie usuń mózg z tej skóry głowy, popychając go tak, aby wyszedł z wypreparowanej czaszki.

Wyniosłość zwojowa jest wyraźnie pokazana na wideo z jej przyśrodkowymi i bocznymi częściami. Trzymał mózg stabilnie za pomocą kleszczy pielęgnacyjnych, a następnie za pomocą mikronożyczek przecinał korę każdej półkuli, aby odsłonić wyniosłość zwojową. Trzymał mózg i umieszczał wypreparowaną wyniosłość zwojową w 15 ml probówce wirówkowej zawierającej pożywkę z nerwowych komórek macierzystych.

Powtarzaj tę procedurę, aż cały mózg zostanie poddany mikrosekcji. Przeciąć wypreparowaną wyniosłość zwojową, przykładając końcówkę pipety do dna probówki i pipetując zawiesinę w górę iw dół przez 2 5 razy, aby rozbić tkankę i uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Odwirować zawiesinę o stężeniu 110 g przez 5 minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml probówki 0,05% w EDTA. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. A następnie dodaj równoważną objętość inhibitora trypsyny sojowej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.

Pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie dezaktywowana. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 110 g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki dla nerwowych komórek macierzystych i policzyć liczbę komórek.

Umieścić komórki na pożywce nerwowych komórek macierzystych w kolbie do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości. Przenieść 5 ml 2T25, 20 ml do T75 i 40 ml do kolb T175. Neurosfery pojawią się po 3 dniach hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2.

Aby zassać kulturę neurosfer, przenieś pożywkę z zawieszonymi neurosferami do wirówki, aby wirować przy 110 g przez 5 minut, a następnie odrzuć supernatant. W 1 ml 0,05% trypsyny EDTA i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dezaktywuj trypsynę za pomocą inhibitora tyrpsyny sojowej i delikatnie pipetuj neurosfery w górę iw dół, aby stały się pojedynczymi komórkami.

Odwirować zawiesinę komórkową o masie 110 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi. Komórki te są gotowe do następnego etapu hodowli lub hodowli na laminacie i w pełni pokrytej powierzchni do zaawansowanych eksperymentów.

Hodując milion pierwotnych nerwowych komórek macierzystych po siedmiu dniach, liczba komórek wzrośnie do trzech do czterech milionów. Po sześciu do siedmiu dniach kulki powinny mieć średnicę od 150 do 200 mikrometrów i będą gotowe do hodowli na laminowanych szalkach pokrytych poliornityną w przypadku braku bFGF i EGF do różnicowania neuronów. Wyniki testu cytometrii przepływowej pokazują, że blisko 95% komórek tworzących neurosfery było Nestin dodatnich, które są znanym markerem nerwowych komórek macierzystych.

Testy z użyciem beta tubuliny III i przeciwciał przeciwko białkom włóknistym zwojów ujawniają, że poprzez hodowlę nerwowych komórek macierzystych na powlekanej powierzchni około 94% wykazuje fenotyp neuronalny, a około 5% fenotyp glejowy. W tym krótkim filmie technika laboratoryjna do szybkiej izolacji nerwowych komórek macierzystych z 13 wyniosłości zwojowej zarodka myszy. Mam nadzieję, że odniesiesz sukces w hodowli nerwowych komórek macierzystych.