Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Protokół ten upraszcza i wyjaśnia metody wdrażania syntezy samore-białek przez osoby niebędące ekspertami. Lepszy dostęp do tych metod pomoże w demarketyzacji platformy i szerokiego zestawu aplikacji, które umożliwia. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość, opłacalność i łatwość konfiguracji reakcji w porównaniu z innymi platformami do samodzielnej syntezy białek.

Nasza platforma może umożliwić szereg zastosowań, w tym genomikę funkcjonalną, testy hydrauliczne, bioczujniki, zestawy edukacyjne, a przy niewielkich modyfikacjach inżynierię metaboliczną i ekspansję kodu genetycznego. Chociaż technika ta wymaga jedynie podstawowego szkolenia laboratoryjnego, nowi użytkownicy powinni zaplanować zapoznanie się z technikami takimi jak sonikacja w celu pomyślnego wykonania protokołu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie pożywki i hodowle komórek E. coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Umieść litrową butelkę wirówkową w lodowatej łaźni wodnej. Gdy kultury OD600 osiągną 3,0, wlej kulturę komórkową do schłodzonej butelki. Używając wagi z podwójną wiązką, dodaj wodę do drugiej litrowej butelki wirówki, aż będzie ważyć tyle samo co pierwsza, aby utworzyć równowagę dla wirówki.

Po wstępnym schłodzeniu wirówki do czterech stopni Celsjusza, odwirować butelki w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby komórki były granulowane. Następnie powoli odlej i wyrzuć supernatant. Umieść osad komórkowy na lodzie.

Za pomocą sterylnej szpatułki zeskrob granulki komórek z butelki wirówki i przenieś je do zimnej, stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 30 mililitrów zimnego buforu S30 uzupełnionego dwoma milimolowymi DTT i ponownie zawieś granulkę przez wirowanie w krótkich seriach z okresami odpoczynku na lodzie, aż granulka zostanie całkowicie ponownie zawieszona bez kawałków. Następnie użyj kolejnej 50-milimetrowej stożkowej rurki wypełnionej wodą jako wagi, aby odwirować próbkę w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Odlać i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulat z 20 do 25 mililitrami zimnego bufora S30. Wirować w temperaturze 5 000 g i w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Wylać i usunąć sklarowany osad. Następnie dodaj 30 mililitrów buforu S30 i ponownie zawieś osad za pomocą wiru, jak opisano wcześniej. Ustaw trzy wstępnie zważone, zimne, stożkowe rurki o pojemności 50 mililitrów.

Używając serologicznego napełniacza pipet sterylną pipetą, wlej dziesięć 10 mililitrów zawiesiny osadów do każdej probówki. W razie potrzeby odwirować wszystkie probówki przy użyciu odpowiednich wag w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie wylać i usunąć supernatanty.

Ostrożnie wytrzyj wnętrze każdej probówki i nakrętki czystą chusteczką, aby usunąć bufor dostępu, upewniając się, że nie dotykasz granulki. Za pomocą wagi analitycznej ponownie zważyć probówki i podać końcową masę granulek dla każdej probówki. Na początek dodaj jeden mililitr zimnego buforu S30 z 2 milimolowymi DTT na jeden gram masy komórkowej do każdej granulki.

Użyj wiru, aby ponownie zawiesić granulki, jak opisano wcześniej. Następnie przenieś 1,4 mililitra każdego zawieszonego granulatu do oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek do mikrowirówek. Umieść jedną probówkę w lodowatej kąpieli wodnej w zlewce i ustaw sondę soniku tak, aby nie dotykała dna ani boków rurki.

Poddaj sonifikację rurki o amplitudzie ustawionej na 50% przez 45 sekund, po czym następuje 59 sekund odpoczynku. Upewnij się, że lampy są zamykane i odwracane w okresach wyłączenia. Natychmiast po zakończeniu sonikacji dodać 4,5 mikrolitra jednego molowego DTT do lizatu.

Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać, a następnie umieść ją na lodzie. Powtórz ten proces, sonikując i dodając DTT dla każdej probówki z ponownie zawieszonymi komórkami. Odwirować próbki w temperaturze 18 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie odpipetuj każdy supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, pozostawiając trochę supernatantu, aby upewnić się, że osad nie zostanie naruszony. Przenieść probówki z supernatantem na platformę wytrząsającą inkubatora i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 60 minut. To jest reakcja odpływowa.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć każdy supernatant bez naruszania osadu, przenosząc go do nowych probówek. Utwórz wiele 100 mikrolitrowych podwielokrotności ekstraktu do przechowywania.

Najpierw rozmrozić roztwór A, roztwór B, matrycę DNA, ekstrakt BL21DE3, polimerazę RNA T7 i podwielokrotność wody molekularnej na lodzie. Następnie oznacz niezbędną ilość probówek mikrowirówkowych potrzebnych do reakcji CFPS. Wymieszaj każdy odczynnik przez pipetowanie lub wirowanie, a następnie dodaj roztwór do znakowanej probówki reakcyjnej, upewniając się, że ekstrakt komórkowy nie jest wirowany, ale zamiast tego odwróć probówkę do wymieszania.

Upewnij się, że końcowa reakcja jest dobrze wymieszana i połącz w pojedynczą kulkę o pojemności 15 mikrolitrów na dnie każdej probówki. Inkubuj każdą reakcję bez wstrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Na początek należy uzyskać 96-dołkową płytkę i załadować 48 mikrolitrów 0,05 molowego HEPES-a o pH 8 do każdej studzienki potrzebnej do oceny ilościowej.

Następnie wyjmij probówki reakcyjne z inkubatora. Wymieszać każdą reakcję, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść dwa mikrolitry każdej reakcji do studzienek zawierających HEPES. Wymieszaj każdą studzienkę, pipetując w górę i w dół.

Po załadowaniu i wymieszaniu wszystkich reakcji załaduj płytkę do fluorometru i zmierz fluorescencyjne punkty końcowe SFGFP przy użyciu długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 510 nanometrów. Użyj wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej, aby określić stężenie superfolderowanej GFP na podstawie uzyskanego odczytu fluorescencji. W tym badaniu badany jest preparat ekstraktu z E. coli na bazie sonikacji.

Granulki komórkowe i ekstrakt komórkowy są stabilne w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej rok. Dodatkowo ekstrakt komórkowy może przejść co najmniej pięć cykli zamrażania i rozmrażania bez znacznej utraty wydajności. Niektóre kroki w ramach tego protokołu można zmieniać bez szkody dla ogólnej wydajności systemu.

Przede wszystkim komórki mogą być zbierane w zakresie gęstości optycznej od 2,7 do 4,0 przy 600 nanometrach bez znaczącego wpływu na wydajność ekstraktu komórkowego. Jednak jakość matrycowego DNA jest źródłem zmienności między partiami, która wpływa na wolumetryczną wydajność reakcji CFPS. Rozwiązuje się to poprzez oczyszczanie DNA za pomocą Midi lub Maxiprep, a następnie dodatkowy etap oczyszczania DNA.

Naczynie reakcyjne wpływa również na wydajność objętościową reakcji CFPS. Wzrost stosunku powierzchni do objętości skutkuje wyższymi plonami objętościowymi. W celu zoptymalizowania wydajności objętościowej reakcji CFPS i zmniejszenia zmienności ekstraktu komórkowego między partiami, należy przeprowadzić miareczkowanie magnezu dla każdego nowego preparatu ekstraktu.

W przypadku ekstraktów komórkowych składających się z 30 miligramów na mililitr białka całkowitego, optymalne stężenie magnezu i objętość ekstraktu w celu zminimalizowania zużycia odczynnika i maksymalizacji wydajności objętościowej wynosi odpowiednio 10 milimolów i pięć mikrolitrów. Różnicując skalę reakcji, użytkownicy mogą stosować różne metody, od wysokoprzepustowych badań przesiewowych po ekspresję białka docelowego na większą skalę. Technika ta ma dwie kluczowe zalety: po pierwsze, szybciej przesiewa produkty białkowe, a po drugie, syntetyzuje białka trudne do ekspresji.

Przykładem mogą być białka, które są cytotoksyczne lub wymagają warunków utleniania do swojej funkcji. Podobnie jak w przypadku każdej procedury laboratoryjnej, ze wszystkimi odczynnikami należy obchodzić się z ostrożnością. Dodatkowo, wirówki powinny być zawsze wyważone, a podczas sonikacji należy stosować ochronę słuchu.