Name: Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę pomiaru wypływu cholesterolu z makrofagów przy użyciu fluorescencyjnego analogu NBD-cholesterolu. Technika ta umożliwia bezpieczną i efektywną ocenę ryzyka sercowo-naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo wsparta przez granty badawcze FIS (PS12/00866) z Instituto de Salud Carlos III, Madryt, Hiszpania; Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) oraz CERCA Programme / Generalitat de Catalunya. Autorzy dziękują Laboratorium Retrowirusologii i Immunopatologii Wirusów Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Dziękujemy T. Escribà, C. Rovirze i C. Hurtado za ich pomoc oraz S. Cufí z Biura Transferu Wiedzy i Technologii za wskazówki w zakresie ochrony wynalazku.

Na potrzeby niniejszego badania uzyskano zgodę komisji etycznej (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; numer zatwierdzenia HCB/2014/0756) oraz pisemną, świadomą zgodę od wszystkich uczestników.
1. Przygotowanie NBD-cholesterolu
<ol>
	<li>Rozpuścić NBD-cholesterol (MW 494,63; patrz Tabela materiałów) w czystym etanolu w celu otrzymania roztworu zapasowego (2 mM). W przypadku fiolki o zawartości 10 mg, należy rozpuścić całą zawartość fiolki w 10,1 ml etanolu, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 2 mM.</li>
	<li>Rozcieńczyć NBD-cholesterol z roztworu zapasowego w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 5% penicyliny/streptomycyny (pożywka R10), aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 5 μM (np., pobrać 10 ml NBD-cholesterolu o stężeniu 5 μM stężenie końcowe) poprzez rozcieńczenie 25 μL stoku NBD-cholesterolu (2 mM) w podłożu R10. Objętość ta jest wystarczająca dla płytki 96-dołkowej.</li>
</ol>
2. Hodowla i wysiew komórek (Dzień-2)
<ol>
	<li>Hodować komórki THP-1 w medium R10 w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Co 3 dni dostosowywać zagęszczenie do 0,3 x 106 komórek/mL.</li>
	<li>Wysiać komórki na białą płytkę 96-dołkową z płaskim, przezroczystym dnem w zagęszczeniu 0,2 x 106 komórek/dołek w medium R10 (100 μL na dołek).</li>
	<li>Traktować komórki 100 nM forbolem 12-mirystynianem 13-octanem (PMA; ze stoku 10 μM) przez 48–72 h, inkubując w 37 °C, 5% CO2 w celu zróżnicowania komórek THP-1 do dmTHP-1. 
	UWAGA: Zaleca się użycie 5 μL stoku PMA (10 μM) w 500 μL medium R10. Przed tym przygotować stok PMA 10 μM poprzez rozpuszczenie liofilizowanej fiolki 1 g w 10 mL dimetylosulfotlenku (DMSO), podzielić na alykwoaty i przechowywać w -20 °C.</li>
	<li>Alternatywnie (sugestia) połączyć kroki 2.2 i 2.3 w celu lepszej homogenizacji. Przygotować 10 mL zawiesiny komórek THP-1 w probówce 15 mL, dodać 200 μL stoku PMA (10 μM), delikatnie wymieszać i natychmiast wysiać po 100 μL na dołek na płytkę. Inkubować komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3.</li>
</ol>
3. Przygotowanie surowicy pozbawionej apolipoproteiny B (ABDS) (dzień 2 lub 3)
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór glikolu polietylenowego (PEG), należy rozcieńczyć glicynę w 10% PBS (z jałową H2O) do stężenia 200 mM przy pH 7,4. Do 10 g PEG 8000 dodać 40 mL 200 mM glicyny, aby uzyskać 20% (w/v) PEG. Roztwór energicznie wymieszać do homogenizacji.</li>
	<li>Do każdej próbki surowicy/osocza w probówce 1,5 mL dodać 4 części 20% PEG na 10 części surowicy/osocza i pozostawić mieszaninę w lodzie na 25 min17 (np. do 100 μL osocza lub surowicy dodać 40 μL 20% roztworu PEG).</li>
	<li>Osad PEG-apolipoproteiny B wirować przy 13 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osad odrzucić. Nadstaw odnieść do nowej probówki. 
	UWAGA: Sugerujemy przygotowanie ABDS w dniu 3 (na świeżo). Jeśli nie jest to możliwe, należy przygotować ABDS w dniu 2 i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
4. Obciążanie komórek NBD-cholesterolem (Dzień 2)
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek dmTHP-1 i przemyć komórki dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).</li>
	<li>Obciążyć komórki 5 μM NBD-cholesterolem (100 μL na dołek) w pożywce R10 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>
5. Inkubacja z akceptorami cholesterolu (Dzień 3)
<ol>
	<li>Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki z 2–5% ABDS lub pożądanym stężeniem oczyszczonego akceptora lipidów (HDL, ApoA, ApoE itp.) rozcieńczonego w bezbarwnym medium RPMI 1640 (100 μL na dołek) przez 4–6 h w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Należy uwzględnić kontrolę negatywną (C-) składającą się z bezbarwnego medium RPMI 1640 bez akceptorów oraz kontrolę pozytywną (C+) (np. ABDS z puli zdrowych dawców lub oczyszczone HDL). Należy pamiętać, że kontrola pozytywna jest szczególnie istotna podczas analizy próbek pacjentów (w stanach chorobowych) (Supplementary Figure 1).</li>
	<li>Przygotować 200 mL roztworu stokowego lizy komórkowej 1 (bufor Tris 50 mM, NaCl 150 mM, H2O). Pomieszać roztwór lizy komórkowej 1 z czystym etanolem w stosunku 1:1 (v:v), aby otrzymać roztwór lizy 2.</li>
</ol>
6. Rejestracja sygnału fluorescencyjnego (Dzień 3)
<ol>
	<li>Wykrywanie NBD-cholesterolu w pożywce
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę komórkową z płytek i zebrać ją do nowej białej płytki 96-dołkowej z nieprzezroczystym płaskim dnem.</li>
		<li>Aby uzyskać optymalny sygnał fluorescencji w próbkach pożywki, dodać 100 μL czystego etanolu do 100 μL każdej próbki pożywki, aby uzyskać stosunek 1:1 w białej płytce 96-dołkowej.</li>
		<li>Przechowywać płytkę z przetworzoną pożywką w celu dalszego pomiaru intensywności fluorescencji (FI) przy długości fali 463⁄536 nm (wzbudzenie/emisja) w luminometrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie NBD-cholesterolu wewnątrzkomórkowego
	<ol>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS.</li>
		<li>Aby uzyskać cholesterol wewnątrzkomórkowy, zlizować komórki poprzez inkubację z 100 μL roztworu lizującego 2 na dołek i wstrząsać płytką w temperaturze pokojowej (RT) przez 25 min.</li>
		<li>Aby uzyskać optymalny sygnał fluorescencji w próbkach lizatu komórkowego, zmierzyć intensywność fluorescencji lizatów komórkowych w tej samej białej płytce 96-dołkowej z przeźroczystym płaskim dnem (tej samej płytce, w której wysiano komórki w kroku 2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>6.3 Zmierzyć intensywność fluorescencji (FI) w luminometrze, ustawiając parametr czułości na 50 w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
7. Analiza wyników
<ol>
	<li>Oblicz tempo odpływu cholesterolu z próbki jako wartość procentową zgodnie z wzorem: 
	<img alt="Wzór na CE próbki dla analizy fluorescencyjnej; metoda obliczania stosunku dla badań komórkowych." src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Wyznacz końcową wartość odpływu cholesterolu (CE), odejmując wartość CE kontroli negatywnej (próbka obciążona NBD-cholesterolem, ale inkubowana w bezbarwnym medium RPMI 1640, bez akceptorów cholesterolu) od wartości CE danej próbki: 
	<img alt="Wzór na CE; CE = CE próbki − CE kontroli negatywnej; równanie; metoda analizy danych." src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
<li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li>
<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że są twórcami zgłoszenia patentowego (EPO; 18382337.6-1118; 17 maja 2018 r.) zatytułowanego "Metoda oznaczania wypływu cholesterolu" opartego na tej metodzie.

Cholesterol znakowany fluorescencyjnie jest obiecującą strategią analizy i badania właściwości i metabolizmu naturalnego cholesterolu in vitro. Jego główne zalety polegają na tym, że może być pobierany przez komórki, pozwala na badania dystrybucji wewnątrzkomórkowej i błonowej oraz może być stosowany do testów wypływu cholesterolu, takich jak w tym protokole (ryc. 7). Niektóre sterole znakowane fluorescencyjnie umożliwiają śledzenie cholesterolu in vitro, w tym cholesterolu BODIPY, cholester...

Według Światowej Organizacji Zdrowia, obecnie głównymi przyczynami zgonów na całym świecie są choroba niedokrwienna serca i udar mózgu (łącznie 15,2 miliona zgonów)1. Obie są chorobami sercowo-naczyniowymi (CVD), które mogą być poprzedzone miażdżycą i pęknięciem blaszek miażdżycowych w naczyniach krwionośnych2,3.
Miażdżyca to choroba zapalna ściany naczyń krwionośnych, w której makrofagi, limfocyty T, komórki tuczne i komórki dendrytyczne infiltrują śródbłonek i gromadzą się z krwi, ostatecznie tworząc blaszki miażdżycowe. Blaszki miażdżycowe prezentują rdzeń lipidowy i kryształy cholesterolu, o czym świadczą pomiary ultrasonograficzne w trybie B o wysokiej rozdzielczości grubości błony wewnętrznej błony środkowej tętnicy szyjnej4,5. W makrofagach wypływ cholesterolu w kierunku cząstek akceptora lipidów odbywa się za pomocą receptorów kasety wiążącej ATP (ABC) ABCA1, podrodziny kasety wiążącej ATP członka 1 (ABCG1) i receptora zmiatacza SR-BI. Brak równowagi między napływem i odpływem cholesterolu w makrofagach jest uważany za kluczowy proces w inicjacji miażdżycy6. Wypływ cholesterolu jest uważany za kluczowy etap eliminacji cholesterolu z tkanki obwodowej do osocza i wątroby w procesie zwanym odwrotnym transportem cholesterolu (RCT). Cholesterol jest przenoszony z makrofagów głównie do apolipoproteiny A1 (ApoA1) znajdującej się na powierzchni cząsteczek lipoprotein o dużej gęstości (HDL). Następnie HDL transportują cholesterol do wątroby w celu wydalenia i ponownego wykorzystania7,8,9.
Tradycyjnie, cholesterol znakowany radioaktywnie trytem (3H) był używany w wypływie cholesterolu10. Sygnał emisyjny izotopów promieniotwórczych jest bardzo czuły10; Jednak cholesterol znakowany radioaktywnie stwarza oczywiste utrudnienia, takie jak długie protokoły, ryzyko narażenia na promieniowanie jonizujące oraz potrzeba specjalnych urządzeń i sprzętu radioaktywnego w celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z emisją radioaktywną. Wręcz przeciwnie, fluorescencja została z powodzeniem włączona do technik diagnostycznych ze względu na jej prostotę w wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych, szeroką gamę dostępnych fluoroforów i bezpieczeństwo11. Do badania metabolizmu cholesterolu użyto kilku znakowanych fluorescencyjnie steroli, w tym dehydroergosterolu (z wewnętrzną fluorescencją), cholesterolu dansylu, cholesterolu 4,4-difluoro-3a,4adiaza-s-indacenu (BODIPY)-cholesterolu i 22-(N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-ylo)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-cholesterol). W szczególności cholesterol NBD wykazuje efektywny wychwyt w komórkach ludzkich12. Obecnie dostępne są dwa różne cholesterole znakowane NBD: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) i 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)-metylo]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Cholesterol oznaczony ugrupowaniem 22-NBD może najlepiej pasować do badań nad wypływem cholesterolu, podczas gdy cholesterol 25-NBD jest głównie stosowany w badaniach nad dynamiką błon komórkowych13,14.
Linie komórkowe zazwyczaj używane w testach in vitro na cholesterol to komórki podobne do monocytów, takie jak ludzkie komórki THP-1 pochodzące z białaczki, mysie surowe komórki 264.715, lub J774.1. Wszystkie te komórki można różnicować w makrofagi in vitro przy użyciu 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), ale makrofagi pochodzące z THP-1 (dmTHP-1) najlepiej odzwierciedlają i naśladują ludzkie makrofagi16.
W obecnym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjną o wysokiej przepustowości, aby określić zdolność wypływu cholesterolu przez próbki surowicy na dmTHP-1, używając 22-NBD-cholesterolu jako alternatywy dla [3H]-cholesterolu. Ponadto porównujemy zoptymalizowaną technikę fluorescencyjną ze standardowym analogiem radioaktywnym.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płytka zbierająca</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>biała 96-dołkowa płytka z nieprzezroczystym przezroczystym dnem</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>biała 96-dołkowa płytka z płaskim przezroczystym dnem</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania wypływu cholesterolu (na bazie komórek)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>komercyjny wysokoprzepustowy zestaw do oznaczania na komórkach o wysokiej przepustowości mający na celu określenie wypływ cholesterolu</td></tr><tr><td>bezbarwny RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 bez pehnol-red</td></tr><tr><td>Gen5 Oprogramowanie do analizy danych</td><td>BioTek</td><td></td><td>Wersja 2.0</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glicyna, luminometr do użytku bez zwierząt</td></tr><tr><td></td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy 1</td><td>własny</td><td></td><td>50 mM bufor Tris, 150 mM NaCl i roztwór do lizy H2O</td></tr> 2 <tr><td></td><td>Własny</td><td></td> czysty <td>etanol i roztwór do lizy komórek 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-cholesterol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3&beta;-ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>buforowany fosforanem&nbsp; sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>glikol polietylenowy</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-merystate B-octan B.</td></tr><tr><td>R10</td><td>Autorski</td><td></td><td>RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 5% penicyliną/streptomycyną.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą zawierającą 1,5 g/L wodorowęglanu sodu i 4,5 g/L</td></tr><tr><td>glukozy Komórki THP-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>monocytowa linia pochodząca z białaczki od rocznego dziecka</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Miażdżyca prowadzi do chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Nadal nie jest jasne, czy stężenie cholesterolu-HDL (cHDL) odgrywa przyczynową rolę w rozwoju miażdżycy. Jednak ważnym czynnikiem we wczesnych stadiach tworzenia blaszek miażdżycowych jest zdolność cholesterolu do HDL (zdolność cząsteczek HDL do przyjmowania cholesterolu z makrofagów) w celu uniknięcia tworzenia się komórek piankowatych. Jest to kluczowy krok w unikaniu gromadzenia się cholesterolu w śródbłonku i część odwrotnego transportu cholesterolu (RCT) w celu wyeliminowania cholesterolu przez wątrobę. Zdolność cholesterolu do wypływu cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem, które można wykorzystać jako biomarker miażdżycy. Tradycyjnie, [3H]-cholesterol był stosowany w testach wypływu cholesterolu. W tym badaniu mamy na celu opracowanie bezpieczniejszej i szybszej strategii wykorzystującej fluorescencyjny cholesterol znakowany (cholesterol NBD) w teście komórkowym w celu śledzenia procesu wychwytu i wypływu cholesterolu w makrofagach pochodzących z THP-1. Na koniec optymalizujemy i standaryzujemy metodę wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Celem testu odpływu cholesterolu jest określenie in vitro zdolności do odpływu cholesterolu z danej surowicy, osocza lub nadsączu zawierającego cząsteczki HDL. Metoda polega na załadowaniu znakowanego cholesterolu do hodowli standardowej linii komórkowej makrofagów i indukowaniu kontaktu komórek z próbką testową rozcieńczoną w medium bez FBS. Następnie mierzy się poziomy fluorescencji NBD w medium oraz w lizacie komórkowym. Aby zoptymalizować pomiary, cholesterol odpływający z komórek do medium miesza się z taką samą obj...

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Ten protokół jest naszą opartą na komórkach metodą zakończenia refluksu cholesterolowego w osoczu mózgowym. Szczególnie w seansach. Może to być stosowane do diagnozowania ryzyka sercowo-naczyniowego oraz do identyfikacji lub oceny utrzymania obniżonego poziomu cholesterolu.Technika ta pozwala uniknąć ryzyka i obciążeń, ponieważ bezpieczeństwo obchodzenia się z materiałami promieniowanymi, zapewniając wyniki o porównywalnych poziomach jakości, do tych refluksu cholesterolowego zgłoszono, że wiąże się z Tak więc, refluks cholesterolu w osoczu lub mózgu akceptowany można porównać, do naszej kontroli referencyjnej i może zapewnić ryzyko cierpienia na Ta metoda będzie również stosowana do linii komórkowych, podobnie jak inne ludzkie linie komórkowe, a nawet pierwotne fazy makro. Makrofazy lub komórki macierzyste z guzika do rozpylania indukowane przez człowieka. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść cholesterol NPD w czystym etanolu, aby uzyskać roztwór podstawowy o końcowym stężeniu dwóch mikromolowców.Rozcieńczyć 25 mikrolitrów cholesterolu NBD w pożywce AR 10, aby osiągnąć końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Hoduj komórki thp-1 w naszym 10 podłożach w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Co trzy dni dostosowuj gęstość komórek do 300000 komórek na mililitr.Następnie należy uzyskać 96-dołkową płytkę z płaskim, przezroczystym dnem. Aby uzyskać lepszą homogenizację, przygotuj 10 mililitrów komórek thp-1 w 15-mililitrowej probówce i dodaj 200 mikrolitrów bulionu PMA. Delikatnie wymieszaj i wysiew 100 mikrolitrów mieszanki do dołków płytkowych po 200 000 komórek na dołek.I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 do 72 godzin, aby zróżnicować komórki thp-1 w komórki DM thp-1. Najpierw rozcieńczyć glicynę w 10% PBS sterylną wodą, do stężenia 200 mikromolów przy pH 7,4. Dodaj 40 mililitrów rozcieńczonej glicyny do 10 gramów PEG 8000, aby przygotować 20% roztwór PEG i energicznie wymieszaj do homogenizacji.Następnie nałóż cztery części po 20% na 10 części próbki do każdej próbki surowicy lub osocza w probówce o pojemności 1,5 ml. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 25 minut. Odwirować apolipoproteinę B wytrąconą w temperaturze 13000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Odrzucić osad i przenieść supernatant do nowej probówki. Pobrać płytkę zawierającą zróżnicowane komórki thp-1. Usuń i wyrzuć pożywkę hodowlaną, a następnie umyj komórki dwukrotnie 1X PBS.Dodaj 100 mikrolitrów 5 mikromolowego cholesterolu MVD w pożywce AR-10 do każdej studzienki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia wyrzuć, wyrzuć pożywkę.Umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj 100 mikrolitrów ABDS lub oczyszczonego akceptora lipidów rozcieńczonego w pożywce rpmi 1630 do pożądanego stężenia do każdego dołka. Włączyć kontrolę ujemną, która nie zawiera akceptorów cholesterolu, do kontroli pozytywnej, jak opisano w protokole tekstowym, i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin. W międzyczasie przygotuj 200 mililitrowy zapas roztworu do lizy komórek, zgodnie z opisem w tekście.Wymieszaj ten roztwór z etanolem w stosunku objętościowym jeden do jednego, aby uzyskać również roztwór do lizy. W celu wykrycia pożywki i cholesterolu BD należy usunąć pożywkę komórkową z płytek zebranych na nowej białej 96-dołkowej płytce z nieprzezroczystym płaskim dnem. Dodaj 100 mikrolitrów czystego etanolu do 100 mikrolitrów każdej próbki pożywki, aby uzyskać stosunek jeden do jednego na nowej płytce.Za pomocą iluminometru zmierz intensywność fluorescencji przy wzbudzeniu 463 nanometrów i emisji 536 nanometrów. W celu wewnątrzkomórkowego wykrycia cholesterolu NBD należy dwukrotnie przemyć komórki PBS. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do lizy do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, wstrząsając przez 25 minut.Następnie zmierz intensywność świetlówki, dostosowując parametr czułości do 50 w oprogramowaniu. Następnie określ szybkość wypływu cholesterolu w końcowej mierze wypływu cholesterolu, jak opisano w protokole tekstowym. Rozcieńczenie cholesterolu NBD w czystym etanolu daje najwyższe wartości intensywności fluorescencji, podczas gdy wysoka zawartość w roztworze wodnym obniża intensywność.Sugeruje to, że emisja tej cząsteczki przez fluorescencyjną jest silnie zależna od ośrodka, w którym jest zawarta. Podczas stosowania mieszaniny pożywki i etanolu w stosunku jeden do jednego, intensywność fluorescencji wydaje się wzrastać proporcjonalnie, wraz ze stężeniem analogu cholesterolu, co sugeruje, że sonda zachowuje się odpowiednio w tych warunkach. Aby określić ilość czasu potrzebną do inkubacji załadowanych komórek z akceptorami cholesterolu, pożywki komórkowe są zbierane w różnych punktach czasowych.Wypływ cholesterolu ewoluował liniowo od zera do sześciu godzin, przy czym maksymalny sygnał był wychwytywany sześć godzin po dodaniu ABDS do komórek. Próg nasycenia i zakres dynamiki są testowane poprzez pomiar wypływu cholesterolu przy różnych procentach pożywek zawierających HDL. W aktywach o wysokiej przepustowości wypływ ewoluuje liniowo od jednego do 7% ABDS, osiągając szczyt zdolności wypływu cholesterolu przy 7% przy stężeniach wyższych niż 7% intensywność fluroescent zmniejsza się w odwrotnej zależności do procentu ABDS.Wydajność metody opartej na fluorescencji jest następnie oceniana poprzez porównanie jej ze standardową techniką znakowania radiowego. Obie techniki są silnie skorelowane przy stosowaniu różnych stężeń ABDS. Opisana metoda jest wrażliwa na wzrost stężeń akceptorów w wartościach wypływu cholesterolu od pięciu do 15%Ważne jest, aby upewnić się, że celularyzacja nie zawiera agregatów.Punktem krytycznym jest klasyfikacja środowiska zawierającego kruszywo etylowe w celu zmierzenia fluorescencji w jednorodnej i optymalnej masie. Po tej procedurze można zmierzyć nazwę cholesterolu technicznego i określić wpływ leków na szlak wypływu cholesterolu. Również szkoła może być ostatecznie wykorzystana jako diagnostyka do oceny ryzyka sercowo-naczyniowego.Uważamy, że ta metoda jest znacznie łatwiejsza i bezpieczniejsza niż radioaktywna metoda standardowa. Jednak nadal jest to zależne od komórki. Należy pamiętać, że etanol jest łatwopalny i należy go odpowiednio przechowywać i obchodzić się z nim.

high-throughput-nitrobenzoxadiazole-labeled-cholesterol-efflux-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test oznaczania cholesterolu został opracowany w celu ilościowego określenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych oraz zdolności akceptorów plazmy do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Procedura obejmuje znakowanie komórek cholesterolem, wyrównanie poziomu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych oraz uwalnianie cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Test odpływu cholesterolu

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Celem tego badania było oszacowanie in vitro wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu. Porównanie leków obniżających stężenie lipidów ujawniło różnice w ich działaniu w modulowaniu cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu.

Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Poznaj wysokoprzepustową metodę pomiaru wypływu cholesterolu z makrofagów przy użyciu fluorescencyjnego analogu NBD-cholesterolu. Technika ta umożliwia bezpieczną i efektywną ocenę ryzyka sercowo-naczyniowego.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Przeglądaj więcej filmów