Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

W protokole tym opisano transformację tradycyjnych elektroprzędzonych membran z nanowłókien z 2D do 3D, poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2, co wcześniej nie było realizowane. Metoda ta eliminuje wiele problemów związanych z poprzednimi podejściami, w tym stosowanie roztworów wodnych i reakcji chemicznych, procesy wieloetapowe, utratę aktywności zamkniętych w kapsułkach cząsteczek biologicznych oraz ograniczenia polimerów hydrofobowych. Tę procedurę demonstruje Shixuan Chen, doktor habilitowany z mojego laboratorium.

W szklanej probówce o średnicy 20 mililitrów rozpuść dwa gramy PCL w mieszaninie rozpuszczalników dichlorometanu i DMF, w stosunku cztery do jednego przy stężeniu 10 procent. Umieść szklaną probówkę w rotatorze laboratoryjnym, aż roztwór stanie się klarowny. Roztwór może mieszać się w ciągu nocy.

Aby skonfigurować aparat do elektroprzędzenia, najpierw dodaj roztwór PCL do 20-mililitrowej strzykawki z dołączoną igłą o rozmiarze 21. Upewnij się, że w strzykawce nie ma powietrza i odłączone rurki. Umieść obracający się stalowy bęben z kolektorem gruntowym w odległości 12 centymetrów od końcówki igły.

Za pomocą zacisków krokodylkowych podłącz prąd stały o dużej objętościtage zasilacz do igły i upewnij się, że kolektor jest uziemiony. Dla 20 mililitrów roztworu PCL ustaw parametr pompy strzykawkowej, używając średnicy 20,27 milimetra i natężenia przepływu 0,5 mililitra na godzinę. Sprawdź, czy na końcu igły tworzą się kropelki.

Zastosuj potencjał elektryczny 20 kilowoltów między dyszą przędzalniczą a kolektorem gruntowym znajdującym się w odległości 20 centymetrów od dyszy przędzalniczej. Zbierz wyrównane maty z nanowłókien w bębnie, obracając się z prędkością 2 000 obr./min. Zbierz maty z nanowłókien PCL, gdy osiągną grubość około jednego milimetra.

Zanurz maty z nanowłókien PCL w ciekłym azocie na pięć minut. Utrzymuj maty z nanowłókien PCL w ciekłym azocie i przebijaj maty z nanowłókien PCL dziurkaczem o średnicy 0,5 milimetra. Umieść maty z nanowłókien PCL w ciekłym azocie na pięć minut.

Pokrój maty na kwadraty o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych, zanurzonych w ciekłym azocie, aby uniknąć deformacji krawędzi. Umieść pociętą matę w 30-mililitrowej probówce wirówkowej z około jednym gramem suchego lodu. Szczelnie zakryj pokrywę i pozwól, aby suchy lód zamienił się w ciekły dwutlenek węgla.

Gdy płyn utworzy się w rurce, szybko zwolnij ciśnienie, otwierając nakrętkę. Zdejmij i obserwuj dmuchane rusztowanie z rury. Umieść rusztowanie w nowej probówce wirówkowej z suchym lodem i powtórz tę czynność, aby uzyskać pożądaną grubość.

Wysterylizuj rusztowania z ekspandowanych nanowłókien w tlenku etylenu przed inkubacją z komórkami. Skuteczność rozszerzania tradycyjnych elektroprzędzonych mat z nanowłókien 2D na rusztowania 3D poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2 pokazano po lewej stronie po drugim zabiegu. Grubość rusztowania wzrosła z jednego milimetra bez leczenia do 2,5 milimetra przy jednym zabiegu CO2, do 19,2 milimetra przy dwóch zabiegach CO2.

Porowatość rusztowań wzrosła z 79,5 procent dla mat niepoddanych obróbce, do 92,1 procent po pierwszym zabiegu, do 99,0 procent po drugim zabiegu. Jest to istotne, ponieważ stopień penetracji komórki do rusztowania, a tym samym jej skuteczność w indukowaniu regeneracji, zależy w dużej mierze od porowatości. Obrazy SEM ujawniają, że gęsto upakowana struktura strzałkowa nieobrobionych mat 2D została przekształcona w uporządkowane, warstwowe struktury z wyrównanymi nanowłóknami po rozprężeniu CO2.

W Vevo badania przeprowadzono poprzez podskórne wszczepianie szczurom rusztowań z nanowłókien ekspandowanych CO2 z kwadratowymi otworami. Pozwala to na migrację i proliferację komórek w otworach, a także dalszą infiltrację w warstwach nanowłókien, które powstały podczas ekspansji. Od pierwszego do czwartego tygodnia po implantacji rozszerzone rusztowania wykazały znaczny wzrost liczby utworzonych naczyń krwionośnych i wielojądrowych komórek olbrzymich w porównaniu z tradycyjną matą z nanowłókien.

Po tej procedurze różne cząsteczki, w tym czynniki wzrostu, związki aminomodulujące, środki hemostatyczne i środki antymikrotubularne, mogą być włączane do mat z nanowłókien i ekspandowane w podkrytycznym płynie CO2. Takie funkcjonalizowane rusztowania z ekspandowanych nanowłókien mogą być wykorzystywane do badania nowych pytań w innych dziedzinach nauki, takich jak hemostaza, zapobieganie i leczenie infekcji, immunologia oraz regeneracja i naprawa tkanek. Rozpuszczalniki organiczne są toksyczne i należy się z nimi obchodzić w kapturze chemicznym.

Ponadto do rozprężania należy użyć pojemnika, który wytrzyma wysokie ciśnienie podkrytycznego płynu CO2