Name: Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida albicans za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego bez konieczności oczyszczania mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium NC są wspierane przez grant National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 oraz grant New Jersey Health Foundation (NJHF), #PC40-18.

UWAGA: Szczegółowy protokół etapowy testu jest opisany poniżej, a schematyczny protokół jest pokazany w Rysunek 1.
1. Szczepy C. albicans i warunki wzrostu
<ol>
	<li>Szczepy C. albicans należy hodować w płynnym podłożu z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) w temperaturze 30 °C w wytrząsarce inkubatora przez noc. 
	UWAGA: Utrzymuj szczepy Candida jako zamrożone zapasy i rosną na agarze YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy i 2% agaru).</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do oznaczania w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W celu oznaczenia funkcji mitochondriów rozpuścić 1,04 g proszku Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 i 2 g glukozy (2%) w 90 ml sterylnej wody i ogrzać pożywkę do 37 °C. Dostosować pH do 7,4 za pomocą 5 M NaOH i uzupełnić objętość do 100 ml sterylną wodą.</li>
		<li>W przypadku testu stresu glikolitycznego rozpuścić 1,04 g samego proszku RPMI 1640 w 90 ml sterylnej wody, ogrzać pożywkę do 37 °C i dostosować pH do 7,4. Uzupełnić objętość do objętości 100 ml sterylną wodą. Proszek RPMI 1640 nie zawiera wodorowęglanów, co ma kluczowe znaczenie dla monitorowania zmiany pH jako miary glikolizy podczas testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Związki iniekcyjne.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M bulion glukozy w sterylnej wodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 100 mM zapasu oligomycyny w dimetylosulfotlenku (DMSO), podwielokrotność w małych objętościach i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 100 mM antymycyny A w DMSO, porcję w małych objętościach i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 100 mM zapasu SHAM (kwasu salicylohydroksaminowego) w etanolu w dniu oznaczenia.</li>
		<li>Przygotować 1 M KCN w sterylnej wodzie w dniu testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Powlekanie płytki testowej poli-D-lizyną (PDL)
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w okapie laminarnym.
<ol>
	<li>Rozpuść poli-D lizynę w wodzie klasy do hodowli tkankowej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg / ml. Dobrze wymieszać i podwielokrotność porcji do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez długi czas. 
	UWAGA: Potrzeba 50 μl na studzienkę, a na 24 dołki wymagane jest 1,2 ml. W związku z tym należy podać co najmniej 1,3 ml na probówkę do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 50 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej pod przykryciem przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Odessać roztwór i spłukać jednorazowo 500 μl sterylnej wody do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Otwórz pokrywę i pozostaw studzienki do wyschnięcia na powietrzu. Płytkę należy zużyć tego samego dnia lub przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2-3 dni.</li>
</ol>
4. Nawodnienie wkładu czujnika
UWAGA: Wykonaj ten krok dzień przed eksperymentem.
<ol>
	<li>Otwórz dodatkowy zestaw do oznaczania topnika i usuń zawartość. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki znamionowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej 1 ml kalibru i umieść wkład czujnika z powrotem. Upewnij się, że czujniki zawierające fluorofory (do pomiaru tlenu i pH) są zanurzone w kalibrze.</li>
	<li>Inkubować wkład czujnika przez noc w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Uprawa i wysiewanie komórek na płytkach pokrytych PDL
<ol>
	<li>Zaszczepić C. albicans w bulionie YPD i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. 
	UWAGA: W oparciu o projekt testu i zainteresowanie, C. albicans może być również uprawiany w YPG lub na minimalnym podłożu.</li>
	<li>W dniu badania rozcieńczyć odpowiednią liczbę komórek w pożywce do oznaczania, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na 100 μl.</li>
	<li>Dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek do każdego dołka płytki testowej, z wyjątkiem studzienek A1, B4, C3 i D6, do których dodaje się tylko 100 μl pożywki do oznaczania w celu korekcji tła (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora niezawierającegoCO2 w temperaturze 37 °C i inkubować przez 60 minut, co pozwoli komórkom przylgnąć do powierzchni płytki.</li>
</ol>
6. Protokół testu
UWAGA: Opisany tutaj protokół dotyczy formatu 24-dołkowego instrumentu. Woluminy będą musiały zostać dostosowane, jeśli używany jest inny format.
<ol>
	<li>Test funkcji mitochondriów
	<ol>
		<li>Przygotowanie związków
		<ol>
			<li>Przygotuj związki o stężeniu 10x do oznaczania funkcji mitochondriów: Przygotuj 20 mM SHAM, 100 μM oligomycyny, 100 mM KCN i 20 μM antymycyny A w odpowiednim podłożu testowym.</li>
			<li>Dodaj 50 μl SHAM do portu A, 55 μl oligomycyny do portu B, 62 μl KCN do portu C i 68 μl antymycyny A do portu D (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test stresu glikolitycznego
	<ol>
		<li>Przygotowanie związków
		<ol>
			<li>Przygotuj związki o stężeniu 10x do testu stresu glikolitycznego. Przygotować 100 mM glukozy, 100 μM oligomycyny, 500 mM 2-deoksyglukozy (2DG) i 20 μM antymycyny A w odpowiednim pożywce do oznaczania.</li>
			<li>Dodaj 50 μl glukozy do portu A, 55 μl oligomycyny do portu B, 62 μl 2-DG do portu C i 68 μl antymycyny A do portu D.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj dodatkowy analizator strumienia, który mierzy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) żywych komórek w formacie 24-dołkowej płytki. Przygotuj protokół testu z wyprzedzeniem.</li>
	<li>Otwórz dodatkowy analizator strumienia i skonfiguruj szablon testu za pomocą karty kreatora testu, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby wypełnić wszystkie informacje, które pojawią się podczas instalacji. Wygeneruj układ grupy w sposób podobny do pokazanego w Rysunek 5. Skonfiguruj protokół, jak pokazano w Tabeli 1. Skonfiguruj te układy z dużym wyprzedzeniem przed testem i zapisz je w komputerze. W momencie testu przywróć zapisany protokół, otwierając odpowiedni plik w opcji otwórz plik w zakładce kreatora testu (Rysunek 5).</li>
	<li>Załaduj 10x związki do odpowiednich portów uwodnionego wkładu czujnika zawierającego kalibert i załaduj do tacy nośnej dodatkowego analizatora strumienia. Rozpocznij kalibrację, naciskając przycisk Start na ekranie.</li>
	<li>Delikatnie dodać 350 μl pożywki do oznaczania na płytkę komórkową wzdłuż boku studzienek, aby zminimalizować zakłócenia komórek i doprowadzić końcową objętość do 450 μl.</li>
	<li>Zastąp tabliczkę użytkową zawierającą kaliber płytką testową i kontynuuj.</li>
	<li>Wyjmij wkład czujnika i płytkę po zakończeniu testu. Zapisz plik w odpowiednim folderze docelowym.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj obszaru pod zakładką analizy krzywej wariancji (AUC-ANOVA) w oprogramowaniu, aby obliczyć istotną różnicę między grupami, wybierając odpowiednie parametry (OCR lub ECAR), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 6.</li>
	<li>Wybierz grupy, które chcesz porównać.</li>
	<li>Dodaj do grup analiz dla ANOVA i kliknij przycisk Ok. 
	UWAGA: Ta analiza AUC ANOVA doda nowy arkusz do pliku, w którym AUC jest obliczane dla każdej grupy i porównywane między nimi przez ANOVA. Spowoduje to wyświetlenie tabeli wartości p, aby pokazać istotność.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li>
<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
<li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Value+in+Health%22%5BJournal%5D)">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li>
<li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+candidemia%3A+risk+factors+and+attributable+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
<li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li>
<li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+fungal+pathogenesis%3A+drug+tolerance%2C+virulence%2C+and+potential+for+antifungal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li>
<li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li>
<li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li>
<li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li>
<li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li>
<li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocytes+govern+the+transcriptional+response%2C+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li>
<li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li>
<li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li>
<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Test dodatkowego strumienia bioenergetycznego służy jako doskonałe narzędzie do odczytywania funkcji mitochondriów poprzez pomiar zużycia tlenu zależnego od fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w czasie rzeczywistym. Ponadto funkcja glikolityczna, która jest mierzona jako szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (zmiana pH zewnątrzkomórkowego), może być również badana w tym samym czasie w analizie w czasie rzeczywistym.
Pomyślne posiew C. albicans na płytce testowej jest jednym z krytyc...

Inwazyjne infekcje grzybicze zabijają ponad 1,5 miliona ludzi rocznie na całym świecie. Liczba ta rośnie ze względu na wzrost liczby osób żyjących z obniżoną odpornością, w tym osób starszych, wcześniaków, biorców przeszczepów i pacjentów z rakiem1. C. albicans jest oportunistycznym ludzkim patogenem grzybiczym, który jest częścią ludzkiej mikroflory. Zamieszkuje również powierzchnie błon śluzowych i przewód pokarmowy jako organizm komensalny. C. albicans powoduje poważną chorobę ogólnoustrojową u osób z niedoborami odporności, które przeszły operację lub były leczone długimi cyklami antybiotyków. Gatunek Candida plasuje się wśród trzech do czterech głównych przyczyn szpitalnych chorób zakaźnych (NID) u ludzi2,3,4,5,6,7. Szacuje się, że roczna globalna liczba zakażeń krwią Candida wynosi ~ 400 000 przypadków, z towarzyszącą śmiertelnością 46-75%1. Roczna śmiertelność z powodu kandydozy wynosi około 10 000 w samych Stanach Zjednoczonych. Zasięg NID powodowanego przez grzyby znajduje również odzwierciedlenie w astronomicznych wydatkach pacjentów5. W Stanach Zjednoczonych roczne wydatki na leczenie inwazyjnych infekcji grzybiczych przekraczają 2 miliardy dolarów, co stanowi ogromne obciążenie dla i tak już przeciążonego systemu opieki zdrowotnej. Obecnie dostępne standardowe terapie przeciwgrzybicze są ograniczone ze względu na toksyczność, coraz bardziej rozpowszechnioną lekooporność i interakcje między lekami. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych celów dla leków przeciwgrzybiczych, które zaowocują lepszymi opcjami leczenia dla pacjentów wysokiego ryzyka. Jednak odkrycie nowych leków działających na cele grzybów jest skomplikowane, ponieważ grzyby są eukariontami. To znacznie ogranicza liczbę celów leków specyficznych dla grzybów.
Ostatnie badania wykazały, że mitochondria są kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do zjadliwości grzybów i tolerancji na leki przeciwgrzybicze, ponieważ mitochondria są ważne dla oddychania komórkowego, metabolizmu oksydacyjnego, transdukcji sygnału i apoptozy8,9,10,11. Zarówno metabolizm glikolityczny jak i nieglikolityczny są niezbędne do przetrwania C. albicans u ssaków host12,13,14,15,16. Ponadto wykazano, że kilka mutantów C. albicans pozbawionych białek mitochondrialnych, takich jak Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 itp., jest wadliwych w filamentacji, co jest ważnym czynnikiem wirulencji C. albicans17,18,19,20,21,22. Ponadto wykazano również, że mutanty te są atenuowane pod kątem zjadliwości w mysim modelu rozsianej kandydozy17,18,19,20,21,22. W związku z tym mitochondria grzybów stanowią atrakcyjny cel dla odkrywania leków. Jednak badanie funkcji mitochondriów u C. albicans jest trudne, ponieważ C. albicans jest drobno ujemny23, co oznacza, że nie może przetrwać bez genomu mitochondrialnego.
Tutaj opisujemy protokół, który może być wykorzystany do badania funkcji mitochondriów i glikolitycznych u C. albicans bez potrzeby oczyszczania mitochondriów. Metodę tę można również zoptymalizować w celu zbadania wpływu manipulacji genetycznej lub modulatorów chemicznych na szlaki mitochondrialne i glikolityczne u C. albicans.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw naprężeń Mito</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Santa Cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy kultur tkankowych</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kalibru do oznaczania XF</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Pepton Dekstroza</td><td>Fisher scientific,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Pepton Dekstroza Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Pepton Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie bioenergetyczne candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria są niezbędnymi organellami dla metabolizmu komórkowego i przetrwania. W mitochondriach zachodzi wiele kluczowych zdarzeń, takich jak oddychanie komórkowe, metabolizm oksydacyjny, transdukcja sygnału i apoptoza. W związku z tym doniesiono, że dysfunkcja mitochondriów odgrywa ważną rolę w tolerancji leków przeciwgrzybiczych i zjadliwości grzybów chorobotwórczych. Ostatnie dane doprowadziły również do uznania znaczenia mitochondriów jako ważnego czynnika przyczyniającego się do patogenezy grzybów. Pomimo znaczenia mitochondriów w biologii grzybów, ustandaryzowane metody zrozumienia ich funkcji są słabo rozwinięte. W tym miejscu przedstawiamy procedurę badania podstawowego wskaźnika zużycia tlenu (OCR), miary oddychania mitochondrialnego i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), miary funkcji glikolitycznej w szczepach C. albicans. Opisana w niniejszym dokumencie metoda może być stosowana do dowolnych szczepów Candidaspp. bez konieczności oczyszczania mitochondriów z nienaruszonych komórek grzybów. Co więcej, protokół ten można również dostosować do badań przesiewowych pod kątem inhibitorów funkcji mitochondriów w szczepach C. albicans.

Celem niniejszego protokołu jest określenie funkcji bioenergetycznych C. albicans ocenianych za pomocą analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego. W badaniu uwzględniono również mutant C. albicans pozbawiony białka mitochondrialnego Mam3 wraz z jego szczepem komplementarnym mam3Δ/Δ::MAM3, aby zbadać wpływ delecji białka mitochondrialnego na OCR i ECAR. Gen MAM3 koduje przypuszczalne kwaśne białko macierzy mitochondrialnej, którego funkcja w Candida</...

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Protokół ten ma znaczenie dla określenia funkcji glikolitycznej i oddychania mitochondrialnego u Candida albicans. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar funkcji mitochondriów bez konieczności oczyszczania mitochondriów z Candida albicans. Metodę tę można zoptymalizować w celu zbadania wpływu manipulacji genetycznych lub modulatorów chemicznych na szlaki mitochondrialne i glikolityczne w Candida albicans lub innych patogenach grzybiczych.Ta technika jest stosunkowo prosta. Lub w zależności od organizmu, ich stosowanie może pomóc w optymalizacji liczby komórek i stężenia inhibitorów mitochondriów w ich teście. W okapie z przepływem laminarnym rozpuść poli-D-lizynę w wodzie z siatki tkankowej do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr.Dobrze wymieszaj roztwór i podziel go na 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych, upewniając się, że porcja co najmniej 1,3 mililitra na probówkę. Dodać 50 mikrolitrów tej mieszaniny do każdego dołka płytki testowej, przykryć pokrywkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Następnie odessać roztwór.Przepłukać studzienki płytki testowej raz 500 mikrolitrami sterylnej wody do hodowli tkankowych, otworzyć pokrywę i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu. Jeśli nie używasz płytki w dniu, w którym jest przygotowywana, przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie dwa do trzech dni. Dzień przed eksperymentem otwórz dodatkowy zestaw do oznaczania topnika i usuń zawartość.Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej. Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej jednym mililitrem kalibru, a następnie umieść wkład czujnika z powrotem. Upewnij się, że czujniki zawierające fluorofory są zanurzone w kalibrze.Inkubuj wkład czujnika w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez noc. Dzień przed testem zaszczepić przygotowane C albicans w bulionie YPD i rosnąć przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. W dniu przeprowadzenia testu należy rozcieńczyć odpowiednią liczbę komórek w pożywce do oznaczania, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na 100 mikrolitrów.Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do każdej studzienki płytki testowej z wyjątkiem dołków A1, B4, C3, a D6.To tych dołkach dodaj tylko 100 mikrolitrów pożywki testowej w celu korekcji tła. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby komórki przylegały do powierzchni płytki. Przygotować związki do testu funkcji mitochondriów przy stężeniu 10X w odpowiednim podłożu testowym, jak opisano w protokole tekstowym.Dodaj 50 mikrolitrów SHAM do portu A, 50 mikrolitrów oligomycyny do portu B, 62 mikrolitry cyjanku potasu do portu C i 68 mikrolitrów antymycyny A do portu D. Następnie przygotuj związki do testu stresu glikolitycznego w stężeniu 10X w odpowiednim podłożu testowym, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj 50 mikrolitrów glukozy do portu A, 55 mikrolitrów oligomycyny do portu B, 62 mikrolitry 2-DG do portu C i 68 mikrolitrów antymycyny A do portu D. Przed testem otwórz dodatkowy analizator strumienia i skonfiguruj szablon testu za pomocą karty kreatora testu. Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku i wypełnij wszystkie informacje, które pojawiają się podczas konfiguracji.Wygeneruj układ grupy i skonfiguruj protokół zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zapisz te układy przed testem. W czasie testu przywróć zapisany protokół, otwierając odpowiedni plik w opcji otwórz plik w zakładce kreatora testu.Następnie załaduj związki 10X do odpowiednich portów uwodnionego wkładu czujnika zawierającego kalibert. Załaduj wkład czujnika do tacki nośnej dodatkowego analizatora strumienia. Rozpocznij kalibrację, klikając przycisk Start na ekranie.Następnie delikatnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki testowej do płytki komórkowej wzdłuż boku ścianek, aby zminimalizować zakłócenia komórek, doprowadzając końcową objętość do 450 mikrolitrów. Zastąp tabliczkę użytkową zawierającą kaliber tabliczką testową i kontynuuj test. Po zakończeniu testu wyjmij wkład czujnika i płytkę.Zapisz plik w odpowiednim folderze docelowym. W tym badaniu funkcje bioenergetyczne C albicans są oceniane za pomocą dodatkowego analizatora strumienia. Mutant pozbawiony białka mitochondrialnego mam33 jest również uwzględniany wraz ze szczepem dopełniacza w celu zbadania wpływu delecji białka mitochondrialnego na szybkość zużycia tlenu i wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.Dziki typ C albicans wykazuje wskaźnik zużycia tlenu wynoszący 145 pikomoli na minutę, co mieści się w optymalnym zakresie dla każdego testu przepływu zewnątrzkomórkowego. Podstawowy wskaźnik zużycia tlenu w szczepach typu dzikiego, zmutowanych mam33 i uzupełnionych mam33 nie wykazuje różnic. Podobnie, nie obserwuje się istotnych różnic w podstawowych wskaźnikach zakwaszenia zewnątrzkomórkowego między szczepami.Jednak poprzez hamowanie kompleksu IV cyjankiem potasu, typem dzikim i mutantem mam33, szczepy uzupełnione mam33 wykazują znaczne przesunięcie w kierunku glikolizy. Zmutowany szczep mam33 nie wykazał jednak kompensacyjnego przesunięcia glikolitycznego, co sugeruje, że szlak zależny od związku IV jest upośledzony w tym szczepie. W glikolitycznym teście wysiłkowym komórki są pozbawione glukozy przez godzinę i mierzy się podstawowy wskaźnik zużycia tlenu oraz stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.Po wygłodzeniu zmutowany szczep mam33 wykazuje znacznie niższe zużycie tlenu i wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z innymi szczepami. Sugeruje to upośledzone wykorzystanie glukozy zarówno do oddychania, jak i glikolizy, gdy komórki są zmuszone do stanu głodu. Po wstrzyknięciu glukozy wszystkie szczepy wykazują stymulację zarówno tempa zużycia tlenu, jak i tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.Powłoka płytki testowej umożliwia przyleganie komórek Candida albicans do płytki. Niewłaściwe przyleganie komórek Candida albicans będzie miało wpływ na wynik testu. Po opracowaniu tej techniki została ona zastosowana w szerokim zakresie typów komórek i chorób, odpowiadając na to, jak mitochondria funkcjonują w stanach fizjologicznych i patologicznych.Na przykład, wykorzystując w tym teście komórki pochodzące od pacjenta i kontrolne, możliwe jest rozwiązanie konkretnych pytań dotyczących tego, w jaki sposób zmienia się funkcja mitochondriów. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania inhibitorów mitochondriów, takich jak cyjanek potasu i antymycyna A, ponieważ związki te są niezwykle trujące.

bio-energetics-investigation-candida-albicans-using-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Nadużywanie alkoholu osłabia odporność makrofagów pęcherzykowych (AM) z powodu stłumionego oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki. Niedawno wykazaliśmy, że ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa zależność od glutaminy w oddychaniu mitochondrialnym u AM. W niniejszym artykule przedstawiono metody określania zastosowania glutaminy do oddychania mitochondrialnego w AM traktowanych EtOH przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida albicans za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego bez konieczności oczyszczania mitochondriów.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów