Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju biofilmu, takie jak sposób identyfikacji kluczowych warunków środowiskowych, które wpływają na wzrost biofilmu i cechy behawioralne podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki, jest to, że wielokanałowe, mikrofluidyczne płytki, pozwalają na szybkie uzyskanie statystycznie istotnych wyników. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strukturę biofilmu, może być również stosowana do badania leczenia antybiotykami i bioremediacji.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ potrzebna jest uważna uwaga na szczegóły protokołu i skrupulatne umiejętności. Aby uniknąć błędu połączenia przyrządu z oprogramowaniem, najpierw włącz stację roboczą PC, a następnie moduł fluorescencyjny. Upewnij się, że migawka fluorescencyjna jest włączona i włącz kontrolery sprzętowe.

Następnie włącz kontroler systemu obrazowania i kamerę CCD. Następnie włącz stację obrazowania. Gdy wszystkie urządzenia są gotowe, uruchom aplikację sterującą i wprowadź numer rejestracyjny, znajdujący się na etykiecie z boku tabliczki.

W celu zagruntowania należy najpierw wyjąć 48-dołkową płytkę mikroprzepływową z opakowania, nie dotykając szklanej powierzchni na dnie płytki, a następnie wyczyść szkiełko podstawowe na dnie płytki chusteczką do soczewek. Aby zalać kanały mikroprzepływowe, odpipetuj 200 mikrolitrów minimalnego medium o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki wyjściowej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie umieść talerz na stoliku talerzowym.

Przetrzyj interfejs etanolem, uszczelniając go na stoliku płytowym po wyschnięciu etanolu. W trybie ręcznym na module sterującym ustaw płyn jako bulion Luria-Bertani na 37 stopni Celsjusza, a max sheer na pięć dym na centymetr kwadratowy. Kliknij studzienki wyjściowe, aby aktywować przepływ od wyjścia do studzienki wejściowej, aby zalać kanały.

Po pięciu minutach wstrzymaj przepływ, aby przygotować się do siewu, i ostrożnie zdejmij płytkę ze sceny. Następnie odessać resztki medium ze studzienki wyjściowej, nie usuwając żadnego medium z wewnętrznego okręgu, który prowadzi do kanałów mikroprzepływowych. Aby zasiać kanały eksperymentalne, dodaj 300 mikrolitrów minimalnej pożywki do studzienki wejściowej, a następnie dodaj 300 mikrolitrów kultury bakteryjnej do studzienki wyjściowej.

Przywróć płytkę do etapu obrazowania, upewniając się, że przetarłeś interfejs etanolem przed umieszczeniem go na płycie, a następnie użyj obrazu z kamery na żywo, aby ustawić ostrość na jednym kanale. Podczas wizualnego monitorowania przekazu na żywo, wznów przepływ przy 1 do 2 dym na centymetr kwadratowy przez około 2 do 4 sekund, aby umożliwić komórkom wejście do kanału eksperymentalnego, ale nie do kanałów serpentynowych, i pozostaw płytkę na etapie o kontrolowanej temperaturze na jedną godzinę, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Pod koniec okresu mocowania ostrożnie wyjmij płytkę ze stolika i zassaj bakterie ze studzienki wyjściowej, nie naruszając kanału.

Następnie użyj nowej końcówki pipety, aby usunąć medium z dołków wejściowych. W oprogramowaniu otwórz akwizycję wielowymiarową, aby sterować akwizycją obrazu mikroskopu i wybierz upływ czasu, wiele pozycji stage i wiele długości fal. Na karcie zapisywania utwórz prostą nazwę podstawową, upewniając się, że zaznaczone są wkręty nazwy podstawowej, jeśli plik istnieje.

W opisie należy zawrzeć wszystkie istotne informacje o eksperymencie. Kliknij wybierz katalog, aby wybrać folder, w którym zostaną zapisane wszystkie pliki. Na karcie poklatkowej dostosuj czas trwania eksperymentu do 24 godzin i ustaw przedział czasu, aby pobierać obrazy co pięć minut przez cały czas trwania eksperymentu. Użyj obrazu z kamery na żywo i obiektywu 10x, aby ustawić pozycje sceny, skupiając się na środku kanału, znajdującym się powyżej lub poniżej numerów kanałów wygrawerowanych na tabliczce.

Przełącz się na obiektyw 20x i znajdź optymalny obszar widzenia i płaszczyznę ogniskową w kanale. Następnie dodaj pozycję sceny do listy z nowymi ustawieniami. W menu długości fal ustaw liczbę długości fal na 3 i ustaw pierwszą długość fali na FITC 100% kamery, z dziesięciomilisekundowym czasem ekspozycji, drugą długością fali na jasne pole 50% kamery 50% widzialnej, z minimalnym czasem ekspozycji 3 milisekundy, a trzecią długość fali na wszystkie zamknięte, więc między czasami akwizycji nie pozostaje żadne światło na ostatnim kanale.

W menu edycji automatycznego uruchamiania otwórz zakładkę ustawień protokołu i ustaw nowy protokół o czasie trwania 24 godzin z przepływem ustawionym w kierunku do przodu z odpowiednią eksperymentalną szybkością ścinania. Kliknij dodaj i zapisz jako, aby zapisać protokół i otworzyć kartę ustawień sekwencji. Aby ustawić nową sekwencję, wybierz bulion Luria-Bertani o temperaturze 37 stopni jako domyślny płyn dla wszystkich kanałów.

W obszarze iteracji kroku 1 dla kanałów od 1 do 12 wybierz protokół z pierwszą eksperymentalną szybkością ścinania i włącz wszystkie kanały. Dla kanałów od 13 do 24 wybierz protokół z drugą eksperymentalną szybkością ścinania i włącz wszystkie kanały. Następnie wybierz opcję Zastosuj i Zapisz jako, aby zapisać sekwencję i otworzyć menu AutoRun, aby wybrać zapisaną sekwencję, która ma być używana dla AutoRun.

Aby przeprowadzić eksperyment z biofilmem wzrostu w czasie, dodaj do 1300 mikrolitrów sterylnego minimalnego podłoża do studzienki wejściowej płytki mikroprzepływowej i przywróć płytkę do etapu obrazowania. Następnie przetrzyj interfejs etanolem i uszczelnij płytkę. Upewnij się, że protokoły i sekwencje są poprawnie skonfigurowane.

Wybierz start, aby uruchomić automatyczne uruchamianie, a następnie natychmiast kliknij przycisk pobierz, aby rozpocząć zbieranie obrazów z mikroskopu. Pod koniec pierwszej akwizycji obrazu kliknij pauzę i wybierz tryb obrazu na żywo o długości fali jasnego pola. Wybierz opcję Przejdź do, aby wyświetlić każdą pozycję etapu, a następnie wybierz opcję Ustaw na bieżącą, aby ustawić nowe ustawienia.

Następnie kliknij przycisk wznów, zanim rozpoczniesz następne zaplanowane przejęcie. W tym reprezentatywnym eksperymencie z czasowym wzrostem biofilmu, pokrycie biofilmu lub procentowa powierzchnia progowa, była różna dla wszystkich trzech ustawień ścinania, co wskazuje, że ścinanie miało bezpośredni wpływ na pokrycie powierzchni biofilmu. Całkowity względny pomiar akumulacji biofilmu zwiększył się w funkcji czasu, przy czym tempo wzrostu spadło od najwyższego naprężenia ścinającego do najniższego naprężenia ścinającego.

W każdym z tych warunków występował również wyraźny okres wykładniczego wzrostu, na podstawie którego można było obliczyć ilościową stopę wzrostu. Ogólnie rzecz biorąc, współczynnik chropowatości zmniejszał się z czasem we wszystkich warunkach ścinania, co wskazuje, że wszystkie powierzchnie biofilmu stały się gładsze. Jednak w porównaniu z najniższym ścinaniem, wyższe ustawienia ścinania spowodowały z czasem gładszą powierzchnię, co wskazuje, że szybszy przepływ ścinania przyczynia się do gładszej i bardziej równej powierzchni.

Co więcej, entropia teksturalna, czyli losowość morfologii, wzrastała z czasem dla wszystkich warunków ścinania. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu określonej sekwencji i poświęcić czas na dokładne wykonanie każdego kroku. Opanowanie potrzebnych umiejętności może zająć kilka biegów.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak HBLC lub GCMS, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stężeń spożywanych subprostych, takich jak glukoza. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biofilmami do badania ogólnych środowisk przepływu w czasie rzeczywistym w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych i pobieraniu próbek z hydroterapii. Nie zapominaj, że praca ze szczepami bakterii BSL2 może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego i stosowanie odpowiednich protokołów postępowania z odpadami.