Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii, takie jak proteolityczna modyfikacja białek, a także charakterystyka inhibitorów i proteaz oraz peptydaz. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach, reprezentujących stronę rozszczepienia danego białka. Zastosowanie tutaj polega na badaniu proteaz, które aktywują fuzję wirusa.

Pierwszym krokiem w projektowaniu peptydów jest pozyskanie sekwencji białka fuzyjnego z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI lub bazy danych patogenów wirusów. Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy przed peptydem fuzyjnym i uwzględnij dwa do trzech aminokwasów przed i za tą sekwencją. Zamawiając peptyd, zmodyfikuj go za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencji lub pary FRET, Mca na końcu i Dnp na końcu c.

Podczas testu Mca jest wzbudzany i emituje energię świetlną, która jest gaszona przez Dnp, o ile para znajduje się w bliskiej odległości od siebie. Jeśli jednak dojdzie do rozszczepienia, Dnp nie będzie w stanie wygasić emisji, która może być następnie odczytana przez czytnik płytek fluorescencyjnych. Zawiesić peptyd zgodnie z zaleceniami producenta, delikatnie pipetując w górę iw dół.

Na przykład ponownie zawiesić w 70% etanolu do końcowego stężenia jednego milimola. Jeśli peptyd nie ulega zbyt dobremu zawieszeniu przez pipetowanie, należy umieścić probówkę zawierającą peptyd i rozpuszczalnik w kąpieli sonizacyjnej do momentu całkowitego zawieszenia. Dozować 100 mikrolitrów podwielokrotności peptydu do probówek zwilżających światło lub odpornych, aby chronić peptyd przed bieleniem.

Przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozpocznij tę procedurę od włączenia czytnika płytek i poczekania, aż autotest zostanie zakończony. Następnie otwórz oprogramowanie operacyjne na podłączonym komputerze i upewnij się, że jest ono połączone z czytnikiem płytek.

Otwórz ustawienie temperatury i ustaw je na wymaganą temperaturę, aby uzyskać optymalną wydajność proteazy, która w tym przypadku wynosi 30 stopni Celsjusza. Aby skonfigurować eksperyment, kliknij na ustawienie przyrządu kontrolnego, wybierz kinetyczne, a następnie wybierz fluorescencję. Wprowadź długość fali wzbudzenia 330 nanometrów i długość fali emisji 390 nanometrów.

Odznacz automatyczne wyłączanie i wybierz średnią/normalną czułość. Wybierz czas trwania testu wynoszący jedną godzinę i wybierz jeden pomiar co 60 sekund. Ustaw pięć sekund mieszania przed pierwszym pomiarem i trzy sekundy przed każdym pomiarem.

Na koniec wybierz studnie do odczytania. Przygotować odpowiednie do oznaczania proteaz zgodnie z opisem w protokole tekstowym i schłodzić na lodzie. Umieść solidną, czarną, nieobrobioną płaską płytką z płaskim dnem na lodzie z cienką metalową płytką pod spodem, aby wspomóc chłodzenie i stabilność.

Konieczne jest użycie czarnej płytki jako płytki testowej, aby zapobiec wyciekom fluorescencyjnym z sąsiednich studzienek. Dla każdego peptydu należy przygotować trzy kontrpróby techniczne na test o łącznej objętości 100 mikrolitrów na próbkę. Odpipetować odpowiednią ilość buforu do oznaczania do każdego dołka płytki testowej.

Dodaj 0,5 mikrolitra proteazy do każdej studzienki. Do sześciu studzienek dodaj 0,5 mikrolitra buforu zamiast odpowiedniej proteazy. Trzy z nich będą ślepymi kontrolami, a pozostałe trzy będą kontrolami peptydowymi.

Dodaj pięć mikrolitrów peptydu do końcowego stężenia 50 mikromolowych do każdej studzienki, z wyjątkiem ślepych kontroli. Do każdej z trzech ślepych studzienek kontrolnych dodaj pięć mikrolitrów buforu zamiast peptydu. Włóż płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i kliknij start.

Przed rozpoczęciem analizy danych zapisz plik eksperymentu. Kliknij eksport i wyeksportuj plik jako txt. Zaimportuj plik txt do arkusza kalkulacyjnego.

Rozpocznij analizę od utworzenia wykresu, wykreślając względne jednostki fluorescencyjne na osi y w funkcji czasu na osi x dla każdej kontrpróby technicznej na próbkę. Wybierz zakres danych, w którym wykres znajduje się w zakresie liniowym i znajduje się najbliżej początku wzrostu fluorescencji. Wykreśl wybrane dane na drugim wykresie i dodaj liniową linię trendu.

W opcjach linii trendu wybierz opcję wyświetl równanie na wykresie. Równanie pokaże V max, co odpowiada nachyleniu linii trendu. Obliczyć średnią V max dla każdej próbki z trzech kontrprób technicznych.

Po powtórzeniu eksperymentu jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać trzy kontrpróby biologiczne, należy obliczyć odchylenie standardowe na podstawie danych z trzech niezależnych kontrprób biologicznych. Test rozszczepienia furyny ludzkiego koronawirusa MERS, głównego miejsca EMC/2012 S2 i podwójnie zmutowanego szczepu HKU205 pochodzącego z wielbłąda, wraz z pojedynczymi zmutowanymi wariantami EMC/2012 ujawnił, że peptyd EMC/2012 został skutecznie rozszczepiony, podczas gdy prawie nie doszło do rozszczepienia głównego peptydu S2 HKU205. Rozszczepienie zmutowanego peptydu S2 S2 z mutacją EMC/2012 A-S było silnie zmniejszone, a rozszczepienie peptydu pierwszego EMC/2012 S do I z mutacją I było prawie żadne.

Inny test rozszczepienia furyny wykazał tylko minimalne rozszczepienie głównego miejsca Maroko 213 S2 pochodzącego od wielbłąda, w porównaniu z ludzkim koronawirusem MERS, głównym miejscem EMC/2012 S2. Rozszczepienie furyny obserwowano dla prototypowego peptydu S1/S2, FECV I i 4 S1/S2, ale nie w zmutowanym peptydzie S1/S2, FIPV I Black S1/S2. Podobnie, furyna była w stanie rozszczepić prototypowy peptyd S2 prime, FECV II 1683 S2 prime, ale nie zmutowane peptydy S2 prime, FECV I i 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime i FIPV II 1146 S2 prime.

Po tej procedurze można przeprowadzić analizę western blot lub testy aminofluorescencyjne przy użyciu białka o pełnej długości w celu sprawdzenia rozszczepienia białka lub w tym przypadku, czy rozszczepienie skutkuje fuzogenną wersją białka fuzyjnego wirusa.