Name: Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemii w neurosferach glejaka z zachowaniem struktury 3D podczas zatapiania w parafinie. Technika ta umożliwia dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NIH/NINDS) Granty R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 dla M.G.C.; NIH/NINDS przyznaje R01-NS076991, R01-NS082311 i R01-NS096756 dla P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Klinika Neurochirurgii; Szczęśliwe serca Lei do M.G.C. i P.R.L.; i RNA Biomedicine Grant F046166 dla M.G.C. F.M.M. jest wspierany przez F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. był wspierany przez stypendium Fulbrighta i argentyńskiego Ministerstwa Sportu i Edukacji.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
1. Generowanie neurosfer guza mózgu pochodzących z modelu mysiego
<ol>
	<li>Przed zabiegiem preparacji należy przygotować pożywkę z nerwowych komórek macierzystych (pożywki NSC: DMEM/F12 z 1x suplementem B27, 1x suplementem N2, 1x normocyną i 1x antybiotykiem/antybiotykiem uzupełnionym ludzkim rekombinowanym EGF i zasadowym FGF w stężeniach 20 ng/ml każdy). Napełnij probówkę o pojemności 1,5 ml 300 μl pożywki NSC i odłóż na później.</li>
	<li>Wybierz mysz z dużym guzem. 
	UWAGA: Wielkość guza może być monitorowana za pomocą bioluminescencji, jeśli wstrzyknięty plazmid lub wirus koduje lucyferynę. Zwykle duży guz ma bioluminescencję > 106 fotonów/s/cm2/sr.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji z przedawkowaniem izofluranu: napełnij bibułkę izofluranem i wprowadź tkankę do komory eutanazji, unikając bezpośredniego kontaktu z myszami, aby zapobiec podrażnieniu. Poczekaj, aż myszy nie będą wykazywać odruchu pedałowania (zwykle 5-10 min). Odetnij głowę myszy i przeprowadź sekcję mózgu, jak opisano w Calinescu i wsp.13.</li>
	<li>Jeśli guzy są fluorescencyjne, użyj mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w lampę fluorescencyjną, aby zidentyfikować masę guza w mózgu. Za pomocą cienkich kleszczy wypreparuj guz (zwykle o średnicy 5-7 mm) z normalnej tkanki mózgowej.</li>
	<li>Umieść wypreparowany guz w probówce o pojemności 1,5 ml z pożywką NSC (krok 1.1). Homogenizuj guz za pomocą jednorazowego plastikowego tłuczka, który pasuje do ścianek probówki mikrowirówki, wywierając delikatny nacisk.</li>
	<li>Aby dysocjować grudki komórek, dodać 1 ml bezenzymatycznego podłoża dysocjacyjnego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm i przemyć sitko 20 ml pożywki NSC.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 6 ml lub 15 ml pożywki NSC, w zależności od wielkości osadu.</li>
	<li>Zawiesinę komórek nowotworowych umieścić w kolbie hodowlanej T-25 lub T-75 i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2.</li>
	<li>Po 3 dniach przenieść zdrowe zawieszone NS i ponownie umieścić je w kolbie do hodowli tkankowej T-25 lub T-75. W razie potrzeby dodaj więcej pożywki NSC do kultury. 
	UWAGA: Zazwyczaj będzie to mieszana populacja komórek, niektóre będą martwe, niektóre będą się zlodować, a niektóre będą tworzyć NS, które będą unosić się w pożywce</li>
</ol>
2. Utrzymanie i przekazywanie NS
UWAGA: Zapobiegaj przerostowi i utrzymuj komórki w stosunkowo wysokim zagęszczeniu. Konfluencja zależy od wielkości sfer (czarne środki dużych sfer oznaczają przerost). Tempo wzrostu NS będzie zależało od onkogenów wykorzystywanych do generowania nowotworów.
<ol>
	<li>Gdy kultura NS osiągnie zbieżność, zebrać kulturę do sterylnej probówki wirówkowej i granulować NS w ilości 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek i odpipetować w celu ponownego zawieszenia osadu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, przesuwając probówkę co 2 minuty, aby wspomóc dysocjację komórek. 
	UWAGA: Kiedy NS osiągają konfluencję, zwykle można je zobaczyć makroskopowo jako małe białe kule. Aby zapewnić dysocjację komórek, przynajmniej wszystkie widoczne NS musiały zniknąć.</li>
	<li>Dodaj 5 ml HBSS 1x i kilkakrotnie odpipetować. Komórki osadu po 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki NSC uzupełnionej rekombinowanym EGF i zasadowym FGF.</li>
	<li>Dodać 1 ml komórek do 15 ml pożywki NSC i hodowli w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2.</li>
	<li>Dodawaj czynniki wzrostu (EGF i basic-FGF) co 3 dni. Jeśli podłoże zmieni kolor na jasnopomarańczowy, a komórki nie są jeszcze zlewne, zmień pożywkę. W tym celu należy odwirować NS przy 300 x g przez 4 minuty i ponownie zawiesić w pożywce NSC uzupełnionej czynnikami wzrostu. 
	UWAGA: W zależności od wielkości utworzonej osadki, komórki mogą wymagać podzielenia na więcej kolb.</li>
</ol>
3. Zamrażanie NS do długoterminowego przechowywania
<ol>
	<li>Gdy kultura NS zacznie się zlewać, oddziel komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.4. Po ponownym zawieszeniu osadu w HBSS należy usunąć podwielokrotność i policzyć komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 4 minuty i usunąć jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulat w medium zamrażającym (inaktywowany termicznie FBS, 10% DMSO). Zaleca się zamrażanie od 1 x 106 do 3 x 106 komórek na fiolkę na ml.</li>
	<li>Podzielić ponownie zawieszone komórki w tylu kriowialach, ile potrzeba, i powoli schłodzić fiolki, najpierw przenosząc je do lodu, następnie do -20 °C, następnie do -80 °C, a na koniec następnego dnia do pojemnika do przechowywania ciekłego azotu.</li>
</ol>
4. Utrwalenie guza NS
<ol>
	<li>Hoduj nowotwór NS w kolbie T-25 przez 2-3 dni, aż komórki się zlewają (~ 3 x 106 komórek). Zebrać nowotwór NS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z co najmniej jednej kolby zlewającej T-25. Osad po 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml 10% formaliny i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Dodać 5 ml 1x HBSS i osadzać komórki, jak to zrobiono w kroku 3.2. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Umieść stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą osad na lodzie.</li>
</ol>
5. Osadzanie parafiny w guzie NS
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić przemyty granulat NS w 500 μl 2% ciepłej płynnej agarozy i delikatnie wymieszać pipetując.</li>
	<li>Natychmiast umieść NS zatopiony w agarozie na lodzie, aż agaroza ulegnie polimeryzacji. Usuń kawałek agarozy, w którym znajduje się NS. Umieść spolimeryzowany kawałek agarozy z NS w kasecie do przetwarzania tkanek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Kontynuuj przetwarzanie tkanek (przy użyciu automatycznego procesora parafinowego) i zatapianie parafiny (przy użyciu stacji zatapiania).</li>
</ol>
6. Cięcie NS zatopionego w parafinie
<ol>
	<li>Ustaw łaźnię wodną na 42 °C i ostrożnie włóż ostrze do mikrotomu za pomocą dwóch pędzli malarskich, aby upewnić się, że jest wypoziomowane. Używaj tego ostrza tylko do przycinania.</li>
	<li>Umieść blok parafiny na mikrotomie. Ręką niedominującą naciśnij dźwignię znajdującą się po lewej stronie, która kontroluje grubość każdej sekcji. Naciśnij do drugiego oporu, który wskazuje grubość 30 μm.</li>
	<li>Rozpocznij przycinanie bloku (tj. usuwanie nadmiaru parafiny), obracając pokrętłem zgrubnym prawą ręką, aż do osiągnięcia powierzchni próbki. W tym momencie zwolnij dźwignię kontrolującą grubość przycinania do 10 μm lub 5 μm. Przerwij przycinanie, gdy dojdziesz do powierzchni próbki.</li>
	<li>Napełnij pojemnik na lód lodem i dodaj tylko tyle wody, aby po umieszczeniu bloku parafiny na lodzie woda działała jak film wokół bloku parafinowego, chroniąc go przed bezpośrednim dotknięciem lodu. Inkubować blok parafiny na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Wyrzuć stare ostrze i włóż nowe do cięcia. Osusz blok za pomocą gazy, a następnie umieść go na mikrotomie.</li>
	<li>Ręką niedominującą zaopatrz się w parę zakrzywionych kleszczy, które posłużą do pociągnięcia wstążki parafinowej. W pobliżu prawej ręki trzymaj wilgotny pędzel, który posłuży do przeniesienia wstążki parafinowej do łaźni wodnej. Rozpocznij cięcie, obracając zgrubne pokrętło ręczne prawą ręką w szybkim tempie. Użyj kleszczyków w lewej ręce, aby przytrzymać wstążkę parafinową.</li>
	<li>Za pomocą wilgotnego pędzla przenieś wstęgę parafinową do łaźni wodnej.</li>
	<li>Użyj krzywizny kleszczy, aby rozdzielić sekcje, powierzchownie umieszczając kleszcze między dwoma sekcjami parafiny, a następnie delikatnie odpychając dwie sekcje. 
	UWAGA: Ten ruch powinien odbywać się w całości na powierzchni sekcji parafiny. Nie naciskaj sekcji.</li>
	<li>Za pomocą wilgotnego pędzla wepchnij oddzielone skrawki parafiny na dodatnio naładowane adhezyjne szkiełka mikroskopowe.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w okapie chemicznym przed przechowywaniem ich w pudełkach na slajdy. Przechowywanie szkiełek zależy od rodzaju wykonanej bejcy.</li>
</ol>
7. Immunohistochemia (IHC) NS zatopionego w parafinie
<ol>
	<li>Rozpuść parafinę, umieszczając szkiełka w metalowym stojaku i inkubując je w temperaturze 60 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Deparafinować szkiełka przez inkubację w pociągu do nawadniania w temperaturze pokojowej: 3x ksylen przez 5 min, 100% 2x etanol przez 2 min, 95% 2x etanol przez 2 min, 70% 1x etanol przez 2 min i 1x woda dejonizowana przez 2 min. Następnie należy przechowywać szkiełka w wodzie z kranu do czasu pobrania antygenu, ponieważ wysuszenie spowoduje niespecyficzne wiązanie przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w buforze cytrynianowym (10 mM kwasu cytrynowego, 0,05% detergentu niejonowego, pH 6) w temperaturze 125 °C przez 30 s i w temperaturze 90 °C przez 10 s. Pozwól im ostygnąć, a następnie spłucz szkiełka 5 razy wodą destylowaną.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w 0,3% H2O2 przez 30 min.</li>
	<li>Umyj szkiełka 3 razy w buforze myjącym (0,025% detergentu w TBS) przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (10% surowicy końskiej, 0,1% BSA w TBS) przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze z pierwszorzędowym przeciwciałem przygotowanym w roztworze rozcieńczonym (0,1% masy ciała w TBS). Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przygotowanym w roztworze rozcieńczającym. Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut z kompleksem peroksydazy chrzanowej i biotynylowanej. Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka z markami substratów DAB-H2O2 przez 2-5 minut w RT.</li>
	<li>Spłucz 3 razy wodą z kranu. Zanurz (1-2 s) szkiełka w roztworze hematoksyliny, aby przeciwdziałać plamom, i dokładnie spłucz je w wodzie z kranu, aż do oczyszczenia.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w następujący sposób: inkubować w wodzie destylowanej przez 2 minuty, zanurzyć 3 razy w 80% etanolu, inkubować w 95% etanolu 2 razy po 2 minuty, inkubować w 100% etanolu 2 razy po 2 minuty, a na koniec w ksylenie 3 razy po 3 minuty.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe należy pokryć podłożem montażowym na bazie ksylenu i pozostawić do wyschnięcia na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do obrazowania. UWAGA: W przypadku barwienia 3,3'-diaminobenzydyną (DAB) szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej. Jeśli jednak przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne, szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C, aby ograniczyć fotowybielanie.</li>
</ol>

<ol><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropatholica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+diagnostics+and+biomarkers%3A+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li>
<li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li>
<li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1%2C000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li>
<li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li>
<li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li>
<li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li>
<li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li>
<li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+index+in+intracranial+ependymoma%3A+a+promising+histopathological+candidate+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li>
<li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource%3A+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425(2006).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li>
<li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088(2014).</li>
<li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry%3A+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule szczegółowo opisujemy wszechstronną i powtarzalną metodę przeprowadzania immunohistochemii na glejaku NS zatopionym w parafinie, który utrzymuje charakterystyczną strukturę 3D komórek nowotworowych rosnących w mózgu in situ. Technika ta ma następujące zalety w porównaniu z wykorzystaniem komórek platerowanych na powierzchniach szklanych lub plastikowych: i) zachowanie struktury 3D NS; ii) unikanie stresu związanego z dysocjacją komórek przed analizą ekspresji białek; iii) wygaszanie jakiejkolwiek ...

Glejaki są pierwotnymi guzami litymi ośrodkowego układu nerwowego, klasyfikowanymi według cech fenotypowych i genotypowych według Światowej Organizacji Zdrowia1. Klasyfikacja ta uwzględnia obecność lub brak mutacji napędzających, które stanowią atrakcyjne źródło biomarkerów2. Biomarkery to cechy biologiczne, które mogą być mierzone i oceniane w celu wskazania normalnych i patologicznych procesów, a także reakcji farmakologicznych na interwencję terapeutyczną3. Biomarkery można wykryć w tkance nowotworowej i komórkach pochodzących z glejaka, umożliwiając jego biologiczną charakterystykę w różnych aspektach. Niektóre przykłady biomarkerów glejaka obejmują zmutowaną dehydrogenazę izocytrynianową 1 (IDH1), zmutowany enzym charakterystyczny dla glejaków o niższym stopniu złośliwości, związany z lepszym rokowaniem4. Zmutowany IDH1 jest często wyrażany w połączeniu z mutacjami inaktywującymi TP53 i alfa-talasemią/upośledzeniem umysłowym (ATRX), definiując specyficzny podtyp glejaka4,5. Mutacje inaktywujące ATRX występują również w 44% glejaków wysokiego stopnia u dzieci2,6 i są związane z agresywnymi nowotworami i niestabilnością genomu6,7. Ponadto rozlane glejaki mostu u dzieci (DIPG) są zróżnicowane w podgrupach w zależności od obecności lub braku mutacji K27M w genie histonu H3 H3F3A lub w genie HIST1H3B/C 1,6. Dlatego wprowadzenie charakterystyki molekularnej pozwala na podział, badanie i leczenie glejaków jako odrębnych jednostek, co pozwoli na opracowanie bardziej ukierunkowanych terapii dla każdego podtypu. Ponadto analiza biomarkerów może być wykorzystana do oceny różnych procesów biologicznych, takich jak apoptoza8, autofagia9, progresja cyklu komórkowego10, proliferacja komórek11 i różnicowanie komórek12.
Genetycznie modyfikowane modele zwierzęce, które zawierają zmiany genetyczne obecne w ludzkich nowotworach, są kluczowe dla badania szlaków sygnałowych, które pośredniczą w postępie choroby. Nasze laboratorium wdrożyło system transpozazy Śpiącej Królewny (SB) do opracowania genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli glejaka zawierających specyficzne mutacje, które rekapitulują podtypy glejaka ludzkiego13,14. Te genetycznie zmodyfikowane modele myszy są wykorzystywane do generowania NS pochodzących z guza, które umożliwiają badania in vitro w systemie 3D, odzwierciedlając istotne cechy obecne w guzach in situ15. Ponadto ortotopalny przeszczep NS do myszy może generować guzy wtórne, które zachowują cechy guza pierwotnego i naśladują właściwości histopatologiczne, genomiczne i fenotypowe odpowiedniego guza pierwotnego15.
W hodowli bez surowicy, komórki guza mózgu o właściwościach komórek macierzystych mogą być wzbogacone, a w obecności czynników wzrostu naskórka (EGF) i czynników wzrostu fibroblastów (FGF), mogą być hodowane jako kolonie pochodzące z pojedynczych komórek, takie jak kultury NS. W tym selektywnym systemie hodowli większość różnicujących się lub zróżnicowanych komórek szybko umiera, podczas gdy komórki macierzyste dzielą się i tworzą klastry komórkowe. Pozwala to na wygenerowanie hodowli NS, która utrzymuje cechy guza glejaka16,17,18. Glejak NS może być stosowany do oceny kilku aspektów biologii nowotworu, w tym analizy biomarkerów, które mają zastosowanie w diagnostyce, rokowaniu, klasyfikacji, stanie progresji guza i stanie różnicowania komórek. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół generowania glejaka NS i osadzania kultur 3D w parafinie, które mają być używane do barwienia IHC. Jedną z zalet utrwalania i osadzania glejaka NS jest to, że morfologia NS jest lepiej zachowana w porównaniu z konwencjonalną metodą cytospinową19, w której glejak NS jest poddawany stresującej manipulacji w celu dysocjacji komórek i ulega spłaszczeniu. Ponadto osadzanie wygasza wszelką endogenną ekspresję fluoroforu z genetycznie zmodyfikowanego guza NS, umożliwiając barwienie w widmach fluorescencyjnych. Ogólnym celem tej metody jest zachowanie struktury 3D komórek glejaka poprzez proces osadzania parafiny i umożliwienie scharakteryzowania neurosfer glejaka za pomocą immunohistochemii.

<table><tbody><tr><td>Powlekane ostrze mikrotomu HP35</td><td>Thermo Scientific</td><td>3150734</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom RM 2135</td><td>Leica</td><td>MR2135</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-ATRX królika,</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15408</td><td>IHC, rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-Ki-67 dla królika</td><td>Abcam</td><td>Ab15580</td><td>IHC, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-OLIG2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>IHC, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Koza poliklonalna anty-królicza biotyna sprzężona z biotyną</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td>IHC, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP</td><td>kit Vector Laboratories Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td><td>Biocare medical</td><td>BDB2004 L/cena do 12/18</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-27 Suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&reg; Roztwór do oddzielania komórek</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE LE</td><td>GoldBio</td><td>A-201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Olympus 15 ml</td><td>21-103</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Kolba poddana działaniu TC-75</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Kolba poddana działaniu TC-25</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NS</td></tr><tr><td>media HBSS</td><td>GibcoTM</td><td>14175-103</td><td>zrównoważony roztwór soli</td></tr><tr><td>C57BL/6</td> Mysz <td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6</td></tr></tbody></table>

ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3d glejaka zatopionych w parafinie

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analiza ekspresji białka w glejaku jest istotna dla kilku aspektów badania jego patologii. Wiele białek zostało opisanych jako biomarkery mające zastosowanie w diagnostyce, prognozowaniu, klasyfikacji, stanie progresji guza i stanie różnicowania komórek. Te analizy biomarkerów są również przydatne do charakteryzowania neurosfer nowotworowych (NS) generowanych przez pacjentów z glejakiem i modeli glejaka. Tumor NS stanowi cenny model in vitro do oceny różnych cech guza, z którego pochodzą, i może dokładniej odzwierciedlać biologię glejaka. Tutaj opisujemy szczegółową metodę analizy biomarkerów w NS guza za pomocą immunohistochemii (IHC) na NS guza zatopionego w parafinie.

Aby monitorować rozwój guza i ocenić, czy osiągnął on rozmiar niezbędny do generowania NS, analizowaliśmy luminescencję emitowaną przez guzy za pomocą bioluminescencji. Pozwala to na badanie wydajności transdukcji u szczeniąt oraz progresji guza poprzez sygnał luminescencyjny lucyferazy (Rycina 1A i 1B). Gdy rozmiar guza osiągnie sygnał 1 x 107 photons/s/cm2/sr (Rycina 1B</stro...

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do badania obecności biomarkera glejaka za pomocą metody, która zachowuje strukturę 3D neurosfer guza. Główną zaletą tego protokołu jest to, że morfologia neurosfer jest zachowana w porównaniu z metodą cytospinową, w której komórki są poddawane stresującej manipulacji i ulegają spłaszczeniu. Metoda ta może być stosowana do wszelkich innych systemów hodowli tkankowych, w których komórki są hodowane w 3D, a utrzymanie struktury jest ważne.Na początek hoduj neurosfery guza lub NS w kolbie T-25, aż komórki się zlewają. Wybierz guz NS w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Wstrzykiwać NS w temperaturze 300 G przez pięć minut.Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10% formaliny i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj pięć mililitrów HBSS do ponownie zawieszonego NS. Zanurz ogniwa w peleryncie zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieść probówkę zawierającą osad na lodzie.Ponownie zawiesić umyty granulat NS w 500 mikrolitrach dwuprocentowej ciepłej płynnej agarozy. I wymieszać przez delikatne pipetowanie lub mieszanie. Umieść agarozę osadzoną w NS na lodzie, aż agaroza ulegnie polimeryzacji.Nastę

evaluation-biomarkers-glioma-immunohistochemistry-on-paraffin

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Źródło: Núñez, F. J., et al. Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na zatopionych w parafinie kulturach neurosfery glejaka 3D. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia immunohistochemiczną technikę znakowania biomarkerów nowotworowych w neurosferach guza mózgu zanurzonych w parafinie. Skrawki neurosfery poddawane są usuwaniu parafiny i nawadnianiu, a następnie leczeniu w celu odsłonięcia miejsc biomarkerów. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w...

Barwienie immunohistochemiczne biomarkerów w skrawkach neurosfery guza mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Poznaj metodę immunohistochemii w neurosferach glejaka z zachowaniem struktury 3D podczas zatapiania w parafinie. Technika ta umożliwia dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów