Name: Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj bezkomórkową syntezę białek z użyciem ekstraktów Escherichia coli. Ta metoda umożliwia szybkie, tanie i dostępne reakcje in vitro dla badań funkcjonalnych genomiki oraz edukacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Jennifer VanderKelen, Andrei Laubscher i Tony'emu Turretto za wsparcie techniczne, Wesleyowi Kao, Layne'owi Williamsowi i Christopherowi Hightowi za pomocne dyskusje. Autorzy potwierdzają również wsparcie finansowe ze strony Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly, and Creative Activities Grant Program (RSCA 2017) oraz National Science Foundation (NSF-1708919). MZL dziękuje za stypendium dla absolwentów Uniwersytetu Stanowego Kalifornii. MCJ dziękuje Army Research Office W911NF-16-1-0372, National Science Foundation przyznaje granty MCB-1413563 i MCB-1716766, grant Centrum Doskonałości Laboratorium Badawczego Sił Powietrznych FA8650-15-2-5518, grant Agencji ds. Redukcji Zagrożeń Obronnych HDTRA1-15-10052/P00001, Fundację Davida i Lucile Packardów, program Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program, grant BER Departamentu Energii DE-SC0018249, program naukowy Human Frontiers (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant oraz Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds z Chicago Community Trust za wsparcie.

1. Przygotowanie podłoża i wzrost komórek
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Komórki E. coli BL21*(DE3) należy rozsiać po wyrobisku glicerolu na płytce agarowej LB i inkubować przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki LB i sterylizować roztwór w autoklawie w cyklu ciekłym przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Przygotować 750 ml 2x pożywki YTP i 250 ml 0,4 M roztworu D-glukozy zgodnie z opisem w informacjach uzupełniających.</li>
		<li>Wlać 2x pożywkę YTP do autoklawowanej kolby z przegrodami o pojemności 2,5 l, a roztwór D-glukozy do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 ml. Oba roztwory należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 30 minut w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Upewnij się, że oba sterylne roztwory są przechowywane w temperaturze 37 °C, jeśli wzrost komórek jest wykonywany następnego dnia, aby zmaksymalizować tempo wzrostu po inokulacji. Nie łączyć roztworów do momentu zaszczepienia. 
		UWAGA: W razie potrzeby roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni, chociaż media 2x YTP są bardzo podatne na zanieczyszczenie.</li>
		<li>Rozpocznij nocną hodowlę BL21(DE3) poprzez zaszczepienie 50 ml pożywki LB pojedynczą kolonią BL21(DE3) przy użyciu wysterylizowanej pętli i sterylnej techniki, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Umieść 50 ml kultury BL21*(DE3) LB w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C i 250 obr./min i hoduj przez noc przez 15-18 godzin.</li>
		<li>Przygotuj i wysterylizuj wszystkie materiały wymagane w dniach 3 i 4, w tym: dwie butelki wirówki o pojemności 1 l, 4 zimne probówki stożkowe o pojemności 50 ml (zważ i zapisz masę trzech) oraz wiele probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Usunąć 50 ml nocnej kultury BL21*(DE3) w LB z inkubatora do wytrząsania i zmierzyć OD600 na spektrofotometrze, używając rozcieńczenia 1:10 z pożywką LB. Obliczyć objętość hodowli nocnej niezbędną do dodania do 1 l pożywki dla wyjściowego OD600 0,1 (na przykład, jeśli OD600 o rozcieńczeniu 1:10 jest odczytywany jako 0,4, zaszczepić 25 ml nierozcieńczonego OD600 = 4,0 kultury przez noc do 1 l 2x YTPG).</li>
		<li>Usunąć podgrzane 2x pożywki YTP i roztwory D-glukozy z inkubatora w temperaturze 37 °C wraz z 50 ml kultury LB. Stosując sterylną technikę, ostrożnie wlej roztwór D-glukozy do pożywki 2x YTP (omijając boki przegrody kolby). 
		UWAGA: Dodatek D-Glucose uzupełnia przepis na 1 L 2x YTPG.</li>
		<li>Zachowując sterylną technikę, zaszczepić 1 l 2x roztworu YTPG odpowiednią ilością 50 ml kultury, aby rozpocząć hodowlę 1 l przy 0,1 OD600. Natychmiast umieścić zaszczepioną 1 l kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min.</li>
		<li>Wykonaj pierwszy odczyt OD600 po pierwszej godzinie wzrostu (faza opóźnienia trwa zwykle 1 godzinę). Nie rozcieńczaj kultury. Kontynuuj wykonywanie pomiarów OD600 mniej więcej co 20-30 minut, aż OD600 osiągnie 0,6.</li>
		<li>Po osiągnięciu OD600 = 0,6 dodaj 1 ml 1M IPTG (końcowe stężenie w 1 l kultury = 1 mM) do 2x kultury YTPG. 
		UWAGA: Idealna indukcja OD600 wynosi 0,6; Dopuszczalny jest jednak zakres 0,6-0,8. Indukcja przez IPTG służy do endogennego wytwarzania polimerazy RNA T7 (T7RNAP).</li>
		<li>Po indukcji mierz OD600 mniej więcej co 20-30 minut, aż osiągnie 3.0. 
		UWAGA: W tym czasie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Przygotować zimny bufor S30 zgodnie z opisem w informacjach uzupełniających. Jeśli bufor S30 jest przygotowany wcześniej, upewnij się, że naziemna telewizja cyfrowa nie została dodana do dnia użycia.</li>
		<li>Gdy OD600 osiągnie 3,0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), wlej kulturę do zimnej 1 litrowej butelki wirówkowej w lodowatej kąpieli wodnej. Przygotuj wypełnioną wodą butelkę wirówkową o pojemności 1 l o równej wadze, która będzie używana jako waga w wirówce. 
		UWAGA: Wartości absorbancji różnią się w zależności od instrumentu. Chociaż OD600 zbioru BL21(DE3) nie jest zmienną wrażliwą, zaleca się, aby użytkownik ocenił i zoptymalizował tę zmienną jako środek rozwiązywania problemów. Większe spektrofotometry mogą skutkować stosunkowo niższymi odczytami OD600 w porównaniu z mniejszymi spektrofotometrami kuwetowymi.</li>
		<li>Odwirować butelki o pojemności 1 l przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 10 °C do komórek granulek.</li>
		<li>Powoli odlewać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Umieść granulkę na lodzie.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej szpatułki zeskrob osad komórek z butelki wirówki i przenieś go do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dodać 30 ml zimnego buforu S30 do stożkowej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wirowanie z krótkimi seriami (20 - 30 s) i okresami odpoczynku (1 min) na lodzie, aż do całkowitego zawieszenia bez kawałków.</li>
		<li>Po całkowitym zawieszeniu osadu należy użyć kolejnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z wodą jako równowagi i wirować przez 10 minut przy 5000 x g i temperaturze 10 °C (wstępnie schłodzonej do 4 °C). 
		UWAGA: Na tym kończy się 1z 3 prań wymaganych podczas zbierania komórek.</li>
		<li>Wylać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Zawiesić osad w 20-25 ml zimnego buforu S30 i odwirować przez 10 minut przy 5000 x g i 10 °C (wstępnie schłodzony do 4 °C). 
		UWAGA: Na tym kończy się 2z 3 prań.</li>
		<li>Ponownie wylej supernatant i zutylizuj go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych instytucji. Dodać dokładnie 30 ml buforu S30 i ponownie odwirować, aby ponownie zawiesić osad.</li>
		<li>Używając 3 wstępnie zważonych, zimnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i serologicznego napełniacza pipet sterylną pipetą, podwielokrotność 10 ml zawieszonej mieszaniny peletów/buforu S30 do każdej z 3 stożkowych probówek. 
		UWAGA: Dzielenie komórek na 3 probówki nie jest wymagane, ale ten krok skutkuje mniejszymi granulkami komórek (~ 1 g) dla większej wygody w późniejszych krokach.</li>
		<li>Odwirować wszystkie probówki, używając odpowiednich wag w razie potrzeby, przez 10 minut w temperaturze 5000 x g i 10 °C (wstępnie schłodzone do 4 °C). 
		UWAGA: Na tym kończy się ostatni etap prania.</li>
		<li>Wylać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Usunąć nadmiar buforu S30, ostrożnie wycierając wnętrze stożkowej rurki i nakrętki czystą chusteczką; Unikaj dotykania granulki.</li>
		<li>Ponownie zważyć probówki na wadze analitycznej i zapisać końcową masę granulek na każdej probówce. 
		UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Granulki można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku, aż będą potrzebne do przygotowania ekstraktu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego - Dzień 4
<ol>
	<li>Do przygotowania ekstraktu utrzymuj komórki w chłodzie na lodzie podczas każdego etapu. Dodać 1 ml zimnego buforu S30 na 1 g masy komórkowej osadu. Upewnij się, że ditiotreitol (DTT) został uzupełniony do buforu S30 do końcowego stężenia 2 mM. 
	UWAGA: W tym czasie schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wirowanie z krótkimi seriami (20 - 30 s) i okresami odpoczynku (1 min) na lodzie, aż do całkowitego zawieszenia. Jeśli ponowne zawieszenie jest trudne, pozostaw granulki na lodzie na 30 minut do rozmrożenia.</li>
	<li>Przenieś 1,4 ml zawieszonych komórek do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieścić jedną probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 1,4 ml zawieszonych komórek w lodowatej łaźni wodnej w zlewce. Sonikacja przez 45 sekund, a następnie 59 s przerwy przez łącznie 3 cykle, z amplitudą ustawioną na 50%. Zamknij i odwróć probówki, aby delikatnie wymieszać w okresach wyłączenia. W sumie dostarcz 800-900 J energii do każdej 1,5 ml probówki do mikrofuge zawierającej 1,4 ml zawieszonych komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A i 3B). 
	UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na używany typ i model sonikatora i powinien być zoptymalizowany, jeśli sprzęt jest inny niż wymieniony dla tej procedury. Dwa uzupełniające się podejścia mogą być użyte do zwiększenia ilości ekstraktu przygotowanego na tym etapie: 1) wiele probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml może być sonikowanych równolegle, i/lub 2) większe objętości mogą być sonikowane w probówkach stożkowych (do 15 ml resuspension komórek na probówkę), skalując ilość dostarczanej energii zgodnie z wcześniejszym opisem 29, 45.</li>
	<li>Natychmiast po zakończeniu sonikacji dodaj 4,5 μl 1 M DTT (uzupełniając dodatkowe 2 mM DTT) do 1,4 ml lizatu i kilkakrotnie odwróć w celu wymieszania. Umieść rurkę na lodzie. Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszelkich dodatkowych probówek z zawieszonymi komórkami przed przystąpieniem do wirowania.</li>
	<li>Próbki z mikrowirówki w temperaturze 18 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
	<li>Odpipetować supernatant do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Nie przeszkadzaj pelletowi; Lepiej jest pozostawić trochę supernatantu, aby utrzymać czystość, niż rozbijać osad w celu maksymalizacji plonów.</li>
	<li>Inkubować supernatant z poprzedniego etapu przy prędkości obrotowej 250 obr./min i temperaturze 37 °C przez 60 minut, przyklejając probówki do platformy wytrząsającej inkubatora (jest to reakcja odpływu).</li>
	<li>Próbki z mikrowirówki o masie 10 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu i przenieść go do nowej probówki. Utwórz wiele 100 μl porcji ekstraktu do przechowywania. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a ekstrakt można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku, aż będzie potrzebny do reakcji CFPS. Co najmniej 5 cykli zamrażania i rozmrażania można przejść bez szkody dla wydajności ekstrakcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>
3. Bezkomórkowa synteza białek Reakcje w formacie wsadowym
<ol>
	<li>Rozmrozić roztwory A i B, matryca DNA, ekstrakt BL21(DE3) (jeśli jest zamrożony), T7RNAP i podwielokrotność wody o jakości cząsteczkowej. 
	UWAGA: Wzór reakcji CFPS można znaleźć w informacjach uzupełniających. Receptury roztworów A i B są podane w Informacjach Uzupełniających i odpowiadają specyficznym stężeniom dla wielu odczynników wspierających system energetyczny oparty na PANOx-SP dla CFPS. Rola każdego odczynnika i dopuszczalne różnice w tych stężeniach odczynników, które mogą wspierać CFPS, zostały określone50. Protokół oczyszczania T7RNAP można znaleźć w Informacjach Uzupełniających51. Uzupełniający T7RNAP może zwiększyć wydajność objętościową, ale nie jest konieczny, jeśli T7RNAP jest indukowany podczas wzrostu komórek. Matrycę plazmidowego DNA (pJL1-sfGFP) można przygotować za pomocą zestawu maxiprep z dwoma płukaniami przy użyciu buforu płuczącego w zestawie, a następnie oczyszczaniem DNA po przetworzeniu za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (<silna klasa = "xfig">Figura 2B). Liniowe matryce DNA mogą być również stosowane w reakcjach CFPS.</li>
	<li>Oznacz niezbędną ilość probówek do mikrofuge potrzebnych do reakcji CFPS. 
	UWAGA: Reakcje mogą być przeprowadzane w naczyniach o różnych rozmiarach, ale mniejsze naczynie może zmniejszyć objętościową wydajność białka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Zwiększenie skali reakcji w naczyniu tej samej wielkości może również zmniejszyć wydajność objętościową w funkcji zmniejszenia wymiany tlenu z powodu zmniejszenia stosunku powierzchni do objętości. Przy zwiększaniu objętości reakcji powyżej 100 μl zaleca się stosowanie płytek studzienkowych z płaskim dnem 31,37,52.</li>
	<li>Dodać 2,2 μl roztworu A, 2,1 μl roztworu B, 5 μl ekstraktu BL21*(DE3), 0,24 μg T7RNAP (16 μg/ml stężenie końcowe), 0,24 ng matrycy DNA (stężenie końcowe 16 ng/μl) i wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 15 μL. 
	UWAGA: Roztwory wirowe A i B należy często stosować podczas ustawiania reakcji, aby uniknąć sedymentacji składników i zapewnić, że każda reakcja otrzymuje jednorodną porcję każdego roztworu. Unikaj wirowania ekstraktu, zamiast tego odwróć probówkę, aby wymieszać.</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich odczynników do reakcji, wymieszaj każdą probówkę, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując, upewniając się, że końcowa mieszanina reakcyjna jest połączona w pojedynczą kulkę o pojemności 15 μl na dnie probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieścić każdą reakcję w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez wstrząsania przez 4 godziny lub w temperaturze 30 °C przez noc. 
	UWAGA: Udane reakcje można ocenić jakościowo wizualnie na podstawie zielonego koloru produktu sfGFP w mieszaninie reakcyjnej CFPS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Ekspresję interesującego białka można również potwierdzić za pomocą SDS-PAGE (rysunek uzupełniający 2).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja białka reporterowego, [sfGFP]
<ol>
	<li>Załadować 48 μl 0,05 M HEPES, pH 8 do każdego dołka potrzebnego do oznaczania ilościowego (zwykle wykonywanego w trzech egzemplarzach na probówkę reakcyjną).</li>
	<li>Usunąć reakcje z inkubatora. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać każdą reakcję, a następnie przenieść 2 μl reakcji do 48 μl 0,05 M HEPES, pH 8. Ponownie pipetować w górę iw dół do dołka, aby wymieszać.</li>
	<li>Po załadowaniu i wymieszaniu wszystkich reakcji umieść 96-dołkową płytkę we fluorometrze i zmierz fluorescencję punktu końcowego sfGFP. 
	UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji dla kwantyfikacji fluorescencji sfGFP wynoszą odpowiednio 485 nm i 510 nm.</li>
	<li>Korzystając z wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej, wyznacz [sfGFP] na podstawie uzyskanych odczytów fluorescencji. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące generowania wzorcowej krzywej stężenia sfGFP w funkcji intensywności fluorescencji znajdują się w informacjach uzupełniających (rysunek uzupełniający 3). Użytkownicy będą musieli ustalić standardową krzywą dla swojego instrumentu, ponieważ czułość instrumentu może się różnić.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Bezkomórkowa synteza białek stała się potężną i umożliwiającą wykorzystanie jej w wielu zastosowaniach, od bioprodukcji po szybkie prototypowanie układów biochemicznych. Szeroki zakres zastosowań jest wspierany przez możliwość monitorowania, manipulowania i rozszerzania maszyn komórkowych w czasie rzeczywistym. Pomimo rosnącego wpływu tej technologii platformy, szeroka adaptacja pozostaje powolna ze względu na niuanse techniczne w implementacji metod. Dzięki tym wysiłkom staramy się zapewnić prostotę i przejrzystość wdra...

Synteza białek bez komórek (CFPS) pojawiła się jako technologia, która w ciągu ostatnich 50 lat otworzyła szereg nowych możliwości w zakresie produkcji białek, genomiki funkcjonalnej, inżynierii metabolicznej i nie tylko1,2. W porównaniu ze standardowymi platformami ekspresji białek in vivo, CFPS zapewnia trzy kluczowe zalety: 1) bezkomórkowy charakter platformy umożliwia produkcję białek, które byłyby potencjalnie toksyczne lub obce dla komórki3,4,5,6; 2) inaktywacja genomowego DNA i wprowadzenie matrycowego DNA kodującego gen(-y) będący przedmiotem zainteresowania (genów) kierujący całą energię ogólnoustrojową w reakcji na produkcję białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania; oraz 3) Otwarty charakter platformy umożliwia użytkownikowi modyfikowanie i monitorowanie warunków reakcji i składu w czasie rzeczywistym7,8. Ten bezpośredni dostęp do reakcji wspiera rozszerzanie systemów biologicznych o rozszerzoną chemię i warunki redoks w celu produkcji nowych białek i dostrajania procesów metabolicznych2,9,10. Bezpośredni dostęp pozwala również użytkownikowi na połączenie reakcji CFPS z testami aktywności w systemie jednogarnkowym w celu szybszego zaprojektowania, budowy i testowania11. Zdolność do przeprowadzania reakcji CFPS w małych kropelkach lub na urządzeniach papierowych dodatkowo wspiera wysiłki badawcze o wysokiej przepustowości i szybkie prototypowanie12,13,14,15,16. W wyniku tych zalet oraz charakteru systemu typu plug and play, CFPS w unikalny sposób umożliwił różnorodne zastosowania biotechnologiczne, takie jak produkcja białek, które są trudne do rozpuszczalnej ekspresji in vivo17,18,19,20, wykrywanie choroby21,22,23, na żądanie biomanufacturing18,24,25,26,27, and education28,29, z których wszystkie pokazują elastyczność i użyteczność platformy bezkomórkowej.
Systemy CFPS mogą być generowane z różnych surowych lizatów zarówno z prokariotycznych, jak i eukariotycznych linii komórkowych. Pozwala to na różnorodne opcje w systemie wyboru, z których każda ma zalety i wady w zależności od interesującego nas zastosowania. Systemy CFPS różnią się również znacznie pod względem czasu przygotowania, kosztów i wydajności. Najczęściej stosowane ekstrakty komórkowe są produkowane z kiełków pszenicy, retikulocytów królika, komórek owadów i komórek Escherichia coli, przy czym te ostatnie są jak dotąd najbardziej opłacalne, a jednocześnie dają najwyższe objętościowe plony białka30. Podczas gdy inne systemy CFPS mogą być korzystne ze względu na ich wrodzoną maszynerię modyfikacji potranslacyjnej, nowe aplikacje wykorzystujące maszynerię opartą na E. coli są w stanie wypełnić lukę, generując na żądanie specyficznie fosforylowane i glikozylowane białka31,32,33,34,35.
Reakcje CFPS mogą być przeprowadzane zarówno w formacie wsadowym, bezkomórkowym (CECF) lub bezkomórkowym (CFCF) o ciągłym przepływie. Format wsadowy jest układem zamkniętym, którego czas reakcji jest ograniczony ze względu na zmniejszające się ilości reagentów i akumulację hamujących produktów ubocznych reakcji. Metody CECF i CFCF wydłużają czas trwania reakcji, a tym samym skutkują zwiększoną objętościową wydajnością białka w porównaniu z reakcją okresową. Osiąga się to poprzez umożliwienie usunięcia produktów ubocznych syntezy białek z naczynia reakcyjnego, podczas gdy nowe reagenty są dostarczane przez cały przebieg reakcji2. W przypadku CFCF białko będące przedmiotem zainteresowania może być również usunięte z komory reakcyjnej, podczas gdy w przypadku CECF białko będące przedmiotem zainteresowania pozostaje w komorze reakcyjnej składającej się z półprzepuszczalnej membrany36,37. Metody te są szczególnie cenne w przezwyciężaniu słabych wydajności objętościowych trudnych do ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania38,39,40,41,42,43. Wyzwania związane z wdrażaniem podejść CECF i CFCF polegają na tym, że: 1) chociaż skutkują one bardziej efektywnym wykorzystaniem biomaszynerii odpowiedzialnej za transkrypcję i translację, wymagają znacznie większych ilości odczynników, co zwiększa całkowity koszt, oraz 2) wymagają bardziej złożonych konfiguracji reakcji i specjalistycznego sprzętu w porównaniu z formatem partii44. W celu zapewnienia dostępności dla nowych użytkowników, opisane w niniejszym dokumencie protokoły koncentrują się na formacie serii przy objętościach reakcji 15 μl ze szczegółowymi zaleceniami dotyczącymi zwiększenia objętości reakcji do skali mililitrowej.
Metody przedstawione tutaj umożliwiają osobom niebędącym ekspertami z podstawowymi umiejętnościami laboratoryjnymi (takim jak studenci studiów licencjackich) wdrożenie wzrostu komórek, przygotowania ekstraktu i konfiguracji reakcji w formacie wsadowym dla systemu CFPS opartego na E. coli. Takie podejście jest opłacalne w porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami bez poświęcania łatwości konfiguracji reakcji opartej na zestawie. Co więcej, takie podejście umożliwia zastosowania w laboratorium i w terenie. Decydując się na wdrożenie CFPS, nowi użytkownicy powinni dokładnie ocenić skuteczność konwencjonalnych systemów ekspresji białek dla inwestycji w start-upy, ponieważ CFPS może nie być lepszy w każdym przypadku. Opisane tutaj metody CFPS umożliwiają użytkownikowi bezpośrednie wdrażanie różnorodnych zastosowań, w tym genomiki funkcjonalnej, testów wysokoprzepustowych, produkcji białek, które są trudne do ekspresji in vivo, a także zastosowań terenowych, w tym biosensorów i zestawów edukacyjnych do biologii syntetycznej. Dodatkowe zastosowania, takie jak inżynieria metaboliczna, dostrajanie warunków ekspresji białek, wykrywanie chorób i zwiększanie skali przy użyciu metod CECF lub CFCF, są nadal możliwe, ale mogą wymagać doświadczenia z platformą CFPS w celu dalszej modyfikacji warunków reakcji. Nasze metody łączą wzrost w wzbogaconych pożywkach i kolbach z przegrodami, ze stosunkowo szybkimi i powtarzalnymi metodami lizy komórek poprzez sonikację, a następnie uproszczoną konfigurację reakcji CFPS, która wykorzystuje zoptymalizowane premiksy45. Chociaż metody wzrostu komórek stały się nieco ustandaryzowane w tej dziedzinie, metody lizy komórek różnią się znacznie. Oprócz sonikacji, powszechne metody lizy obejmują wykorzystanie prasy francuskiej, homogenizatora, ubijaków perełkowych lub lizozymu oraz innych biochemicznych i fizycznych metod rozbijania46,47,48,49. Za pomocą naszych metod uzyskuje się około 2 ml surowego ekstraktu komórkowego na 1 l komórek. Ta ilość ekstraktu komórkowego może wspierać czterysta reakcji CFPS po 15 μl, z których każda wytwarza ~ 900 μg / ml białka reporterowego sfGFP z plazmidu matrycowego pJL1-sfGFP. Ta metoda kosztuje 0,021 USD/μg wytworzonego sfGFP (0,019 USD/μL reakcji), z wyłączeniem kosztów pracy i sprzętu (rysunek uzupełniający 1). Zaczynając od zera, metoda ta może być wdrożona w ciągu 4 dni przez jedną osobę, a powtarzające się reakcje CFPS mogą być zakończone w ciągu kilku godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dodatkowo objętość protokołu można zwiększyć w celu uzyskania większych partii przygotowania odczynnika w celu dostosowania go do potrzeb użytkownika. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół może być wdrażany przez osoby niebędące ekspertami przeszkolonymi w laboratorium, takie jak studenci studiów licencjackich, ponieważ wymaga on jedynie podstawowych umiejętności laboratoryjnych. Opisane poniżej procedury oraz towarzyszący im film wideo zostały specjalnie opracowane w celu poprawy dostępności platformy CFPS E. coli do szerokiego zastosowania.

<table><tbody><tr><td>Bulion Luria</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt</td> drożdżowy <td>Bioodczynniki Fisher</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60353-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Kwas szczawiowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>MP Biomedicals</td><td>02180595.1</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Woda molekularna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Histadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Probówki do mikrowirówek: 2,0 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania plazmidu PureLink HiPure</td><td>Procesor</td><td></td> ultradźwiękowy ThermoFisher K210007 <td></td></tr><tr><td></td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50Hz</td><td>Sonda o średnicy 3,175 mm</td></tr><tr><td>Avanti J-E Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman Coredter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>1L Rurka wirówkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L z przegrodą Shake Flask</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik Innova 42/42R Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja 5</td> Zestaw startowy <td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin XT IBA</td><td></td><td>2-4998-000</td><td></td></tr><tr><td>pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa synteza białek na bazie escherichia coli: protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

W ciągu ostatnich 50 lat, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) stała się potężną technologią pozwalającą wykorzystać zdolność transkrypcyjną i translacyjną komórek w probówce. Eliminując potrzebę utrzymania żywotności komórki i eliminując barierę komórkową, CFPS ma fundamentalne znaczenie dla nowych zastosowań w bioprodukcji tradycyjnie trudnych białek, a także zastosowań w szybkim prototypowaniu inżynierii metabolicznej i genomiki funkcjonalnej. Nasze metody wdrażania platformy CFPS opartej na E. coli umożliwiają nowym użytkownikom dostęp do wielu z tych aplikacji. W tym miejscu opisujemy metody przygotowania ekstraktu przy użyciu wzbogaconych pożywek, kolb z przegrodami oraz powtarzalnej metody lizy komórek opartej na przestrajalnej sonikacji. Ekstrakt ten może być następnie wykorzystany do ekspresji białek zdolnych do wytworzenia 900 μg/ml lub więcej super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP) w ciągu zaledwie 5 godzin od konfiguracji eksperymentalnej do analizy danych, pod warunkiem, że wcześniej przygotowano odpowiednie zapasy odczynników. Szacowany koszt początkowy uzyskania odczynników wynosi 4,500 USD, które pozwolą na utrzymanie tysięcy reakcji przy szacunkowym koszcie 0,021 USD za μg wyprodukowanego białka lub 0,019 USD za μl reakcji. Ponadto metody ekspresji białek odzwierciedlają łatwość konfiguracji reakcji obserwowaną w dostępnych na rynku systemach dzięki optymalizacji wstępnych mieszanek odczynników, przy ułamku kosztów. Aby umożliwić użytkownikowi wykorzystanie elastycznego charakteru platformy CFPS do szerokich zastosowań, zidentyfikowaliśmy różne aspekty platformy, które można dostroić i zoptymalizować w zależności od dostępnych zasobów i pożądanych wyników ekspresji białek.

Przedstawiliśmy protokół przygotowania ekstraktu z E. coli oparty na sonikacji, który można zrealizować w ciągu czterech dni, a Rycina 1 obrazuje podział czynności na poszczególne dni. Kroki możliwe do wykonania każdego dnia są elastyczne i dopuszczają różne punkty przerwania pracy, jednak stwierdziliśmy, że ten schemat postępowania jest najskuteczniejszy w realizacji. Dodatkowo, zarówno osady komórkowe (krok 1.3.18), jak i w pełni przygotowany ekstr...

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Protokół ten upraszcza i wyjaśnia metody wdrażania syntezy samore-białek przez osoby niebędące ekspertami. Lepszy dostęp do tych metod pomoże w demarketyzacji platformy i szerokiego zestawu aplikacji, które umożliwia. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość, opłacalność i łatwość konfiguracji reakcji w porównaniu z innymi platformami do samodzielnej syntezy białek.Nasza platforma może umożliwić szereg zastosowań, w tym genomikę funkcjonalną, testy hydrauliczne, bioczujniki, zestawy edukacyjne, a przy niewielkich modyfikacjach inżynierię metaboliczną i ekspansję kodu genetycznego. Chociaż technika ta wymaga jedynie podstawowego szkolenia laboratoryjnego, nowi użytkownicy powinni zaplanować zapoznanie się z technikami takimi jak sonikacja w celu pomyślnego wykonania protokołu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie pożywki i hodowle komórek E. coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Umieść litrową butelkę wirówkową w lodowatej łaźni wodnej. Gdy kultury OD600 osiągną 3,0, wlej kulturę komórkową do schłodzonej butelki. Używając wagi z podwójną wiązką, dodaj wodę do drugiej litrowej butelki wirówki, aż będzie ważyć tyle samo co pierwsza, aby utworzyć równowagę dla wirówki.Po wstępnym schłodzeniu wirówki do czterech stopni Celsjusza, odwirować butelki w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby komórki były granulowane. Następnie powoli odlej i wyrzuć supernatant. Umieść osad komórkowy na lodzie.Za pomocą sterylnej szpatułki zeskrob granulki komórek z butelki wirówki i przenieś je do zimnej, stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 30 mililitrów zimnego buforu S30 uzupełnionego dwoma milimolowymi DTT i ponownie zawieś granulkę przez wirowanie w krótkich seriach z okresami odpoczynku na lodzie, aż granulka zostanie całkowicie ponownie zawieszona bez kawałków. Następnie użyj kolejnej 50-milimetrowej stożkowej rurki wypełnionej wodą jako wagi, aby odwirować próbkę w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.Odlać i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulat z 20 do 25 mililitrami zimnego bufora S30. Wirować w temperaturze 5 000 g i w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.Wylać i usunąć sklarowany osad. Następnie dodaj 30 mililitrów buforu S30 i ponownie zawieś osad za pomocą wiru, jak opisano wcześniej. Ustaw trzy wstępnie zważone, zimne, stożkowe rurki o pojemności 50 mililitrów.Używając serologicznego napełniacza pipet sterylną pipetą, wlej dziesięć 10 mililitrów zawiesiny osadów do każdej probówki. W razie potrzeby odwirować wszystkie probówki przy użyciu odpowiednich wag w temperaturze 5 000 g i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie wylać i usunąć supernatanty.Ostrożnie wytrzyj wnętrze każdej probówki i nakrętki czystą chusteczką, aby usunąć bufor dostępu, upewniając się, że nie dotykasz granulki. Za pomocą wagi analitycznej ponownie zważyć probówki i podać końcową masę granulek dla każdej probówki. Na początek dodaj jeden mililitr zimnego buforu S30 z 2 milimolowymi DTT na jeden gram masy komórkowej do każdej granulki.Użyj wiru, aby ponownie zawiesić granulki, jak opisano wcześniej. Następnie przenieś 1,4 mililitra każdego zawieszonego granulatu do oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek do mikrowirówek. Umieść jedną probówkę w lodowatej kąpieli wodnej w zlewce i ustaw sondę soniku tak, aby nie dotykała dna ani boków rurki.Poddaj sonifikację rurki o amplitudzie ustawionej na 50% przez 45 sekund, po czym następuje 59 sekund odpoczynku. Upewnij się, że lampy są zamykane i odwracane w okresach wyłączenia. Natychmiast po zakończeniu sonikacji dodać 4,5 mikrolitra jednego molowego DTT do lizatu.Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać, a następnie umieść ją na lodzie. Powtórz ten proces, sonikując i dodając DTT dla każdej probówki z ponownie zawieszonymi komórkami. Odwirować próbki w temperaturze 18 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie odpipetuj każdy supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, pozostawiając trochę supernatantu, aby upewnić się, że osad nie zostanie naruszony. Przenieść probówki z supernatantem na platformę wytrząsającą inkubatora i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 60 minut. To jest reakcja odpływowa.Następnie odwirować próbki w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć każdy supernatant bez naruszania osadu, przenosząc go do nowych probówek. Utwórz wiele 100 mikrolitrowych podwielokrotności ekstraktu do przechowywania.Najpierw rozmrozić roztwór A, roztwór B, matrycę DNA, ekstrakt BL21DE3, polimerazę RNA T7 i podwielokrotność wody molekularnej na lodzie. Następnie oznacz niezbędną ilość probówek mikrowirówkowych potrzebnych do reakcji CFPS. Wymieszaj każdy odczynnik przez pipetowanie lub wirowanie, a następnie dodaj roztwór do znakowanej probówki reakcyjnej, upewniając się, że ekstrakt komórkowy nie jest wirowany, ale zamiast tego odwróć probówkę do wymieszania.Upewnij się, że końcowa reakcja jest dobrze wymieszana i połącz w pojedynczą kulkę o pojemności 15 mikrolitrów na dnie każdej probówki. Inkubuj każdą reakcję bez wstrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Na początek należy uzyskać 96-dołkową płytkę i załadować 48 mikrolitrów 0,05 molowego HEPES-a o pH 8 do każdej studzienki potrzebnej do oceny ilościowej.Następnie wyjmij probówki reakcyjne z inkubatora. Wymieszać każdą reakcję, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść dwa mikrolitry każdej reakcji do studzienek zawierających HEPES. Wymieszaj każdą studzienkę, pipetując w górę i w dół.Po załadowaniu i wymieszaniu wszystkich reakcji załaduj płytkę do fluorometru i zmierz fluorescencyjne punkty końcowe SFGFP przy użyciu długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 510 nanometrów. Użyj wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej, aby określić stężenie superfolderowanej GFP na podstawie uzyskanego odczytu fluorescencji. W tym badaniu badany jest preparat ekstraktu z E. coli na bazie sonikacji.Granulki komórkowe i ekstrakt komórkowy są stabilne w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej rok. Dodatkowo ekstrakt komórkowy może przejść co najmniej pięć cykli zamrażania i rozmrażania bez znacznej utraty wydajności. Niektóre kroki w ramach tego protokołu można zmieniać bez szkody dla ogólnej wydajności systemu.Przede wszystkim komórki mogą być zbierane w zakresie gęstości optycznej od 2,7 do 4,0 przy 600 nanometrach bez znaczącego wpływu na wydajność ekstraktu komórkowego. Jednak jakość matrycowego DNA jest źródłem zmienności między partiami, która wpływa na wolumetryczną wydajność reakcji CFPS. Rozwiązuje się to poprzez oczyszczanie DNA za pomocą Midi lub Maxiprep, a następnie dodatkowy etap oczyszczania DNA.Naczynie reakcyjne wpływa również na wydajność objętościową reakcji CFPS. Wzrost stosunku powierzchni do objętości skutkuje wyższymi plonami objętościowymi. W celu zoptymalizowania wydajności objętościowej reakcji CFPS i zmniejszenia zmienności ekstraktu komórkowego między partiami, należy przeprowadzić miareczkowanie magnezu dla każdego nowego preparatu ekstraktu.W przypadku ekstraktów komórkowych składających się z 30 miligramów na mililitr białka całkowitego, optymalne stężenie magnezu i objętość ekstraktu w celu zminimalizowania zużycia odczynnika i maksymalizacji wydajności objętościowej wynosi odpowiednio 10 milimolów i pięć mikrolitrów. Różnicując skalę reakcji, użytkownicy mogą stosować różne metody, od wysokoprzepustowych badań przesiewowych po ekspresję białka docelowego na większą skalę. Technika ta ma dwie kluczowe zalety: po pierwsze, szybciej przesiewa produkty białkowe, a po drugie, syntetyzuje białka trudne do ekspresji.Przykładem mogą być białka, które są cytotoksyczne lub wymagają warunków utleniania do swojej funkcji. Podobnie jak w przypadku każdej procedury laboratoryjnej, ze wszystkimi odczynnikami należy obchodzić się z ostrożnością. Dodatkowo, wirówki powinny być zawsze wyważone, a podczas sonikacji należy stosować ochronę słuchu.

escherichia-coli-based-cell-free-protein-synthesis-protocols-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj bezkomórkową syntezę białek z użyciem ekstraktów Escherichia coli. Ta metoda umożliwia szybkie, tanie i dostępne reakcje in vitro dla badań funkcjonalnych genomiki oraz edukacji.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Przeglądaj więcej filmów