Name: Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj analizę naprężeń ścinających w biofilmach Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego z fluorescencyjnym mikroskopem. Metoda umożliwia szybkie uzyskanie istotnych statystycznie wyników dotyczących pokrycia i morfologii biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki grantom z National Institute for General Medical Science (NIGMS) (5P20GM103427), składnika National Institutes of Health (NIH)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Omawiana tutaj procedura analizy systemu mikroprzepływowego i obrazu koncentruje się na wykonywaniu eksperymentów z biofilmem mikroprzepływowym w celu określenia właściwości morfologicznych, które nie wymagają pełnych informacji trójwymiarowych, zwykle uzyskiwanych z badań mikroskopem konfokalnym. Obejmowały one pokrycie podłoża mikrokolonii (pokrycie procentowe), chropowatość powierzchni mierzoną współczynnikiem chropowatości oraz entropię tekstury. Przedstawiono również metodę szacowania całkowitej względnej akumulacji komórek biofilmu, na podstawie której można obliczyć tempo wzrostu w fazie logarytmicznej.
W tej metodzie należy podkreślić kilka małych, ale istotnych kroków. Wycieranie granicy faz alkoholem pomaga uniknąć zanieczyszczenia innymi bakteriami podczas przechodzenia od eksperymentu do eksperymentu, ale także od studni do studni w jednym eksperymencie. Gruntowanie i zasiewanie są również bardzo ważne, ponieważ gruntowanie pozwala użytkownikowi określić, które kanały pozwalają mediom przepływać przez kanały bez żadnych zakłóceń lub zatykania. Kanały nie powinny być również zakłócane (tzn. powinny być stale wypełnione mediami) po zalaniu, aby zwiększyć szanse na udany eksperyment bez pęcherzyków powietrza i zatkania. Etap wysiewu może być zróżnicowany w zależności od rodzaju bakterii, dlatego powinien być zoptymalizowany pod kątem przyczepiania komórek. Na przykład, jeśli wydaje się, że komórki nie przyczepiają się, może być konieczne zmodyfikowanie powierzchni płytki mikroprzepływowej przed wysiewem lub może być konieczne dłuższe czas inkubacji. Bardzo ważne jest również, aby upewnić się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony do uzyskania ostrego obrazu i powinien być okresowo monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu, aby zapewnić uzyskanie wysokiej jakości obrazów. Jeśli ostrość jest wyłączona, mikroskop można i należy regulować w miarę trwania eksperymentu. W czasie akwizycji obrazu ostatnia długość fali powinna być ustawiona na All Closed (Wszystkie, Zamknięte ), aby uniknąć ekspozycji filtrów i oświetlenia tylko na jeden kanał w czasie oczekiwania, który występuje między akwizycjami obrazu. Ponadto analiza obrazu, która określa % pokrycia powierzchni, została zaprojektowana we własnym zakresie, ponieważ podręcznik oprogramowania montażowego nie opisywał wyraźnie procedury. Ponadto, w celu rozszerzenia analizy obrazu i określenia innych cech, takich jak chropowatość powierzchni itp., kod open source oparty na Pythonie45 został opracowany we własnym zakresie i udostępniony w repozytorium gitHub. Istnieją również ograniczenia dotyczące ilości danych, które mogą być przechowywane i zarządzane na lokalnym dysku twardym, dlatego potrzebny jest zewnętrzny dysk twardy lub udostępnianie danych online, takie jak CyVerse46.
Konwencjonalne bioreaktory, takie jak reaktor CDC i reaktor z przepływem kroplowym34, wymagają dużej ilości mediów, zapewniają mniejsze rozmiary próbek i wymagają dużej ilości sterylizacji sprzętu. Z kolei do zalet tej platformy o wyższej przepustowości należy możliwość kontrolowania ścinania, natężenia przepływu oraz założenie, że eksperymenty in vitro bardzo przypominają warunki in vivo . Do wad systemu należy mnogość akcesoriów i oprogramowania, które wymagają skrupulatnej konfiguracji, która musi być wykonywana w odpowiedniej kolejności zdarzeń. Co więcej, instrukcja dołączona do sprzętu nie wyjaśnia w pełni każdego etapu eksperymentów i poleceń oprogramowania, w związku z czym podczas eksperymentów dochodzi do wielu błędów, w tym zatykania kanałów, braku wzrostu lub przyczepienia, a także braku wysokiej jakości obrazów mikroskopowych lub filmów. Sam instrument i materiały eksploatacyjne, takie jak płytki mikroprzepływowe, są również stosunkowo drogie, a ich cena wynosi ponad 200 USD za płytkę i nie nadają się do wielokrotnego użytku. Tak więc, chociaż technika ta daje potężne rezultaty, wiedza techniczna wymagana do jej stosowania jest stosunkowo wysoka i wymaga wielokrotnego szkolenia przez ekspertów w tej dziedzinie. Niniejszy raport próbuje rozwiązać ten problem, dostarczając przewodnik dla nowych użytkowników tych bioreaktorów w celu zbadania charakterystyki biofilmów.
System mikroprzepływowy, który jest w stanie przeprowadzać analizę komórkową, zyskał znaczną uwagę w różnych metodach naukowych, takich jak mikrobiologia, immunologia, hematologia, onkologia i badania nad komórkami macierzystymi. Mówiąc dokładniej, technologia ta zaowocowała wieloma publikacjami opisującymi tematy, które są bardzo istotne dla zastosowań medycznych37,47, w tym mikrobiolną adhezję doustną48, określanie wpływu biosurfaktantów na Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus49,50, interakcje patogenów gospodarza w E. coli51, przyleganie Streptococcus 52oraz leczenie mukowiscydozy53. Biorąc pod uwagę fakt, że ten system mikroprzepływowy jest bardzo wszechstronny, przewiduje się, że coraz więcej systemów będzie dystrybuowanych na całym świecie.
Należy dokładnie rozważyć niektóre konkretne kroki protokołu. Pożywkę można rozcieńczyć do 50% za pomocądH 2O, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków i zatykaniu, ale w tym przypadku nie jest to wymagane. Konkretna wartość OD600 używana do wysiewu musi zostać określona za pomocą próbnych przebiegów eksperymentu wzrostu, aby zobaczyć, co działa najlepiej dla określonego zestawu zastosowanych warunków. Pęcherzyki w studzienkach przed uszczelnieniem mogą prowadzić do powstawania pęcherzyków w kanałach mikroprzepływowych i powinny być usuwane przez wystrzelenie lub odessanie końcówką pipety. Ważne jest, aby bakterie nie przedostawały się do małych kanałów serpentynowych. Dzięki równym objętościom mediów na wejściu i wyjściu podczas procesu wysiewu, przepływ spowodowany ciśnieniem z objętości cieczy będzie kontrolowany, tak aby przepływ był spowodowany tylko ciśnieniem przyłożonym z układu. Odległości kalibracyjne powinny być ustawione podczas instalacji przez przedstawiciela firmy. Te ustawienia są specyficzne dla każdej kamery.
Istnieje kilka wyzwań, które pojawiają się podczas znajdowania najbardziej reprezentatywnego progu dla obrazu. Ustawienie maksymalnych wartości progowych może być trudne, jeśli średnia intensywność pikseli w różnych obszarach tła nie jest spójna, z powodu wybrania pozycji stołu montażowego, która nie znajduje się w środku kanału, lub z powodu zanieczyszczeń na płycie. W standardzie MM kliknij Proces, a następnie wybierz narzędzie Korekcja tła i cieniowania , aby skorygować te niespójności. Jednak to narzędzie jest zazwyczaj pomocne tylko wtedy, gdy użytkownik zrobił zdjęcia kanałów przed udostępnieniem, które może użyć jako obrazów referencyjnych. Lub, jeśli obrazy referencyjne tła/cieniowania są niedostępne, użytkownik będzie musiał użyć swojego osądu, aby ustawić wartość progową, która obejmuje większość obszaru komórki bez dołączania tła dla całego obrazu. Można też wybrać reprezentatywne obszary do pomiaru, które wykluczają obszary niespójności, klikając opcję Region prostokątny, Region elipsy lub Region trasowania , aby wybrać region i wybrać opcję Aktywny region , a nie Cały obraz w oknie Pokaż statystykę regionu (w obszarze Narzędzia analizy)). Jeśli reprezentatywny obszar jest używany do progowania obrazu w jasnym polu, ten sam obszar powinien być używany do pomiaru odpowiedniego obrazu FITC. Pomocne jest zarejestrowanie określonych statystyk przestrzennych (po lewej, u góry, szerokość, wysokość, powierzchnia, obwód) związanych z tym reprezentatywnym regionem, dzięki czemu ten sam obszar zostanie znaleziony i zmierzony na odpowiednim obrazie FITC.
Aby zapobiec gromadzeniu się danych na dysku twardym, które spowoduje spowolnienie komputera, można kupić zewnętrzny dysk twardy do przechowywania danych. Inną opcją przechowywania danych i ułatwiania ich udostępniania jest platforma bioinformatyczna CyVerse. Utwórz konto w systemie CyVerse, przechodząc do http://www.cyverse.org/. Po zalogowaniu uruchom środowisko Discovery, a następnie wybierz "Zaloguj się do CyVerse". Wybierz "Dane" i przejdź do folderu. Jeśli stos obrazów znajduje się na komputerze lokalnym, wybierz "Prześlij", a następnie "Proste przesyłanie z pulpitu". Znajdź plik stosu obrazów i wybierz go do przekazania. Plik lub folder można udostępnić współpracownikom, jeśli mają konto CyVerse i mają uprawnienia. Publiczne udostępnianie folderu danych wymaga dodania metadanych do każdego pliku przy użyciu standardów zatwierdzonych przez CyVerse. Procedura ta nie będzie tutaj omawiana, ponieważ nie wchodzi w zakres niniejszej pracy.

W niniejszym materiale zaprezentujemy metodę pomiaru wpływu naprężeń ścinających na tworzenie fluorescencyjnych biofilmów Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 z wykorzystaniem zautomatyzowanego, wysokoprzepustowego systemu mikroprzepływowego.
Biofilmy to społeczności mikroorganizmów, takich jak bakterie, zorganizowane przez pozakomórkową substancję polimerową, które przylegają do podłoża i zazwyczaj występują na styku cieczy i powierzchni stałej1. Społeczności biofilmu mogą być korzystne dla środowiska, na przykład poprzez poprawę jakości wody w rurociągach wodociągowych oraz w bioremediacji związków trudnotlenialnych2,3. Jednak biofilmy mogą być również wysoce szkodliwe dla zdrowia ludzi, prowadząc do niepożądanych konsekwencji. Na przykład urządzenia medyczne, takie jak implanty biodra i kolana, są jednym z rodzajów powierzchni, na których akumulacja biofilmu stanowi wyzwanie i powoduje poważne powikłania medyczne4,5. Biofilmy mogą również przedostawać się do naturalnych systemów wodnych, takich jak rzeki i jeziora, oraz przenikać do rur wodociągowych, co prowadzi do zanieczyszczenia wody pitnej bakteriami i w konsekwencji do infekcji6,7,8. Biofilmy tworzące się w środowisku morskim przylegają do statków i innych sztucznych podłoży, stanowiąc poważny problem gospodarczy i środowiskowy, ponieważ zwiększone tarcie prowadzi do wzrostu zużycia paliwa9,10. W celu zapobiegania tym problemom opracowano powłoki przeciwdrobnoustrojowe, takie jak Tributyltin, które są jednak toksyczne dla organizmów morskich1.
P. aeruginosa to gram-ujemna bakteria o wysokich zdolnościach adaptacyjnych do różnorodnych warunków środowiskowych i odżywczych12. P. aeruginosa jest częstą przyczyną zakażeń pozaszpitalnych i szpitalnych; stwierdzono, że jest ściśle powiązana z urazami, takimi jak ciężkie oparzenia, oraz z gospodarzami z obniżoną odpornością, m.in. w przypadku mukowiscydozy (CF)5,12,13, AIDS oraz u pacjentów z chorobami nowotworowymi5,13. Tworzenie biofilmu przez P. aeruginosa jest najsilniej powiązane z mukowiscydozą, w której przewlekłe infekcje płuc stanowią główną przyczynę zgonów w przebiegu tej choroby5.
W niniejszym raporcie wykorzystano szczep referencyjny P. aeruginosa PA01, który został zmodyfikowany genetycznie w celu ekspresji ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (PA-EGFP). EGFP jest mutantową formą GFP o silniejszych właściwościach fluorescencyjnych, co umożliwia analizę biofilmu in situ przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej14,15,16. Ten rodzaj analizy fluorescencyjnej jest korzystny w badaniu biofilmów, ponieważ GFP nie wpływa w znacznym stopniu na wzrost i funkcje komórek17. Na przykład komórki Escherichia coli znakowane GFP rosły prawidłowo i stale, nie wykazując żadnych efektów toksycznych w porównaniu z bakteriami kontrolnymi17. Inne doniesienia potwierdzają tę tezę18,19,20. Ponadto zastosowanie reportera fluorescencyjnego, takiego jak EGFP, jest szybkie i proste, a mierzone są jedynie żywe komórki, ponieważ komórki martwe szybko przestają fluorescować21.
Biofilmy mogą rozwijać się w różnych warunkach środowiskowych, w tym przy różnych prędkościach przepływu. Na przykład filmy mogą rosnąć w warunkach wysokiego naprężenia ścinającego, jak w rzekach, gdzie wysoki przepływ wody prowadzi do większej różnorodności mikrobiologicznej2. Przeciwnie, stojąca woda w stawach lub biofilmy jamy ustnej są poddane znacznie mniejszej sile ścinającej23. Oprócz prędkości przepływu istnieją inne czynniki wpływające na adhezję biofilmu, w tym chropowatość i hydrofobowość powierzchni, skład pożywki, a nawet powierzchnia komórki bakteryjnej1,4,7,24. Warunki te mogą również powodować zmienność w strukturze przestrzennej lub morfologii biofilmu. Obejmuje to warunki środowiskowe, takie jak naprężenie ścinające wywierane przez płynący płyn lub gradienty dostępności składników odżywczych, oraz czynniki biologiczne, takie jak gatunki obecne w systemie, ruchliwość komórek i specyficzne białka obecne w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej25,26,27. W zależności od warunków biofilm może mieć strukturę trawnikową (gładką i płaską), natomiast w innych warunkach biofilm może być chropowaty, puszysty lub nawet przypominać grzyby28. Chociaż różnica jakościowa między strukturami trawnikowymi a grzybopodobnymi w biofilmach jest wyraźnie widoczna na obrazach mikroskopowych, zrozumienie związku między strukturą filmu a procesami biologicznymi w jego obrębie wymaga systematycznych i ilościowych metod opisu morfologii. Właściwości morfologiczne sugerowane przez badaczy do analizy obejmują porowatość, wymiar fraktalny, długość dyfuzyjną, powierzchnię mikrokolonii na podłożu, objętość mikrokolonii, współczynnik chropowatości oraz entropię teksturalną29,30.
Bioreaktory są wykorzystywane w badaniach nad biofilmami do naśladowania warunków rzeczywistych31. Reaktory przepływu kroplowego (DFR) reprezentują środowisko o niskim ścinaniu, w którym składniki odżywcze w pożywce powoli przepływają przez komórki przywierające z czasem do powierzchni, tworząc biofilm o wysokiej gęstości komórkowej32. Reaktory CDC to bioreaktory, które tworzą środowisko cieczy o wysokim naprężeniu ścinającym poprzez sterowanie prętem mieszającym, który stale obraca się w zbiorniku wypełnionym pożywką33. Te rodzaje bioreaktorów są proste w konfiguracji, ale ich zakres jest ograniczony ze względu na stosunkowo małą wielkość próbek, wysokie zużycie pożywki, duże ilości produkowanych odpadów biologicznie niebezpiecznych z przepływów kroplowych pożywki (od 125 µL/minute dla reaktorów przepływu kroplowego do ponad 1 mL/min dla reaktorów CDC) oraz konieczność autoklawowania dużych ilości szkła laboratoryjnego i zużytej pożywki34. Biofilmy nie rosną równomiernie na powierzchni w reaktorze przepływu kroplowego, ponieważ niskie ścinanie pożywki powoduje powstawanie smug wzdłuż większych konglomeratów bakterii P. aeruginosa; w konsekwencji wzrost biofilmu nie jest jednorodny, a nierównomierne próbki nie mogą być łatwo analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej35,36.
Niektóre typowe ograniczenia bioreaktorów można pokonać, stosując mikrofluidyczny bioreaktor o średniej przepustowości, w którym wymagane są jedynie mililitry pożywki, a płytki reakcyjne są niewielkie i łatwo utylizowane po autoklawowaniu37. Ponadto, w zależności od liczby studzienek, w jednym cyklu pracy reaktora można przeprowadzić wiele powtórzeń, co dostarcza wystarczającej ilości danych do wykonania istotnej analizy statystycznej. Na Rysunku 1 przedstawiono poszczególne komponenty systemu mikrofluidyczno-mikroskopowego, które umożliwiają kontrolę warunków, w tym temperatury i szybkości przepływu38,39,40. Bioreaktor jest sprzężony z mikroskopią fluorescencyjną w celu wizualizacji fluorescencji znacznika EGFP w szczepie PA01 w zastosowanych warunkach niskiego i wysokiego ścinania, co ma odzwierciedlać bardziej realistyczne scenariusze występujące w środowisku lub w dziedzinie biomedycznej.
<img alt="Układ mikroskopii i spektroskopii, schemat; analiza optyczna i widmowa w badaniach naukowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Poszczególne komponenty układu mikroprzepływowego. Poszczególne komponenty są wymienione od lewej do prawej: 1. kamera CCD, 2. odwrócony mikroskop wysokiej rozdzielczości zautomatyzowanym stolikiem, zautomatyzowanym modułem fluorescencyjnym i modułem autofokusa, 3. stolik do płytek, 4. interfejs systemu obrazowania, 5. manualne sterowanie stolikiem mikroskopu, 6. pułapka par, 7. sterownik systemu obrazowania (w tym sterownik temperatury), 8. sterowniki sprzętowe, 9. sterownik fluorescencji, 10. zasilacz awaryjny (UPS), 1. zewnętrzny dysk twardy do przechowywania obrazów, 12. stacja robocza PC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Fragment płytki mikrofluidycznej przedstawiono na Rysunku 2. Najczęściej stosowane płytki składają się z 48 studni. Jeden eksperyment wymaga jednej studni wlotowej i jednej wylotowej, czyli łącznie 2 studni. Pozwala to na przeprowadzenie 24 równoległych eksperymentów z różnymi warunkami, takimi jak różne szczepy bakteryjne, preparaty przeciwdrobnoustrojowe oraz pożywki zmienne między kanałami, przy jednoczesnej kontroli przepływu ścinającego dla każdej kolumny sześciu kanałów. Temperatura eksperymentalna jest również kontrolowana za pomocą jednego ustawienia temperatury dla całej płytki. Kanały mikrofluidyczne wykazują, że każdy z nich posiada obszar serpentynowy, który zapewnia odpowiednie ciśnienie wsteczne i kontrolowane ścinanie.
<img alt="Schemat urządzenia mikroprzepływowego; mikroskopia w jasnym polu, fluorescencyjna; zestaw do analizy komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualizacja kanałów mikroprzepływowych i okna obserwacyjnego. Dwa otwory wlotowe i wylotowe z łączącymi je kanałami mikroprzepływowymi zostały zaznaczone barwnikami czerwonym i zielonym. Barwnik uwidacznia obszar serpentynowy w każdym kanale, który wytwarza odpowiednie ciśnienie wsteczne i kontrolowane naprężenie ścinające podczas przepływu cieczy. Każdy kanał obserwacyjny (wewnątrz czerwonego okręgu) może być obrazowany z wykorzystaniem wybranych długości fal. Przedstawiono obrazy z mikroskopii w polu jasnym (góra) oraz fluorescencyjnej (dół) pojedynczego kanału z biofilmem PA01-EGFP przy użyciu obiektywu 20X. Pasek skali = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przedstawiono instrukcję krok po kroku, która umożliwi użytkownikom bioreaktorów mikroprzepływowych sprzężonych z mikroskopią fluorescencyjną przeprowadzanie nowatorskich eksperymentów z biofilmem w różnych warunkach ścinania. Metoda ta pozwoli na rozszerzenie zakresu doświadczeń o inne mikroorganizmy poza bakteriami, takie jak grzyby i algi, które znajdują zastosowanie w medycynie i ochronie środowiska41,42,43. Szczegółowy opis obejmuje sposób hodowli PA01-EGFP, inokulację płytki 48-dołkowej, konfigurację urządzenia mikroprzepływowego i oprogramowania, ustawienie mikroskopu fluorescencyjnego oraz demonstrację analizy programowej w celu wyznaczenia stopnia pokrycia biofilmem, szybkości wzrostu i właściwości morfologicznych, takich jak chropowatość powierzchni.

<table><tbody><tr><td>Chlorek amonu, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>Część minimalnego składu podłoża</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48-dołkowa płyta o niskim ścinaniu</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania mikroprzepływowego BioFluxion 1000Z</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrek chlorku wapnia, klasa ACD</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>Część minimalnego składu podłoża</td></tr><tr><td>Dekstroza, bezwodna, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>Część minimalnego składu pożywki</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td> klasy <td>ACS VWR</td><td>EM-MX0070-1</td><td>Część minimalnego składu podłoża</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy, klasa ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>Część minimalnego składu podłoża</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>Szczep bakteryjny Pseudomonas aeurinosa PA01 z modyfikacją GFP wykorzystany w tym badaniu.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>Część minimalnego składu pożywki</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, jednozasadowy, bezwodny, klasa odczynnika</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>Część minimalnego składu podłoża</td></tr></tbody></table>

analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Do badania wzrostu i morfologii biofilmu bakteryjnego użyto wysokoprzepustowego mikroprzepływowego bioreaktora in vitro w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, w tym Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). W tym miejscu opiszemy, w jaki sposób system może być wykorzystany do badania kinetyki wzrostu i właściwości morfologicznych, takich jak chropowatość powierzchni i entropia tekstury szczepu PA01 P. aeruginosa, który wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji (PA01-EGFP). Szczegółowy protokół opisuje, jak hodować i wysiewać kultury PA01-EGFP, jak ustawić mikroskop i autorun oraz przeprowadzić analizę obrazu w celu określenia szybkości wzrostu i właściwości morfologicznych przy użyciu różnych sił ścinających, które są kontrolowane przez urządzenie mikroprzepływowe. W tym artykule przedstawimy szczegółowy opis techniki mającej na celu usprawnienie badania biofilmów PA01-EGFP, które ostatecznie mogą być zastosowane do innych szczepów biofilmów bakterii, grzybów lub glonów przy użyciu platformy mikroprzepływowej.

Rycina 4a przedstawia procentową powierzchnię przekroczenia progu w czasie podczas 24-godzinnego pomiaru przy przepływach ścinających wynoszących 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Pokrycie biofilmem lub procentowa powierzchnia przekroczenia progu (C [%]) różniło się dla wszystkich trzech ustawień ścinania. Pokrycie biofilmem następowało najszybciej przy ścinaniu 1,0 dyne/cm2 , gdzie powierzchnia progu zwiększyła się z 2-5% do 10% po 20 min wzrostu i osiągnęła fazę stacjonarną po 40 min. Przy 0,5 dyne/cm2 pokrycie biofilmem było opóźnione i zaczęło wzrastać w 400 min, osiągając 10% pokrycia po 80 min. Przy najniższym ścinaniu 0,2 dyne/cm2 wyraźnie zaobserwowano najwolniejszy wzrost pokrycia biofilmem, gdzie procent pokrycia zaczął wzrastać w 50 min, ale nigdy nie przekroczył progu 65% powierzchni. Wyniki te wskazują, że ścinanie miało bezpośredni wpływ na powierzchniowe pokrycie biofilmem. Wyższe ścinanie wydawało się być warunkiem bardziej optymalnym dla wzrostu biofilmu, prawdopodobnie ze względu na fakt, że medium dostarczało bakteriom więcej składników odżywczych, dzięki czemu biofilm mógł szybciej proliferować.
<img alt="Dynamika wzrostu biofilmu analizowana za pomocą wykresów stopnia pokrycia, akumulacji, chropowatości i entropii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Procentowa powierzchnia progowa, całkowita akumulacja biofilmu, współczynnik chropowatości i entropia teksturalna. a) Procentowy próg powierzchni (C [%]) w czasie, przy zastosowaniu wartości 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 godzin. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. b) Całkowita akumulacja biofilmu (miara względna) w funkcji czasu dla wartości 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 h. Linie czarne to dopasowania metodą najmniejszych kwadratów do modelu wykładniczego. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. c) Współczynnik szorstkości PA01-EGFP przy wartościach naprężenia ścinającego 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 monitorowane przez 24 h. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. d) Entropia teksturalna PA01-EGFP przy zastosowaniu wartości naprężenia ścinającego 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek 4b jest zgodny z wynikami przedstawionymi na Rysunku 4a. Akumulację biofilmu (N[rel]) zmierzono w oparciu o założenie, że sygnał GFP w danym punkcie obrazu jest proporcjonalny do gęstości żywych komórek w tej pozycji. Wykazano, że całkowita względna akumulacja biofilmu wzrosła w funkcji czasu przy wartościach 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 h, a szybkość wzrostu spadała wraz z przejściem od najwyższego do najniższego naprężenia ścinającego. Istnieje wyraźny przedział czasowy wykazujący wzrost wykładniczy, z którego można obliczyć ilościową szybkość wzrostu.
Rysunek 4c przedstawia współczynnik chropowatości (Ra) przy przepływach ścinających wynoszących 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Chropowatość powierzchni, określona za pomocą współczynnika chropowatości, mierzy wariancję profilu grubości filmu. Formalna definicja brzmi:
<img alt="Wzór na średni błąd ważony; równanie matematyczne; analiza statystyczna; obliczanie stopy błędu." src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
gdzie Ti  to i-ty pomiar grubości, Ta to średnia grubość, a N to liczba pomiarów grubości30. Procedura opisana w niniejszym badaniu mierzy grubość powiązaną z żywymi komórkami. Płaska struktura komórek spowoduje uzyskanie współczynnika chropowatości równego zero, natomiast znaczne odchylenia grubości od średniej spowodują uzyskanie współczynnika chropowatości większego od jeden. Podobnie jak w przypadku wpływu sił ścinających na tempo wzrostu i procentowy próg pokrycia filmu, biofilmy wykazywały różną topografię w czasie. Ogólnie Ra malał w czasie dla wszystkich warunków ścinania, co wskazuje na to, że wszystkie powierzchnie stały się gładsze. Jednak w porównaniu z najniższym ścinaniem wynoszącym 0,2 dyne/cm, wyższe ustawienia ścinania 0,5 i 1,0 dyne/cm2 doprowadziły do uzyskania gładszej powierzchni w czasie, co wskazuje, że szybszy przepływ ścinający przyczynił się do uzyskania gładszej i bardziej równomiernej powierzchni, a przy najwyższym ścinaniu 1,0 dyne/cm2 wartość spadła poniżej 0,2 Ra.
Gładkość, regularność lub chropowatość powierzchni mogą być również wyrażone za pomocą entropii teksturalnej (TE). TE jest właściwością wykorzystywaną w analizie obrazu do pomiaru stopnia przypadkowości w obrazie dwuwymiarowym. Jej obliczanie opiera się na macierzy współwystępowania poziomów szarości, zdefiniowanej przez Haralick et al., która analizuje, czy wartości pikseli w jednym miejscu są skorelowane z wartościami pikseli w innym miejscu4. Wysoki stopień korelacji prowadzi do niskiej entropii. Rysunek 4d przedstawia TE dla przepływów ścinających o wartościach 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Wartość TE wzrastała w czasie dla wszystkich warunków ścinania, jednak przy najwyższym naprężeniu ścinającym 1,0 dyne/cm maksymalna wartość TE (1,0) została osiągnięta wcześniej niż przy niższych naprężeniach ścinających, mianowicie w 90 min. Najniższe ścinanie o wartości 0,2 dyne/cm2 wykazywało najniższą wartość TE (0,8), osiągając maksimum po 10 min. Natomiast dla pośredniego naprężenia ścinającego 0,5 dyne/cm2 maksymalna wartość TE (1,2) została osiągnięta znacznie później niż w warunkach wysokiego lub niskiego naprężenia ścinającego.
Współczynnik chropowatości oraz TE mierzą różne cechy. Podczas gdy płaski film charakteryzowałby się niskim współczynnikiem chropowatości i niską entropią, film ze znacznymi różnicami w grubości miałby wysoki współczynnik chropowatości, ale nadal mógłby wykazywać niską entropię, jeśli zmienność ta byłaby sinusoidalna, a nie losowa. W tym przypadku Ra malało wraz ze wzrostem naprężenia ścinającego i czasu, natomiast trendy TE nie mogą być bezpośrednio powiązane z naprężeniem ścinającym przyłożonym do tworzącego się biofilmu w czasie.
<img alt="Konfiguracja akwizycji wielowymiarowej, interfejs oprogramowania z diagramem płytki wielodołkowej do analizy spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina dodatkowa 1"> 
Rycina S1Przechwytywanie obrazu okien oprogramowania sterującego. Okno oprogramowania z otwartym menu Multi Dimensional Acquisition (góra). Moduł sterowania ustawiony na AutoRun (dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania mikroskopowego do analizy obrazu; zintegrowana analiza morfometryczna, akwizycja danych." src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina dodatkowa 2"> 
Rycina S2Przechwycenie obrazu oprogramowania do analizy danych. Okno aplikacji po wybraniu interesującego zestawu danych przy użyciu Przegląd wielowymiarowych danych narzędzie z Narzędzia analityczne menu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju biofilmu, takie jak sposób identyfikacji kluczowych warunków środowiskowych, które wpływają na wzrost biofilmu i cechy behawioralne podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki, jest to, że wielokanałowe, mikrofluidyczne płytki, pozwalają na szybkie uzyskanie statystycznie istotnych wyników. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strukturę biofilmu, może być również stosowana do badania leczenia antybiotykami i bioremediacji.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ potrzebna jest uważna uwaga na szczegóły protokołu i skrupulatne umiejętności. Aby uniknąć błędu połączenia przyrządu z oprogramowaniem, najpierw włącz stację roboczą PC, a następnie moduł fluorescencyjny. Upewnij się, że migawka fluorescencyjna jest włączona i włącz kontrolery sprzętowe.Następnie włącz kontroler systemu obrazowania i kamerę CCD. Następnie włącz stację obrazowania. Gdy wszystkie urządzenia są gotowe, uruchom aplikację sterującą i wprowadź numer rejestracyjny, znajdujący się na etykiecie z boku tabliczki.W celu zagruntowania należy najpierw wyjąć 48-dołkową płytkę mikroprzepływową z opakowania, nie dotykając szklanej powierzchni na dnie płytki, a następnie wyczyść szkiełko podstawowe na dnie płytki chusteczką do soczewek. Aby zalać kanały mikroprzepływowe, odpipetuj 200 mikrolitrów minimalnego medium o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki wyjściowej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie umieść talerz na stoliku talerzowym.Przetrzyj interfejs etanolem, uszczelniając go na stoliku płytowym po wyschnięciu etanolu. W trybie ręcznym na module sterującym ustaw płyn jako bulion Luria-Bertani na 37 stopni Celsjusza, a max sheer na pięć dym na centymetr kwadratowy. Kliknij studzienki wyjściowe, aby aktywować przepływ od wyjścia do studzienki wejściowej, aby zalać kanały.Po pięciu minutach wstrzymaj przepływ, aby przygotować się do siewu, i ostrożnie zdejmij płytkę ze sceny. Następnie odessać resztki medium ze studzienki wyjściowej, nie usuwając żadnego medium z wewnętrznego okręgu, który prowadzi do kanałów mikroprzepływowych. Aby zasiać kanały eksperymentalne, dodaj 300 mikrolitrów minimalnej pożywki do studzienki wejściowej, a następnie dodaj 300 mikrolitrów kultury bakteryjnej do studzienki wyjściowej.Przywróć płytkę do etapu obrazowania, upewniając się, że przetarłeś interfejs etanolem przed umieszczeniem go na płycie, a następnie użyj obrazu z kamery na żywo, aby ustawić ostrość na jednym kanale. Podczas wizualnego monitorowania przekazu na żywo, wznów przepływ przy 1 do 2 dym na centymetr kwadratowy przez około 2 do 4 sekund, aby umożliwić komórkom wejście do kanału eksperymentalnego, ale nie do kanałów serpentynowych, i pozostaw płytkę na etapie o kontrolowanej temperaturze na jedną godzinę, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Pod koniec okresu mocowania ostrożnie wyjmij płytkę ze stolika i zassaj bakterie ze studzienki wyjściowej, nie naruszając kanału.Następnie użyj nowej końcówki pipety, aby usunąć medium z dołków wejściowych. W oprogramowaniu otwórz akwizycję wielowymiarową, aby sterować akwizycją obrazu mikroskopu i wybierz upływ czasu, wiele pozycji stage i wiele długości fal. Na karcie zapisywania utwórz prostą nazwę podstawową, upewniając się, że zaznaczone są wkręty nazwy podstawowej, jeśli plik istnieje.W opisie należy zawrzeć wszystkie istotne informacje o eksperymencie. Kliknij wybierz katalog, aby wybrać folder, w którym zostaną zapisane wszystkie pliki. Na karcie poklatkowej dostosuj czas trwania eksperymentu do 24 godzin i ustaw przedział czasu, aby pobierać obrazy co pięć minut przez cały czas trwania eksperymentu. Użyj obrazu z kamery na żywo i obiektywu 10x, aby ustawić pozycje sceny, skupiając się na środku kanału, znajdującym się powyżej lub poniżej numerów kanałów wygrawerowanych na tabliczce.Przełącz się na obiektyw 20x i znajdź optymalny obszar widzenia i płaszczyznę ogniskową w kanale. Następnie dodaj pozycję sceny do listy z nowymi ustawieniami. W menu długości fal ustaw liczbę długości fal na 3 i ustaw pierwszą długość fali na FITC 100% kamery, z dziesięciomilisekundowym czasem ekspozycji, drugą długością fali na jasne pole 50% kamery 50% widzialnej, z minimalnym czasem ekspozycji 3 milisekundy, a trzecią długość fali na wszystkie zamknięte, więc między czasami akwizycji nie pozostaje żadne światło na ostatnim kanale.W menu edycji automatycznego uruchamiania otwórz zakładkę ustawień protokołu i ustaw nowy protokół o czasie trwania 24 godzin z przepływem ustawionym w kierunku do przodu z odpowiednią eksperymentalną szybkością ścinania. Kliknij dodaj i zapisz jako, aby zapisać protokół i otworzyć kartę ustawień sekwencji. Aby ustawić nową sekwencję, wybierz bulion Luria-Bertani o temperaturze 37 stopni jako domyślny płyn dla wszystkich kanałów.W obszarze iteracji kroku 1 dla kanałów od 1 do 12 wybierz protokół z pierwszą eksperymentalną szybkością ścinania i włącz wszystkie kanały. Dla kanałów od 13 do 24 wybierz protokół z drugą eksperymentalną szybkością ścinania i włącz wszystkie kanały. Następnie wybierz opcję Zastosuj i Zapisz jako, aby zapisać sekwencję i otworzyć menu AutoRun, aby wybrać zapisaną sekwencję, która ma być używana dla AutoRun.Aby przeprowadzić eksperyment z biofilmem wzrostu w czasie, dodaj do 1300 mikrolitrów sterylnego minimalnego podłoża do studzienki wejściowej płytki mikroprzepływowej i przywróć płytkę do etapu obrazowania. Następnie przetrzyj interfejs etanolem i uszczelnij płytkę. Upewnij się, że protokoły i sekwencje są poprawnie skonfigurowane.Wybierz start, aby uruchomić automatyczne uruchamianie, a następnie natychmiast kliknij przycisk pobierz, aby rozpocząć zbieranie obrazów z mikroskopu. Pod koniec pierwszej akwizycji obrazu kliknij pauzę i wybierz tryb obrazu na żywo o długości fali jasnego pola. Wybierz opcję Przejdź do, aby wyświetlić każdą pozycję etapu, a następnie wybierz opcję Ustaw na bieżącą, aby ustawić nowe ustawienia.Następnie kliknij przycisk wznów, zanim rozpoczniesz następne zaplanowane przejęcie. W tym reprezentatywnym eksperymencie z czasowym wzrostem biofilmu, pokrycie biofilmu lub procentowa powierzchnia progowa, była różna dla wszystkich trzech ustawień ścinania, co wskazuje, że ścinanie miało bezpośredni wpływ na pokrycie powierzchni biofilmu. Całkowity względny pomiar akumulacji biofilmu zwiększył się w funkcji czasu, przy czym tempo wzrostu spadło od najwyższego naprężenia ścinającego do najniższego naprężenia ścinającego.W każdym z tych warunków występował również wyraźny okres wykładniczego wzrostu, na podstawie którego można było obliczyć ilościową stopę wzrostu. Ogólnie rzecz biorąc, współczynnik chropowatości zmniejszał się z czasem we wszystkich warunkach ścinania, co wskazuje, że wszystkie powierzchnie biofilmu stały się gładsze. Jednak w porównaniu z najniższym ścinaniem, wyższe ustawienia ścinania spowodowały z czasem gładszą powierzchnię, co wskazuje, że szybszy przepływ ścinania przyczynia się do gładszej i bardziej równej powierzchni.Co więcej, entropia teksturalna, czyli losowość morfologii, wzrastała z czasem dla wszystkich warunków ścinania. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu określonej sekwencji i poświęcić czas na dokładne wykonanie każdego kroku. Opanowanie potrzebnych umiejętności może zająć kilka biegów.Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak HBLC lub GCMS, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stężeń spożywanych subprostych, takich jak glukoza. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biofilmami do badania ogólnych środowisk przepływu w czasie rzeczywistym w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych i pobieraniu próbek z hydroterapii. Nie zapominaj, że praca ze szczepami bakterii BSL2 może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego i stosowanie odpowiednich protokołów postępowania z odpadami.

live-cell-analysis-shear-stress-on-pseudomonas-aeruginosa-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Źródło: Cayron, J., et al. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje, jak przygotować i wykorzystać płytkę mikroprzepływową do obrazowania komórek bakteryjnych w warunkach stresu. Przedstawia proces wprowadzania kultury bakteryjnej i wywołującej stres pożywki antybiotykowej, a następnie ładowania komórek i ustawiania mikroskopu. Obrazowanie poklatkowe w trybie kontrastu fazowego jest następnie wykorzystywane do obserwacji rozwoju...

Mikroskopowa analiza wzrostu bakterii pod wpływem stresu przy użyciu komór mikroprzepływowych

Źródło: Sutlief, A. L. i in. Analiza naprężeń ścinających na żywych komórkach na Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu mikrofluidycznego o wyższej przepustowości. J. Vis. Exp. (2019).Ten film prezentuje przygotowanie płytki mikrofluidycznej do badań naprężeń ścinających w kulturach bakteryjnych. Po przygotowaniu kanałów podłożem, komórki bakteryjne są wprowadzane do kanału eksperymentalnego i inkubowane do przyczepienia. Pozostałe nośniki i hodowla są usuwane, aby...

Przygotowanie płytki mikrofluidycznej z komórkami bakteryjnymi

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Poznaj analizę naprężeń ścinających w biofilmach Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego z fluorescencyjnym mikroskopem. Metoda umożliwia szybkie uzyskanie istotnych statystycznie wyników dotyczących pokrycia i morfologii biofilmu.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów