Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Protokół ten ma znaczenie dla określenia funkcji glikolitycznej i oddychania mitochondrialnego u Candida albicans. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar funkcji mitochondriów bez konieczności oczyszczania mitochondriów z Candida albicans. Metodę tę można zoptymalizować w celu zbadania wpływu manipulacji genetycznych lub modulatorów chemicznych na szlaki mitochondrialne i glikolityczne w Candida albicans lub innych patogenach grzybiczych.

Ta technika jest stosunkowo prosta. Lub w zależności od organizmu, ich stosowanie może pomóc w optymalizacji liczby komórek i stężenia inhibitorów mitochondriów w ich teście. W okapie z przepływem laminarnym rozpuść poli-D-lizynę w wodzie z siatki tkankowej do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr.

Dobrze wymieszaj roztwór i podziel go na 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych, upewniając się, że porcja co najmniej 1,3 mililitra na probówkę. Dodać 50 mikrolitrów tej mieszaniny do każdego dołka płytki testowej, przykryć pokrywkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Następnie odessać roztwór.

Przepłukać studzienki płytki testowej raz 500 mikrolitrami sterylnej wody do hodowli tkankowych, otworzyć pokrywę i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu. Jeśli nie używasz płytki w dniu, w którym jest przygotowywana, przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie dwa do trzech dni. Dzień przed eksperymentem otwórz dodatkowy zestaw do oznaczania topnika i usuń zawartość.

Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej. Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej jednym mililitrem kalibru, a następnie umieść wkład czujnika z powrotem. Upewnij się, że czujniki zawierające fluorofory są zanurzone w kalibrze.

Inkubuj wkład czujnika w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez noc. Dzień przed testem zaszczepić przygotowane C albicans w bulionie YPD i rosnąć przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. W dniu przeprowadzenia testu należy rozcieńczyć odpowiednią liczbę komórek w pożywce do oznaczania, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na 100 mikrolitrów.

Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do każdej studzienki płytki testowej z wyjątkiem dołków A1, B4, C3, a D6.To tych dołkach dodaj tylko 100 mikrolitrów pożywki testowej w celu korekcji tła. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby komórki przylegały do powierzchni płytki. Przygotować związki do testu funkcji mitochondriów przy stężeniu 10X w odpowiednim podłożu testowym, jak opisano w protokole tekstowym.

Dodaj 50 mikrolitrów SHAM do portu A, 50 mikrolitrów oligomycyny do portu B, 62 mikrolitry cyjanku potasu do portu C i 68 mikrolitrów antymycyny A do portu D. Następnie przygotuj związki do testu stresu glikolitycznego w stężeniu 10X w odpowiednim podłożu testowym, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj 50 mikrolitrów glukozy do portu A, 55 mikrolitrów oligomycyny do portu B, 62 mikrolitry 2-DG do portu C i 68 mikrolitrów antymycyny A do portu D. Przed testem otwórz dodatkowy analizator strumienia i skonfiguruj szablon testu za pomocą karty kreatora testu. Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku i wypełnij wszystkie informacje, które pojawiają się podczas konfiguracji.

Wygeneruj układ grupy i skonfiguruj protokół zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zapisz te układy przed testem. W czasie testu przywróć zapisany protokół, otwierając odpowiedni plik w opcji otwórz plik w zakładce kreatora testu.

Następnie załaduj związki 10X do odpowiednich portów uwodnionego wkładu czujnika zawierającego kalibert. Załaduj wkład czujnika do tacki nośnej dodatkowego analizatora strumienia. Rozpocznij kalibrację, klikając przycisk Start na ekranie.

Następnie delikatnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki testowej do płytki komórkowej wzdłuż boku ścianek, aby zminimalizować zakłócenia komórek, doprowadzając końcową objętość do 450 mikrolitrów. Zastąp tabliczkę użytkową zawierającą kaliber tabliczką testową i kontynuuj test. Po zakończeniu testu wyjmij wkład czujnika i płytkę.

Zapisz plik w odpowiednim folderze docelowym. W tym badaniu funkcje bioenergetyczne C albicans są oceniane za pomocą dodatkowego analizatora strumienia. Mutant pozbawiony białka mitochondrialnego mam33 jest również uwzględniany wraz ze szczepem dopełniacza w celu zbadania wpływu delecji białka mitochondrialnego na szybkość zużycia tlenu i wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Dziki typ C albicans wykazuje wskaźnik zużycia tlenu wynoszący 145 pikomoli na minutę, co mieści się w optymalnym zakresie dla każdego testu przepływu zewnątrzkomórkowego. Podstawowy wskaźnik zużycia tlenu w szczepach typu dzikiego, zmutowanych mam33 i uzupełnionych mam33 nie wykazuje różnic. Podobnie, nie obserwuje się istotnych różnic w podstawowych wskaźnikach zakwaszenia zewnątrzkomórkowego między szczepami.

Jednak poprzez hamowanie kompleksu IV cyjankiem potasu, typem dzikim i mutantem mam33, szczepy uzupełnione mam33 wykazują znaczne przesunięcie w kierunku glikolizy. Zmutowany szczep mam33 nie wykazał jednak kompensacyjnego przesunięcia glikolitycznego, co sugeruje, że szlak zależny od związku IV jest upośledzony w tym szczepie. W glikolitycznym teście wysiłkowym komórki są pozbawione glukozy przez godzinę i mierzy się podstawowy wskaźnik zużycia tlenu oraz stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Po wygłodzeniu zmutowany szczep mam33 wykazuje znacznie niższe zużycie tlenu i wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z innymi szczepami. Sugeruje to upośledzone wykorzystanie glukozy zarówno do oddychania, jak i glikolizy, gdy komórki są zmuszone do stanu głodu. Po wstrzyknięciu glukozy wszystkie szczepy wykazują stymulację zarówno tempa zużycia tlenu, jak i tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Powłoka płytki testowej umożliwia przyleganie komórek Candida albicans do płytki. Niewłaściwe przyleganie komórek Candida albicans będzie miało wpływ na wynik testu. Po opracowaniu tej techniki została ona zastosowana w szerokim zakresie typów komórek i chorób, odpowiadając na to, jak mitochondria funkcjonują w stanach fizjologicznych i patologicznych.

Na przykład, wykorzystując w tym teście komórki pochodzące od pacjenta i kontrolne, możliwe jest rozwiązanie konkretnych pytań dotyczących tego, w jaki sposób zmienia się funkcja mitochondriów. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania inhibitorów mitochondriów, takich jak cyjanek potasu i antymycyna A, ponieważ związki te są niezwykle trujące.