Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do badania obecności biomarkera glejaka za pomocą metody, która zachowuje strukturę 3D neurosfer guza. Główną zaletą tego protokołu jest to, że morfologia neurosfer jest zachowana w porównaniu z metodą cytospinową, w której komórki są poddawane stresującej manipulacji i ulegają spłaszczeniu. Metoda ta może być stosowana do wszelkich innych systemów hodowli tkankowych, w których komórki są hodowane w 3D, a utrzymanie struktury jest ważne.

Na początek hoduj neurosfery guza lub NS w kolbie T-25, aż komórki się zlewają. Wybierz guz NS w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Wstrzykiwać NS w temperaturze 300 G przez pięć minut.

Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10% formaliny i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj pięć mililitrów HBSS do ponownie zawieszonego NS. Zanurz ogniwa w peleryncie zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieść probówkę zawierającą osad na lodzie.

Ponownie zawiesić umyty granulat NS w 500 mikrolitrach dwuprocentowej ciepłej płynnej agarozy. I wymieszać przez delikatne pipetowanie lub mieszanie. Umieść agarozę osadzoną w NS na lodzie, aż agaroza ulegnie polimeryzacji.

Następnie usuń kawałek agarozy, trzymając NS. Umieść kawałek agarozy w kasecie do przetwarzania tkanek. Ustaw łaźnię wodną na 42 stopnie Celsjusza. I ostrożnie włóż ostrze do mikrotomu.

Następnie umieść blok parafiny w mikrotomie. Jedną ręką naciśnij dźwignię kontrolującą grubość każdej sekcji znajdującą się po lewej stronie maszyny. Naciśnij dźwignię do drugiego oporu, aby ustawić mikrotom na grubość 30 mikrometrów.

Obróć grube pokrętło, aby rozpocząć przycinanie bloku. Gdy powierzchnia próbki jest prawie odsłonięta, ustaw dźwignię kontrolującą grubość na pięć lub 10 mikrometrów. Przerwij przycinanie, gdy dojdziesz do powierzchni próbki.

Napełnij pojemnik na lód lodem i tylko taką ilością wody, aby chronić blok parafiny przed bezpośrednim dotknięciem lodu. Wyrzuć stare ostrze mikrotomu i włóż nowe do cięcia. Osusz blok parafiny gazą i umieść go na mikrotomie.

Obróć grube pokrętło ręczne, aby rozpocząć cięcie parafiny. Następnie wilgotnym pędzlem przenieś wstęgę parafinową do łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Korzystając z krzywizny kleszczy, umieść kleszcze między dwoma sekcjami parafiny i delikatnie rozsuń sekcje.

Za pomocą wilgotnego pędzla wepchnij oddzielone sekcje na dodatnio naładowane adhezyjne szkiełka mikroskopowe. Najpierw rozpuść parafinę, inkubując szkiełka w metalowym stojaku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie odparafinować szkiełka poprzez inkubację w pociągu do nawadniania w temperaturze pokojowej zgodnie z protokołem tekstowym.

Szkiełka należy przechowywać w wodzie z kranu, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Następnie inkubować szkiełka w buforze cytrynianowym w temperaturze 125 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 90 stopni Celsjusza przez 10 sekund. Poczekaj, aż szkiełka ostygną, a następnie spłucz je pięciokrotnie wodą destylowaną.

Następnie inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w 0,3% nadtlenku wodoru przez 20 minut. Następnie myć szkiełka przez pięć minut, trzykrotnie w buforze do mycia, delikatnie mieszając. Inkubować szkiełka przez noc w wilgotnej komorze ustawionej na cztery stopnie Celsjusza z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym.

Następnie umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut, delikatnie mieszając. Następnie inkubować szkiełka w rozcieńczonym biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez godzinę. Myć szkiełka trzy razy przez pięć minut w buforze myjącym, delikatnie mieszając.

Następnie inkubuj szkiełka w kompleksie peroksydazy chrzanowej z biotynylowaną awidyną w temperaturze pokojowej w ciemności przez godzinę. Powtórz pranie zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie inkubuj szkiełka z substratami nadtlenku wodoru DAB przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej.

Opłucz szkiełka wodą z kranu i zanurz je w roztworze hematoksyliny, aby je zanieczyścić. Następnie dokładnie opłucz szkiełka w wodzie z kranu, aż woda będzie czysta. Odwodnić szkiełka zgodnie z protokołem tekstowym.

Na koniec nakryj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu i pozostaw do wyschnięcia na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej. W tym protokole NS są utrwalone i zatopione w agarozie i parafinie. A następnie są barwione pod kątem określonych biomarkerów glejaka.

Poziom ekspresji ATRX, białka opiekuńczego, które pośredniczy w strukturze chromatyny, jest niski. Ki67, biomarker proliferacji komórek, jest dodatni w glejaku NS. Wreszcie, NS są również dodatnie dla OLIG2, czynnika transkrypcyjnego, który pośredniczy w różnicowaniu oligodendrocytów. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest ponowne zawieszenie komórek w ciepłej agarozie przed przeniesieniem do lodu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie neurosfer.