Name: Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do szybkich badań aktywności proteolitycznej proteaz aktywujących białka fuzyjne wirusów. Metoda wykorzystuje pary FRET do wykrywania rozszczepienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie badań nad projektem MERS przedstawionym w tym manuskrypcie zostało zapewnione przez grant NIH R21 AI111085. Badanie koronawirusa kotów było wspierane przez granty badawcze z Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation i Cornell Feline Health Center. Chcielibyśmy również podziękować Malikowi Peirisowi za udostępnienie nam sekwencji Mor213 zanim stała się ona publicznie dostępna.

1. Projektowanie i przygotowanie peptydów
<ol>
	<li>Uzyskaj sekwencję białka fuzyjnego, które Cię interesuje, z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub bazy danych patogenów wirusowych (https://www.viprbrc.org). Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy poprzedzające peptyd fuzyjny i uwzględnij 2-3 aminokwasy przed i za tą sekwencją.</li>
	<li>Zamawiając peptydy, zmodyfikuj je za pomocą pary FRET 7-metoksykumaryno-4-ylu acetylu (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylu (DNP) na C-końcu. 
	UWAGA: Kilku dostawców oferuje te modyfikacje. Cena i czas dostawy zależą od wybranego dostawcy. Istnieją jednak alternatywne modyfikacje, które różnią się czułością i wymagają dostosowania czytnika płytek pod względem długości fal.</li>
	<li>Zawiesić peptyd zgodnie z zaleceniami producenta, delikatnie pipetując w górę iw dół. Na przykład ponownie zawiesić peptydy w 70% etanolu do końcowego stężenia 1 mM.</li>
	<li>Opcjonalnie dodać probówkę zawierającą peptyd i rozpuszczalnik do kąpieli sonicyjnej, aż do całkowitego ponownego zawieszenia, jeśli peptyd nie ulega zbyt dobremu zawieszeniu przez pipetowanie.</li>
	<li>Podzielić peptyd na rurki zwilżające światło lub odporne na wilgoć, aby chronić peptyd przed bieleniem. Utrzymuj małe rozmiary porcji, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania (np. 100 μL). Porcje należy przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie czytnika płytek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Włącz czytnik płytek i poczekaj, aż autotest zostanie zakończony.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie operacyjne na podłączonym komputerze i upewnij się, że jest ono połączone z czytnikiem płytek.</li>
	<li>Otwórz ustawienie temperatury i ustaw na 30 °C (lub temperaturę wymaganą do optymalnej wydajności proteazy).</li>
	<li>Kliknij Kontrola | Konfiguracja instrumentu, aby skonfigurować eksperyment.</li>
	<li>Wybierz opcję Kinetyczny.</li>
	<li>Wybierz opcję Fluorescencja.</li>
	<li>Wprowadź długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 330 nm i 390 nm.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie opcji Automatyczne wyłączanie.</li>
	<li>Wybierz opcję Średnia, normalna czułość.</li>
	<li>Wybierz czas trwania testu wynoszący 1 godzinę i wybierz jeden pomiar co 60 sekund.</li>
	<li>Ustaw mieszanie na 5 s przed pierwszym pomiarem i 3 s przed każdym pomiarem</li>
	<li>Wybierz studzienki do odczytania i rozpocznij test.</li>
</ol>
3. Przygotowanie testu
<ol>
	<li>Przygotować bufor do oznaczania, obliczając odpowiednie ilości dla każdego składnika i dodając go. W przypadku furyny należy przygotować bufor składający się ze 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-merkaptoetanolu, 5% Triton X-100. W przypadku trypsyny należy użyć standardowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
	UWAGA: Objętości 10 ml lub mniejsze są wystarczające. W zależności od proteazy (proteaz) użytej w teście bufor jest różny.</li>
	<li>Schłodzić bufor na lodzie.</li>
	<li>Umieść płytkę testową na lodzie z cienką metalową płytką pod spodem, aby wspomóc chłodzenie i stabilność. Użyj solidnej czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i niepoddanej obróbce. 
	UWAGA: Konieczne jest stosowanie czarnych płytek, aby zapobiec fluorescencyjnemu "wyciekowi" z sąsiednich studni.</li>
	<li>Oblicz odpowiednią ilość proteazy do dodania dla każdej reakcji na podstawie wcześniejszych publikacji lub danych eksperymentalnych. W przypadku furyny należy użyć 1 jednostki na reakcję, co odpowiada 0,5 μl. W przypadku trypsyny użyj 0,5 μl trypsyny TPCK o stężeniu 160 nM.</li>
	<li>Na próbkę należy przygotować 3 kontrpróby techniczne na test o łącznej objętości 100 μl na próbkę. 
	UWAGA: Oceniono eksperymentalnie, że nie ma znaczenia, czy pipetowanie odbywa się w normalnych warunkach oświetleniowych, czy w przyciemnionym świetle. Jednak peptydy nie powinny być wystawione na działanie światła przez dłuższy czas.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią ilość buforu do oznaczania (94,5 μl, zgodnie z opisem w kroku 3.1) do każdego dołka.</li>
	<li>Dodaj proteazę do każdej studzienki. Zarówno w przypadku furyny, jak i trypsyny TPCK, należy użyć 0,5 μl na próbkę. Do 6 dołków (3 dołki dla ślepej próby i 3 dołki dla kontroli peptydowej) dodaj 0,5 μl buforu zamiast odpowiedniej proteazy.</li>
	<li>Dodać peptyd do końcowego stężenia 50 μM do każdej studzienki, z wyjątkiem ślepej próby. W takim przypadku należy odpipetować 5 μl peptydu przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.3. Dodać 5 μl buforu do ślepej próby kontrolnej zamiast peptydu. 
	UWAGA: Początkowo przetestowano kilka stężeń peptydu z opisanymi stężeniami enzymów, aby upewnić się, że enzymy są nasycone.</li>
	<li>Włóż płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i kliknij przycisk start.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Zapisz plik eksperymentu.</li>
	<li>Kliknij Eksportuj i wyeksportuj plik jako .txt.</li>
	<li>Zaimportuj plik .txt do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Dla każdej kontrpróby technicznej na próbkę należy utworzyć wykres przedstawiający względne jednostki fluorescencyjne (RFU) na osi y w funkcji czasu na osi x (rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Wybierz zakres danych, w którym wykres znajduje się w zakresie liniowym i znajduje się najbliżej początku wzrostu fluorescencji.</li>
	<li>Wykreśl wybrane dane na drugim wykresie i dodaj liniową linię trendu.</li>
	<li>Wybierz w opcjach linii trendu Wyświetl równanie na wykresie. Równanie pokaże Vmax.</li>
	<li>Obliczyć średnią Vmax dla każdej próbki z 3 kontrprób technicznych.</li>
	<li>Powtórz eksperyment jeszcze dwa razy, aby uzyskać 3 kontrpróby biologiczne.</li>
	<li>Obliczyć odchylenie standardowe na podstawie danych z 3 niezależnych kontrprób biologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li>
<li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillet%2C+JK+%22Virus+Research%22">Virus Research</a>. , (2014).</li>
<li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus-mediated+membrane+fusion%3A+Determinants+of+hemagglutinin+fusogenic+activity+and+experimental+approaches+for+assessing+virus+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion.</a> Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).</li>
<li>Straus, M. R., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+approach+to+evaluate+the+adaptability+of+influenza+A+virus+to+humans+based+on+its+hemagglutinin+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site.</a> PloS one. 12 (3), e0174827(2017).</li>
<li>Kawaoka, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+requirements+for+cleavage+activation+of+influenza+virus+hemagglutinin+expressed+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).</li>
<li>Abdelwhab, E. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Multibasic+Proteolytic+Cleavage+Site+and+Three+Mutations+in+the+HA2+Domain+Confer+High+Virulence+of+H7N1+Avian+Influenza+Virus+in+Chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens.</a> Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).</li>
<li>Steinhauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hemagglutinin+cleavage+for+the+pathogenicity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus.</a> Virology. 258 (1), 1-20 (1999).</li>
<li>Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+influenza+viruses+by+proteases+from+host+cells+and+bacteria+in+the+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+disease%22%5BJournal%5D)">Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium.</a> Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).</li>
<li>Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proprotein-processing+endoproteases+PC6+and+furin+both+activate+hemagglutinin+of+virulent+avian+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses.</a> Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).</li>
<li>Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+SARS+coronavirus+spike+protein+via+sequential+proteolytic+cleavage+at+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).</li>
<li>Polgar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Aspects+of+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Protease+Action%22%5BJournal%5D)">General Aspects of Proteases.</a> Mechanisms of Protease Action. , 43-76 (1989).</li>
<li>Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Virus+Taxonomy+by+Recontextualizing+Sequence-Based+Classification+with+Biologically+Relevant+Data%3A+the+Case+of+the+Alphacoronavirus+1+Species%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species.</a> mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Licitra, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+spike+protein+cleavage+site+and+pathogenesis+of+feline+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).</li>
<li>Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Mutation+Rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Viral Mutation Rates.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9733-9748 (2010).</li>
<li>Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Influenza+Strains+in+the+Last+Two+Decades%3A+A+Threat+of+a+New+Pandemic%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic?</a> Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).</li>
<li>Chu, D. K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MERS+coronaviruses+from+camels+in+Africa+exhibit+region-dependent+genetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).</li>
<li>Caprioli, R. M., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Km+and+Vmax+for+Tryptic+Peptide+Hydrolysis+Using+Fast+Atom+Bombardment+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).</li>
<li>Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+camel-derived+MERS-CoV+with+a+variant+spike+protein+cleavage+site+and+distinct+fusion+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+microbes+and+infections%22%5BJournal%5D)">A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties.</a> Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).</li>
<li>Tian, S., Huajun, W., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+furin+cleavage+sites+by+a+hybrid+method+and+understanding+mechanism+underlying+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li>
<li>Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+Activation+of+the+Human-Adapted+Influenza+Virus+Subtypes+by+Matriptase+Reveals+both+Subtype+and+Strain+Specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities.</a> Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).</li>
<li>Beaulieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matriptase+Proteolytically+Activates+Influenza+Virus+and+Promotes+Multicycle+Epithelium+Replication+in+the+Human+Airway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway.</a> Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).</li>
<li>Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefusion+rearrangements+resulting+in+fusion+peptide+exposure+in+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+influenza+virus+infection+and+hemagglutinin+cleavage+by+the+protease+inhibitor+HAI-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj test peptydów fluorogenicznych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe sekwencji białek pod kątem ich proteolitycznego rozszczepienia przez proteazy. W naszym pierwszym przykładzie wybraliśmy różne motywy miejsca rozszczepienia białka kolca (S) MERS-CoV, aby zilustrować jedno zastosowanie w tym teście. Kilka wirusów otoczkowych, które posiadają białka fuzyjne klasy I, takich jak MERS-CoV, SARS-CoV (zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej) i grypa, stanowią poważne problemy dla zdrowia publicznego, a nowe podtypy stale ewoluują, które mają potencjał do przekraczania barier gatunkowych od ich naturalnych gospodarzy do ludzi 1,15,16. Wyizolowanie wirusów i hodowla ich w laboratorium nie zawsze jest wykonalne lub wymaga specjalnych laboratoriów, które nie są dostępne w każdej placówce badawczej. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania metod oceny potencjalnego zagrożenia dla zdrowia publicznego związanego z pojawiającymi się wirusami, które można przeprowadzić w normalnych warunkach laboratoryjnych. Oprócz wirusów atakujących ludzi, niektóre wirusy zwierzęce, takie jak FCoV, mają również te same białka fuzyjne klasy I, a zatem mają podobne cechy jak ich ludzkie odpowiedniki. Wyizolowanie tych wirusów może być również wyzwaniem, co sprawia, że konieczne jest wykorzystanie innowacyjnych narzędzi do ich badania.
Kluczowym krokiem w cyklu życiowym wyżej wymienionych wirusów jest wnikanie do komórek gospodarza i fuzja, w której pośredniczy proteolityczne przetwarzanie odpowiedniego białka fuzyjnego przez proteazygospodarza 1,2. Standardowym sposobem badania tej części cyklu życiowego wirusa jest sklonowanie genu białka fuzyjnego do wektora ekspresji ssaków, transfekcyjnych komórek ssaków, które pozwalają na ekspresję białka, inkubacji lub kotransfekcji z proteazą będącą przedmiotem zainteresowania, wyizolowania białka i przeprowadzenia analizy western blot. Metoda ta wiąże się z kilkoma ograniczeniami: dostępnością wirusowego DNA/RNA do klonowania, kosztami syntezy genu, jeśli nie jest dostępne DNA lub RNA, dostępnością przeciwciała do wykrywania białka fuzyjnego i jego produktu (produktów) rozszczepienia, a przeprowadzenie całego badania może potrwać do kilku tygodni. Staje się to nawet bardziej czasochłonne, kosztowne i pracochłonne, jeśli celem badania jest zbadanie kilku mutacji w miejscu rozszczepienia, ponieważ wymaga to mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Opisany przez nas test peptydów fluorogenicznych nie ma tych ograniczeń. Peptydy, które są przedmiotem zainteresowania, mogą być projektowane w oparciu o publicznie dostępne sekwencje, istnieje kilku dostawców, którzy zapewniają szeroką gamę rekombinowanych proteaz, które są istotne dla tego rodzaju badań, a test wraz z analizą można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.
W naszym przykładzie zbadaliśmy rozszczepienie za pośrednictwem furyny miejsca rozpoznawania proteazy S2' białka S MERS-CoV pochodzącego od ludzi i wielbłądów z Egiptu i Maroka. Zarówno ludzka EMC/2012, jak i wielbłądzia HKU205 S2 zawierają typowy dla RXXR motyw rozszczepienia furyny. Jednak zgodnie z algorytmem oceny rozszczepienia PiTou 2.0 nie przewiduje się, aby miejsce HKU205 S2' zostało rozszczepione przez furynę, co potwierdziliśmy eksperymentalnie19. Powodem, dla którego HKU5 S2' nie jest przetwarzany przez furynę, może być izoleucyna w pozycji P1'. Kiedy przetestowaliśmy dwa peptydy, które przenosiły poszczególne mutacje w sekwencji EMC/2012 S2', byliśmy w stanie potwierdzić, że izoleucyna w P1' w dużej mierze znosi rozszczepienie, podczas gdy substytucja alaniny do seryny spowodowała zmniejszenie rozszczepienia. Na stronie Mor213 S2 nie ma motywu rozszczepienia furyny i nie było zaskoczeniem, że prawie nie wykryto dekoltu. Zbadaliśmy również, w jaki sposób furyna rozszczepia miejsca rozpoznawania proteazy S1/S2 i S2' białka FCoV S. Udało nam się zaobserwować rozszczepienie furyny obu peptydów FECV (FECV I And-4 S1/S2 i FECV II 1683 S2'), podczas gdy zmutowane sekwencje wirusów FIPV nie zostały rozszczepione przez furynę. 
Porównując rozszczepienie peptydu EMC/2012 S2' za pośrednictwem furyny (ryc. 1A) z peptydami FECV I i -4 S1/2 (ryc. 2A), stwierdziliśmy, że istniała około 26-krotna różnica w Vmax. Można to wytłumaczyć motywem rozszczepienia furyny w obu sekwencjach (tab. 1). Podczas gdy minimalnym wymogiem dla rozszczepienia furyny jest motyw RXXR, sekwencja RXRR jest znacznie bardziej korzystna2. W związku z tym peptyd S2' EMC/2012, który ma motyw RSAR, jest rozszczepiany z mniejszą swoistością w porównaniu z peptydem FECV I And-4 S1/2, który zawiera miejsce rozszczepienia furyny RSRR (Tabela 1). 
Jednak jednym z głównych ograniczeń testu jest to, że peptydy nie odzwierciedlają trzeciorzędowej struktury białka, w którym są zwykle osadzone. Rozszczepienie białka fuzyjnego na całej długości odsłania peptyd fuzyjny i wyzwala wejście do komórki gospodarza1. Na interakcję między proteazą a białkiem fuzyjnym może mieć również wpływ trzeciorzędowa struktura białka fuzyjnego, podczas gdy zakładamy, że peptydy są mniej więcej liniowe. W związku z tym rozszczepienie wykryte w teście peptydowym może być sztuczne i może nie odzwierciedlać sytuacji in vivo. Stwierdzono to w przypadku rozszczepienia podtypu HA grypy H3N2 przez matryptazę. Podczas gdy kilka grup opisało rozszczepienie H3N2 HA przez matryptazę w testach peptydowych, wykazano również, że inkubacja pełnej długości białka HA H3N2 i matryptazy w hodowli komórkowej nie dała fuzogennego białka HA 4,20,21. Istnieją inne przykłady, które pokazują, że biologicznie ważna regulacja rozszczepienia proteolitycznego odbywa się na poziomie konformacji białek. Opisano, że białka fuzyjne czasami potrzebują serii zdarzeń poprzedzających fuzję, aby móc odsłonić miejsca rozszczepienia po fuzji. Na przykład białko fuzyjne wirusa lasu Semliki wymaga przegrupowania strukturalnego podczas wielu zdarzeń prefuzyjnych, aby odsłonić swoje białko fuzyjne i udostępnić je do aktywacji proteolitycznej22. W związku z tym wyniki uzyskane w teście peptydów fluorogenicznych muszą zostać zatwierdzone za pomocą testów fuzji komórkowej lub podobnych eksperymentów. Jednak test peptydowy nadal pozwala na szybkie badanie przesiewowe kilku kombinacji proteazy / peptydu oraz na zmniejszenie nakładu pracy i czasu eksperymentów kontrolnych, ponieważ kombinacje, które nie wykazują rozszczepienia, z dużym prawdopodobieństwem wykażą ten sam wynik in vivo.
Drugie poważne ograniczenie testu dotyczy proteaz. Do tej pory możliwe jest badanie tylko proteaz rozpuszczalnych, ale nie proteaz transbłonowych. W zależności od intencji eksperymentu może to stanowić problem. Na przykład HA grypy są aktywowane przez szereg transbłonowych proteaz zlokalizowanych na błonach komórkowych8. Do pewnego stopnia problem ten można obejść, stosując rozpuszczalne proteolityczne domeny aktywne, ale wyniki należy interpretować z ostrożnością i walidować konwencjonalnymi metodami. Chcemy odwołać się do wspomnianego wcześniej przykładu z matryptazą i jej aktywnością wobec H3N2 HA. In vivo matryptaza znajduje się w błonie komórkowej, ale dostępnym na rynku enzymem jest rozpuszczalna domena katalityczna. Jak omówiono w odniesieniu do białek fuzyjnych, możliwe jest, że wymaga to również interakcji proteazy o pełnej długości z substratem białkowym o pełnej długości w celu uzyskania rozszczepienia, a testowanie tylko pojedynczych domen może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami. 
Metodologia ta okazała się skuteczna w badaniu rozszczepienia określonych sekwencji aminokwasów przez furynę. Jednak zastosowania tej techniki rozciągają się na każdą dostępną proteazę (np. katepsyny, konwertazę proproteinową), co czyni ją użyteczną metodą przesiewową kandydatów peptydowych do rozszczepienia proteazy. Co więcej, wykazano, że test ten może być również stosowany do testowania skuteczności inhibitorów proteazy, a tym samym zapewnia szybkie i łatwe narzędzie do badań przesiewowych inhibitorów białek23. 
Opisany tutaj test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych stanowi dodatek do bioinformatycznych algorytmów oceny rozszczepienia, które przewidują rozszczepienie peptydu przez określoną proteazę, na podstawie właściwości i sekwencji aminokwasów. Te dwie techniki, w połączeniu z tradycyjnymi technikami western blot, mogą być stosowane jako skuteczna metoda badania rozszczepienia proteazy in vitro.

Fuzja wirusa z błoną komórkową gospodarza jest kluczowym krokiem w cyklu życia wirusów otoczkowych i ułatwia wejście do komórki i replikację wirusa. Zazwyczaj wirusy posiadają wyspecjalizowane białko (lub białka), które wiąże się z receptorami na błonie komórkowej gospodarza i wyzwala fuzję błony wirus-komórka1. Białka fuzji wirusowej zostały pogrupowane w trzy główne klasy (I-III)1. Wiele wirusów, które stanowią obecnie poważny problem dla zdrowia publicznego, takich jak wirus grypy (reprezentujący długotrwałe odzwierzęce pojawienie się ptaków) i koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV) (reprezentujący niedawne pojawienie się chorób odzwierzęcych u wielbłądów), wykorzystuje tak zwane białka fuzyjne klasy I, które wymagają przetwarzania proteolitycznego przez proteazy gospodarza, aby wywierać swoją aktywność fuzogeniczną2. Podobnie koronawirus kotów (FCoV), który stanowi poważne zagrożenie chorobowe dla kotów dzikich i domowych, również posiada białko fuzyjne klasy I. Białka fuzyjne wirusa klasy I są zwykle syntetyzowane jako nierozkurczony prekursor i na ogół składają się z dwóch domen, które są odpowiedzialne odpowiednio za wiązanie receptora i wyzwalanie zdarzenia fuzji. Do tej pory hemaglutynina grypy (HA) jest najlepiej poznanym białkiem fuzyjnym, a liczne badania opisały jej mechanistyczną rolę we wnikaniu i fuzji komórek gospodarza3. W tym przypadku rozszczepienie białka fuzyjnego zachodzi w określonej sekwencji lub miejscu rozszczepienia w obrębie HA, a w połączeniu ze zmianami konformacyjnymi zależnymi od pH powoduje ekspozycję wirusowego peptydu fuzyjnego1,2.
Peptyd fuzyjny i poprzedzająca go sekwencja rozpoznawania proteazy są kluczowe dla patogeniczności i adaptacji gospodarza wirusa. Zmiany w sekwencji rozpoznawania proteazy mogą znacząco zmienić rozszczepienie, co może mieć dramatyczne konsekwencje dla wirusa i gospodarza4. Z jednej strony może znieść rozszczepienie, a tym samym wyeliminować cykl życiowy wirusa. Ale z drugiej strony, mutacja może zwiększyć specyficzność substratu dla danej proteazy i/lub pozwolić "nowej" proteazie na rozszczepienie białka fuzyjnego. Następnie może to również rozszerzyć tropizm komórek i tkanek, jak zaobserwowano, np. w przypadku podtypów wirusa grypy5,6. Zwykle wirusy grypy ptaków o niskiej zjadliwości (LPAI) i większość wirusów grypy ludzkiej są ograniczone do przewodu pokarmowego lub dróg oddechowych ze względu na ograniczoną lokalizację proteaz, które je aktywują. Zazwyczaj peptyd fuzyjny takich białek HA jest poprzedzony sekwencją czterech aminokwasów, która składa się z 1-2 nienastępujących po sobie aminokwasów zasadowych, która jest rozpoznawana przez proteazy serynowe podobne do trypsyny, takie jak trypsyna, matryptaza lub TMPRSS27,8. Kiedy wirus nabywa insercje lub mutacje, które zmieniają miejsce rozszczepienia na miejsce wielozasadowe, pozwala furynie aktywować kwas hialuronowy i potencjalnie spowodować znacznie poważniejszą infekcję ogólnoustrojową6,9. Wirusy te są określane jako wirus ptasiej grypy o wysokiej zjadliwości (HPAI), typowy dla szczepów H5N1.
W przeciwieństwie do grypy HA, wiele koronawirusów, takich jak MERS-CoV, ma dwa różne miejsca rozszczepienia w swoim białku kolca. Miejsce S1/S2 oddziela N-końcową domenę wiążącą receptor (S1) od C-końcowej domeny fuzyjnej (S2), z drugim miejscem cięcia, zwanym S2', za miejscem S1/S2, w pobliżu peptydu fuzyjnego10. Zasugerowano, że miejsca są rozszczepiane sekwencyjnie, w S1/S2, a następnie S2'. W przeciwieństwie do HA większości szczepów wirusa grypy, miejsca S1/S2 i S2 białka S MERS-CoV można rozpoznać po proteazach z rodziny konwertazy proproteinowej (PC), takich jak furyna. Członkowie tej rodziny rozszczepiają sparowane reszty zasadowe z motywem R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, dowolny aminokwas)2. Ogólnie rzecz biorąc, aminokwasy znajdujące się przed miejscem rozszczepienia są określane jako P1, P2, P3 itp. licząc od miejsca rozszczepienia, a aminokwasy znajdujące się poniżej są oznaczone jako P1', P2', P3' itd. 11. Szczepy FCoV mogą mieć pojedyncze lub podwójne miejsce rozszczepienia. Podobnie jak MERS-CoV, niektóre szczepy FCoV mają również dwa miejsca rozszczepienia (S1/S2 i S2') w białku S. Cecha ta jest jednak wyłączona dla serotypu I FCoV (klad A). Natomiast członkowie grupy serotyp II (klad B) mają tylko jedno miejsce rozszczepienia (S2')2,12. Sugeruje się, że kilka proteaz rozszczepia miejsca cięcia FCoV, w tym furyna, proteazy podobne do trypsyny i katepsyna. Zaproponowano, że białko S jelitowego FCoV (znanego również jako koronawirus jelitowy kotów lub FECV) prawdopodobnie zostanie rozszczepione przez furynę w miejscu S1 / S2, a mutacje w tym miejscu (jak również w S2') prowadzą do zmian w wymaganiach dotyczących proteazy. Mutacje te zostały związane ze zmianami tropizmu i patogenności tych wirusów, co pozwoliło wirusowi stać się ogólnoustrojowym i makrofagowo-tropowym (znanym również jako wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów lub FIPV)13.
Wirusy naturalnie wprowadzają mutacje do swoich genomów podczas każdego cyklu replikacji i często opisywane są nowe podtypy i szczepy grypy, MERS-CoV i FCoV14,15,16. W ramach szybkiej oceny mającej na celu ocenę zagrożenia dla zdrowia publicznego związanego z pojawiającymi się wirusami, kluczowe znaczenie ma zbadanie zmian w miejscu rozszczepienia i jego wpływu na zakres proteaz aktywujących te wirusy. W tym miejscu opisujemy test oparty na peptydach, który pozwala bardzo szybko ocenić, w jaki sposób zmiany miejsca rozszczepienia w białku S MERS-CoV wpływają na specyficzność substratową danej proteazy i szybko przebadać różne proteazy pod kątem ich zdolności do rozszczepiania danej lub wielu sekwencji4. W drugim zestawie eksperymentów wykorzystaliśmy tę technikę do określenia aktywności rozszczepienia furyny na różnych serotypach i szczepach FCoV.
Peptydy użyte w tym teście są modyfikowane parą transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET), 7-metoksykumaryno-4-yl acetylem (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylem (DNP) na C-końcu. Podczas testu MCA jest wzbudzany i emituje energię świetlną, która jest gaszona przez DNP, o ile para znajduje się w bliskiej odległości od siebie. Jeśli jednak dojdzie do rozszczepienia, DNP nie jest już w stanie wygasić emisji i może być ona odczytana przez czytnik płytek fluorescencyjnych. Zmiany fluorescencji są mierzone podczas eksperymentu w celu określenia szybkości rozszczepienia peptydu i obliczenia prędkości, z jaką proteaza rozszczepia określony peptyd (znany również jako Vmax)17.
Aby zaprojektować peptydy, gen odpowiedniego białka fuzyjnego musi zostać zsekwencjonowany i/lub udostępniony w bazie danych. Jednak metoda ta jest mniej pracochłonna i kosztowna niż metody konwencjonalne, które zwykle wymagają klonowania genu białka fuzyjnego do wektorów ekspresyjnych w celu ekspresji w komórkach ssaków w celu analizy rozszczepienia. Od początku do końca może to potrwać od kilku dni do kilku tygodni, podczas gdy przedstawione tutaj testy peptydowe można wykonać w ciągu jednego dnia, gdy tylko peptydy i proteazy będą dostępne. Przygotowanie testu trwa od 5 do 30 minut w zależności od liczby próbek, a czas pracy w czytniku płytek fluorescencyjnych wynosi 1 godzinę. Analiza danych może ponownie potrwać do 2 godzin, w zależności od wielkości próby.
Tutaj wybraliśmy dwa różne przykłady do zaprezentowania testu. W pierwszym przykładzie przedstawiamy dane, które porównują rozszczepienie MERS-CoV pochodzące od ludzi i wielbłądów za pośrednictwem furyny, aby ocenić potencjał szczepów pochodzących od wielbłądów do aktywacji u ludzi, jeśli przekroczą barierę gatunkową. W drugim przykładzie użyliśmy testu peptydów fluorogenicznych, aby określić rozszczepienie za pośrednictwem furyny miejsc S1 / S2 ' i S2 ' lub miejsca S2' odpowiednio dwóch szczepów FCoV serotypu I i dwóch serotypów II. W tych eksperymentach użyliśmy rozszczepienia trypsyny jako kontroli pozytywnej.

<table><tbody><tr><td>Peptydy</td><td>Biomatik</td><td>N/A</td> Furin NEB P8077S Trypsyna, Sigma-Aldrich z powłoką <td></td></tr><tr><td>TPCK</td><td></td><td>4352157-1KT</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini</td><td>XPS Urządzenia molekularne</td><td>XPS</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 6.5.1&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy Płytka</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa (lity polistyren z płaskim dnem i niepoddany obróbce)</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Rurki tłumiące światło</td><td>Watson Lab</td><td>131-915BL lub 131-915BR</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Wirusy otoczkowe, takie jak koronawirusy lub wirus grypy, wymagają proteolitycznego rozszczepienia swojego białka fuzyjnego, aby móc zainfekować komórkę gospodarza. Często wirusy wykazują tropizm komórkowy i tkankowy i są przystosowane do określonych proteaz komórkowych lub tkankowych. Co więcej, wirusy te mogą wprowadzać mutacje lub insercje do swojego genomu podczas replikacji, które mogą wpływać na rozszczepienie, a tym samym mogą przyczyniać się do adaptacji do nowego gospodarza. Tutaj przedstawiamy fluorogenny test rozszczepienia peptydów, który umożliwia szybkie badanie przesiewowe peptydów naśladujących miejsce cięcia białek fuzji wirusa. Technika ta jest bardzo elastyczna i może być stosowana do badania aktywności proteolitycznej pojedynczej proteazy na wielu różnych podłożach, a ponadto umożliwia również badanie aktywności wielu proteaz na jednym lub więcej substratach peptydowych. W tym badaniu użyliśmy peptydów naśladujących motywy miejsca cięcia białka kolca koronawirusa. Przetestowaliśmy koronawirusy bliskowschodniego zespołu oddechowego pochodzącego od ludzi i wielbłądów (MERS-CoV), aby wykazać, że pojedyncze i podwójne podstawienie w miejscu rozszczepienia może zmienić aktywność furyny i radykalnie zmienić wydajność rozszczepienia. Zastosowaliśmy również tę metodę w połączeniu z bioinformatyką do zbadania aktywności rozszczepienia furyny białek kolców koronawirusa kotów z różnych serotypów i szczepów. Ta metoda oparta na peptydach jest mniej pracochłonna i czasochłonna niż konwencjonalne metody stosowane do analizy aktywności proteolitycznej wirusów, a wyniki można uzyskać w ciągu jednego dnia.

W pierwszej części niniejszego badania zastosowano peptydy reprezentujące miejsce cięcia S2' trzech różnych białek S wirusa MERS-CoV: prototypowego ludzkiego szczepu EMC/2012 (Genbank AFS88936.1) oraz dwóch wybranych szczepów MERS-CoV pochodzących od wielbłądów, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) i Mor215 (Genbank AVN89324.1), wyizolowanych odpowiednio w Egipcie i Maroku (Tabela 1)16,18.
W porównaniu ze szczepem EMC/2012, miejsce cięcia S2' szczepu HKU205 posiada dwie mutacje w pozycjach P2 i P1', które mogą potencjalnie wpływać na jego rozpoznawanie przez furynę i zmieniać wydajność cięcia (Tabela 1). Ponadto chcieliśmy zbadać, czy i w jaki sposób każda pojedyncza mutacja znaleziona w szczepie HKU205 wpływa na cięcie przez furynę. W związku z tym uwzględniliśmy dwa peptydy, w których pojedyncze podstawienia wprowadzono do sekwencji peptydowej EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' oraz EMC/2012 mutS-I S2') (Tabela 1). Furyna była w stanie efektywnie przeciąć peptyd EMC/2012 z Vmax wynoszącym 6,3 ± 1,2 RFU/min, podczas gdy w przypadku użycia peptydu S2' szczepu HKU205 nie wykryto niemal żadnego cięcia (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Rysunek 1a). Badając peptyd EMC/2012 mutA-S S2', stwierdzono, że cięcie było silnie zredukowane w porównaniu z sekwencją typu dzikiego (Vmax 3,6 ± 1 RFU/min). Niemal nie zaobserwowano cięcia podczas testowania peptydu EMC/2012 mutS-I S2' (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (Rysunek 1a).
Niedawno zgłoszono izolaty MERS-CoV z Afryki Zachodniej, które są filogenetycznie odrębne od MERS-CoV znalezionego na Półwyspie Arabskim16. Jednym z niedawno opisanych izolatów jest szczep Mor213, który posiada leucynę zamiast argininy w pozycji P4 miejsca S2' (Tabela 1), co może potencjalnie wpływać na jego rozpoznawanie przez furynę i zmieniać wydajność cięcia. Nasz test peptydowy wykazał, że miejsce S2' szczepu Mor213 ulega jedynie minimalnemu cięciu w porównaniu z miejscem EMC/2012 (Rysunek 1b). Wartość Vmax dla peptydu Mor213 wynosi 1,0 ± 0,1.
W drugiej części niniejszego badania wykorzystaliśmy ten sam test peptydowy do oceny cięcia miejsc cięcia białka S FCoV zapośredniczonego przez furynę. Użyliśmy peptydów naśladujących miejsce cięcia S1/S2 dwóch wirusów FCoV serotypu I: FECV I And-4 (z laboratorium Whittakera) oraz FIPV I Black (Genbank AB088223.1). Wykorzystaliśmy również peptydy naśladujące miejsce S2' tych wirusów, a także dwóch szczepów FCoV serotypu II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) oraz FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (Tabela 1). Zazwyczaj cięcie przez furynę zachodzi, gdy w pozycjach P1 i P4 miejsca cięcia obecne są reszty zasadowe (arginina i lizyna). Sugeruje się, że mutacje w pozycjach P1, P4 i P1' zakłócają podatność na cięcie przez furynę, zmieniając tym samym wymagania proteolityczne białka (Tabela 1). Cięcie przez furynę zaobserwowano dla prototypowego peptydu S1/S2 FECV I And-4 S1/S2 (Vmax 100,36 ± 7,61 RFU/min), ale nie w zmutowanym peptydzie S1/S2 FIPV I Black S1/S2 (Vmax -1,37 ± 1,29 RFU/min) (Rycina 2A). Podobnie furyna była w stanie przeciąć prototypowy peptyd S2' FECV II 1683 S2' (Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), ale nie zmutowane peptydy S2' FECV I And-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV I Black S2' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) oraz FIPV II 1146 S2' (Vmax -0,36 ± 0,11 RFU/min) (Rycina 2B). Trypsynę wykorzystaliśmy jako kontrolę pozytywną cięcia peptydów i zaobserwowaliśmy cięcie trypsynowe we wszystkich użytych peptydach (Rycina dodatkowa 2).
<img alt="Tabela dopasowania sekwencji peptydów dla badania MERS-CoV, z zaznaczonymi na czerwono kluczowymi mutacjami." src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1">
Tabela 1. Wykorzystane peptydy i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe. Peptydy użyte w analizach zawierają parę FRET (7-metoksykumaryna-4-yl) acetylowy/2,4-dinitrofenylowy (MCA/DNP). Reszty argininy (R) w miejscach cięcia P4 i P1, rozpoznawane przez furynę, zaznaczono pogrubieniem. Reszty zaznaczone na czerwono odpowiadają mutacjom w stosunku do sekwencji referencyjnych.
<img alt="Wykres słupkowy aktywności enzymu furyny; analiza porównawcza Vmax RFU/min dla EMC/2012, HKU2, Mor213 S2'." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Proteolityczne cięcie fluorogennych peptydów miejsc S2' MERS-CoV pochodzenia ludzkiego i wielbłądziego za pośrednictwem furyny. A. Analiza cięcia przez furynę dla miejsca S2' ludzkiego MERS-CoV EMC/2012 oraz szczepu pochodzenia wielbłądziego HKU205 (podwójny mutant), wraz z wariantami pojedynczych mutantów EMC/2012 (mutA-S i mutS-I). B. Analiza cięcia przez furynę dla miejsca S2' ludzkiego MERS-CoV EMC/2012 oraz szczepu pochodzenia wielbłądziego Mor213. Dla paneli A i B, peptydy inkubowano z rekombinowaną furyną, a wzrost fluorescencji wynikający z przetwarzania proteolitycznego mierzono za pomocą fluorometru. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki reprezentują średnie Vmax z trzech niezależnych eksperymentów (n=3). Słupki błędów wskazują SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy aktywności enzymu furyny; porównanie Vmax (RFU/min); analiza próbek FECV i FIPV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Fluorogeniczne peptydy miejsc S1/S2 i S2' białka S FCoV poddawane proteolitycznemu cięciu zapśredniczonemu przez furynę. A. Test cięcia furyną w miejscach S1/S2 szczepów FECV I And-4 i FIPV I Black. Peptydy inkubowano z rekombinowaną furyną. B. Analiza cięcia przez furynę w obrębie miejsc S2' szczepów FECV I And-4, FIPV I Black, FECV II 1683 oraz FIPV II 1146. Wzrost fluorescencji wynikający z przetwarzania proteolitycznego mierzono za pomocą fluorometru. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiają średnie wartości Vmax z trzech niezależnych eksperymentów (n=3). Słupki błędów oznaczają SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Wartości Vmax użyte do Rysunku 1 i Rysunku 2. Wartości Vmax zostały obliczone z wykresów, zgodnie z ilustracją na uzupełniającym Rysunku 1 oraz opisem w sekcji 4 protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rycina dodatkowa 1: Ilustracja surowych danych pochodzących z oprogramowania czytnika płytek. Wykresy wzrostu fluorescencji w czasie, które zostały wykorzystane do wyznaczenia Vmax. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurę.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Trypsynowo zapośrednicowane cięcie proteolityczne peptydów fluorogennych w miejscach S1/S2 i S2' białka S FCoV. Test cięcia trypsyną w miejscach S1/S2 dla FECV I And-4 i FIPV I Black oraz w miejscach S2' dla FECV I And-4, FIPV I Black, FECV II 1683 i FIPV II 1146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.</a>

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii, takie jak proteolityczna modyfikacja białek, a także charakterystyka inhibitorów i proteaz oraz peptydaz. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach, reprezentujących stronę rozszczepienia danego białka. Zastosowanie tutaj polega na badaniu proteaz, które aktywują fuzję wirusa.Pierwszym krokiem w projektowaniu peptydów jest pozyskanie sekwencji białka fuzyjnego z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI lub bazy danych patogenów wirusów. Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy przed peptydem fuzyjnym i uwzględnij dwa do trzech aminokwasów przed i za tą sekwencją. Zamawiając peptyd, zmodyfikuj go za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencji lub pary FRET, Mca na końcu i Dnp na końcu c.Podczas testu Mca jest wzbudzany i emituje energię świetlną, która jest gaszona przez Dnp, o ile para znajduje się w bliskiej odległości od siebie. Jeśli jednak dojdzie do rozszczepienia, Dnp nie będzie w stanie wygasić emisji, która może być następnie odczytana przez czytnik płytek fluorescencyjnych. Zawiesić peptyd zgodnie z zaleceniami producenta, delikatnie pipetując w górę iw dół.Na przykład ponownie zawiesić w 70% etanolu do końcowego stężenia jednego milimola. Jeśli peptyd nie ulega zbyt dobremu zawieszeniu przez pipetowanie, należy umieścić probówkę zawierającą peptyd i rozpuszczalnik w kąpieli sonizacyjnej do momentu całkowitego zawieszenia. Dozować 100 mikrolitrów podwielokrotności peptydu do probówek zwilżających światło lub odpornych, aby chronić peptyd przed bieleniem.Przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozpocznij tę procedurę od włączenia czytnika płytek i poczekania, aż autotest zostanie zakończony. Następnie otwórz oprogramowanie operacyjne na podłączonym komputerze i upewnij się, że jest ono połączone z czytnikiem płytek.Otwórz ustawienie temperatury i ustaw je na wymaganą temperaturę, aby uzyskać optymalną wydajność proteazy, która w tym przypadku wynosi 30 stopni Celsjusza. Aby skonfigurować eksperyment, kliknij na ustawienie przyrządu kontrolnego, wybierz kinetyczne, a następnie wybierz fluorescencję. Wprowadź długość fali wzbudzenia 330 nanometrów i długość fali emisji 390 nanometrów.Odznacz automatyczne wyłączanie i wybierz średnią/normalną czułość. Wybierz czas trwania testu wynoszący jedną godzinę i wybierz jeden pomiar co 60 sekund. Ustaw pięć sekund mieszania przed pierwszym pomiarem i trzy sekundy przed każdym pomiarem.Na koniec wybierz studnie do odczytania. Przygotować odpowiednie do oznaczania proteaz zgodnie z opisem w protokole tekstowym i schłodzić na lodzie. Umieść solidną, czarną, nieobrobioną płaską płytką z płaskim dnem na lodzie z cienką metalową płytką pod spodem, aby wspomóc chłodzenie i stabilność.Konieczne jest użycie czarnej płytki jako płytki testowej, aby zapobiec wyciekom fluorescencyjnym z sąsiednich studzienek. Dla każdego peptydu należy przygotować trzy kontrpróby techniczne na test o łącznej objętości 100 mikrolitrów na próbkę. Odpipetować odpowiednią ilość buforu do oznaczania do każdego dołka płytki testowej.Dodaj 0,5 mikrolitra proteazy do każdej studzienki. Do sześciu studzienek dodaj 0,5 mikrolitra buforu zamiast odpowiedniej proteazy. Trzy z nich będą ślepymi kontrolami, a pozostałe trzy będą kontrolami peptydowymi.Dodaj pięć mikrolitrów peptydu do końcowego stężenia 50 mikromolowych do każdej studzienki, z wyjątkiem ślepych kontroli. Do każdej z trzech ślepych studzienek kontrolnych dodaj pięć mikrolitrów buforu zamiast peptydu. Włóż płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i kliknij start.Przed rozpoczęciem analizy danych zapisz plik eksperymentu. Kliknij eksport i wyeksportuj plik jako txt. Zaimportuj plik txt do arkusza kalkulacyjnego.Rozpocznij analizę od utworzenia wykresu, wykreślając względne jednostki fluorescencyjne na osi y w funkcji czasu na osi x dla każdej kontrpróby technicznej na próbkę. Wybierz zakres danych, w którym wykres znajduje się w zakresie liniowym i znajduje się najbliżej początku wzrostu fluorescencji. Wykreśl wybrane dane na drugim wykresie i dodaj liniową linię trendu.W opcjach linii trendu wybierz opcję wyświetl równanie na wykresie. Równanie pokaże V max, co odpowiada nachyleniu linii trendu. Obliczyć średnią V max dla każdej próbki z trzech kontrprób technicznych.Po powtórzeniu eksperymentu jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać trzy kontrpróby biologiczne, należy obliczyć odchylenie standardowe na podstawie danych z trzech niezależnych kontrprób biologicznych. Test rozszczepienia furyny ludzkiego koronawirusa MERS, głównego miejsca EMC/2012 S2 i podwójnie zmutowanego szczepu HKU205 pochodzącego z wielbłąda, wraz z pojedynczymi zmutowanymi wariantami EMC/2012 ujawnił, że peptyd EMC/2012 został skutecznie rozszczepiony, podczas gdy prawie nie doszło do rozszczepienia głównego peptydu S2 HKU205. Rozszczepienie zmutowanego peptydu S2 S2 z mutacją EMC/2012 A-S było silnie zmniejszone, a rozszczepienie peptydu pierwszego EMC/2012 S do I z mutacją I było prawie żadne.Inny test rozszczepienia furyny wykazał tylko minimalne rozszczepienie głównego miejsca Maroko 213 S2 pochodzącego od wielbłąda, w porównaniu z ludzkim koronawirusem MERS, głównym miejscem EMC/2012 S2. Rozszczepienie furyny obserwowano dla prototypowego peptydu S1/S2, FECV I i 4 S1/S2, ale nie w zmutowanym peptydzie S1/S2, FIPV I Black S1/S2. Podobnie, furyna była w stanie rozszczepić prototypowy peptyd S2 prime, FECV II 1683 S2 prime, ale nie zmutowane peptydy S2 prime, FECV I i 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime i FIPV II 1146 S2 prime.Po tej procedurze można przeprowadzić analizę western blot lub testy aminofluorescencyjne przy użyciu białka o pełnej długości w celu sprawdzenia rozszczepienia białka lub w tym przypadku, czy rozszczepienie skutkuje fuzogenną wersją białka fuzyjnego wirusa.

a-fluorogenic-peptide-cleavage-assay-to-screen-for-proteolytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do szybkich badań aktywności proteolitycznej proteaz aktywujących białka fuzyjne wirusów. Metoda wykorzystuje pary FRET do wykrywania rozszczepienia.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa (Wideo) | JoVE Journal

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Przeglądaj więcej filmów