Name: Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj trzy testy in vitro do oceny migracji, inwazji i proliferacji ludzkich komórek trofoblastu z pierwszego trymestru ciąży. Metody te umożliwiają wizualną i ilościową analizę czynników wpływających na inwazję trofoblastu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Gilowi Morowi za dostarczenie komórek Sw.71. Badania te zostały wsparte nagrodą Albert McKern Scholar Award dla S.W.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w kolbach T-75 w standardowych pożywkach wzrostowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. 
	nuta: Komórkami użytymi w tych eksperymentach były unieśmiertelnione linie komórkowe trofoblastu pierwszego trymestru Swan.71 (Sw.71) i HTR-8/SVneo9,10. Komórki Sw.71 utrzymywano w DMEM/F-12 uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1,0 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES, 0,10 mM aminokwasów endogennych MEM, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Ogniwa HTR-8/SVneo utrzymywano w RPMI-1640 uzupełnionym 5% inaktywowanym termicznie FBS.</li>
	<li>Pozwól komórkom się replikować, aż osiągną 90-100% konfluencji. Używając sterylnego kaptura przepływowego do hodowli tkankowych, odessać pożywkę z kolby i przemyć komórki 10 ml sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS).</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 5 ml 1x (0,05%) trypsyny-EDTA do kolby, upewniając się, że komórki są pokryte trypsyną. Umieścić kolbę w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%, aż wszystkie komórki oderwą się od dna kolby (około 5-10 minut).</li>
	<li>Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej do kolby, aby dezaktywować trypsynę-EDTA.</li>
</ol>
2. Test zarysowania
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 1.4, zasiej odpowiednią liczbę komórek do 24-dołkowej płytki, aby osiągnąć 100% konfluencję w ciągu 48 godzin 
	nuta: Możliwe jest wykonanie testu zarysowania z wieloma różnymi układami płytek. Maksymalna liczba dołków dozwolona przez narzędzie do usuwania ran to format 96 dołków.</li>
	<li>Następnego dnia (dzień przed testem zarysowania) zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej, uzupełnioną w razie potrzeby, w tym inaktywowaną termicznie, pozbawioną dekstranu węglowego FBS. 
	nuta: Inne badania zalecały stosowanie pożywek o niskim stężeniu FBS (np. 1%) w celu zminimalizowania proliferacji komórek, które mogą być stosowane jako alternatywa w tym protokole11.</li>
	<li>W dniu testu zarysowania należy poddać komórki wstępnej obróbce przez 30 minut, dodając pożądaną obróbkę do pożywki w każdym dołku. W opisanych eksperymentach wykorzystano nośnik (1x PBS) i 100 nM deksametazon rozcieńczony w 1x PBS.</li>
	<li>Aby uzyskać jednolite rany, umieść sterylne końcówki do pipet o pojemności 10 μl na kołkach narzędzia do tworzenia ran. Opuść końcówki do pierwszego rzędu studzienek i przesuwaj płytkę wzdłuż toru urządzenia do nawijania, aż końcówki pipet dotrą do drugiej strony dołka.
	<ol>
		<li>Przesuń płytkę z powrotem do pozycji wyjściowej, pozwalając, aby końcówki pipet w sposób ciągły dotykały dna płytki, aby zapewnić stałe nawinięcie w poprzek średnicy dołka. Wyjąć i wymienić sterylne końcówki do pipet o pojemności 10 μl i opuścić końcówki do następnego rzędu studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj krok 2.4, aż wszystkie studzienki zostaną porysowane. 
	nuta: Jeśli narzędzie do usuwania ran nie jest dostępne, rany można utworzyć, ręcznie zeskrobując środek studzienek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę i delikatnie umyć komórki dwukrotnie 1x PBS. Po ostatnim myciu dodać uzupełnione pożywki wolne od czerwieni fenolowej, pozbawione pasków lub o niskiej zawartości FBS z żądaną obróbką lub nośnikiem (zgodnie z zaleceniami w kroku 2.3). 
	nuta: Ogniwa HTR-8/SVneo należy przemywać pożywką z dodatkiem czerwieni fenolowej, ponieważ mycie 1x PBS spowoduje oderwanie się komórek.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą porysowane studzienki w automatycznym obrazie poklatkowym (patrz Tabela materiałów) umieszczonym w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Obraz jest odtwarzany w regularnych odstępach czasu, w razie potrzeby, aby umożliwić komórkom całkowite gojenie się ran (np. co 2 godziny przez 72 godziny).</li>
	<li>Oblicz gęstość i szerokość rany za pomocą oprogramowania powiązanego z automatyczną kamerą poklatkową (patrz Tabela materiałów). Aby obliczyć procentową zmianę rozmiaru rany w stosunku do wielkości rany początkowej, ustaw szerokość rany w czasie 0 równą 100%. Podziel rozmiar rany w każdym kolejnym punkcie czasowym przez rozmiar rany w czasie 0 i pomnóż przez 100, aby uzyskać wartość procentową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
3. Test inwazji
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 1.4, umieść odpowiednią liczbę komórek na płytkach 6-dołkowych, aby umożliwić komórkom osiągnięcie 90% konfluencji w ciągu 48 godzin. Utrzymuj komórki w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na 37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności.</li>
	<li>Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej, uzupełnioną w razie potrzeby, w tym inaktywowaną termicznie, pozbawioną dekstranu węglowego FBS. 
	nuta: Komórki mogą być wstępnie poddane obróbce w tym czasie, w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
	<li>W tym czasie umieścić fiolkę z macierzą zewnątrzkomórkową 10 mg/ml (patrz Tabela Materiałów) na lodzie i pozostawić do rozmrożenia w lodówce na noc.</li>
	<li>Następnego dnia należy przeprowadzić test inwazji przed schłodzeniem, umieszczając 24-dołkowe płytki, wkładki do kultur komórkowych, probówki do mikrowirówek i końcówki pipet w lodówce (4 °C) na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pracy z macierzą zewnątrzkomórkową.</li>
	<li>Korzystając ze schłodzonych materiałów w kapturze do hodowli tkankowych, rozcieńczyć 10 mg/ml macierzy zewnątrzkomórkowej 1:1 pożywką wolną od czerwieni fenolowej i surowicy do końcowego stężenia 5 mg/ml. 
	nuta: Zawsze trzymaj bulion i rozcieńczoną macierz zewnątrzkomórkową na lodzie. Stosunek macierzy zewnątrzkomórkowej do pożywki można dostosować w oparciu o właściwości linii komórkowej użytej w teście.</li>
	<li>Używając schłodzonych materiałów w kapturze do hodowli tkankowych, dodać 100 μl rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej do wkładek (patrz tabela materiałów), które zostały umieszczone na płytce 24-dołkowej. Upewnij się, że matryca jest wypoziomowana bez żadnych pęcherzyków. Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą wkładki pokryte matrycą w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby umożliwić stwardnienie matrycy.</li>
	<li>Aby przygotować komórki do testu inwazji, umyj komórki 1 ml 1x PBS, odessaj PBS i dodaj 500 μl 1x trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%, aż wszystkie komórki oderwą się od dna płytki.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek dodaj 500 μl pożywki wolnej od czerwieni fenolowej i surowicy do każdej studzienki z trypsynizowanymi komórkami.</li>
	<li>Przenieść 1 000 μl oddzielonych komórek do probówki mikrowirówkowej i wirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej i surowicy (objętość zależy od stężenia komórek). Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów) i dostosuj objętość zawiesiny komórek do końcowego stężenia 5 x 105 komórek na ml. 
	nuta: Hemocytometr i mikroskop mogą być również używane do liczenia komórek.</li>
	<li>Dodać 600 μl kompletnej pożywki wzrostowej do dołków 24-dołkowej płytki, która zostanie użyta do testu inwazji. 
	nuta: Dodatkowe chemoatraktanty lub zabiegi mogą być dodawane do kompletnego podłoża wzrostowego w studzience (dolna komora). W opisanych eksperymentach do dolnej komory dodano nośnik (1x PBS) lub 100 nM deksametazon rozcieńczony w 1x PBS.</li>
	<li>Umieść wstępnie pokrytą wkładkę w każdej studzience zawierającej kompletne podłoże wzrostowe, które zostanie użyte do testu inwazji. Następnie dodaj 200 μl komórek na wierzchu każdej wstępnie powlekanej wkładki komórkowej (górna komora), aby uzyskać w sumie 1 x 105 komórek. 
	nuta: Jako kontrolę ujemną dla tego testu, do górnej komory można dodać równą objętość pożywki wolnej od czerwieni fenolowej i surowicy (bez komórek).</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 24 godziny 
	nuta: 24-godzinny okres inkubacji został zoptymalizowany dla unieśmiertelnionych komórek trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży i mogą być wymagane dalsze badania w celu określenia wymaganego okresu inkubacji w innych liniach komórkowych.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji odessać pozostałe pożywki z górnej i dolnej komory, nie naruszając macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie ostrożnie usuń macierz zewnątrzkomórkową i niezaatakowane komórki z górnej części wkładki za pomocą bawełnianego wacika, pobierając wymaz tyle razy, ile jest to konieczne, aby usunąć macierz zewnątrzkomórkową.</li>
	<li>Umyj każdą wkładkę 3x 1x PBS, dodając PBS zarówno do górnej, jak i dolnej komory studzienki. Odsysaj PBS po każdym praniu.</li>
	<li>Zamocuj komórki przymocowane do wkładów, umieszczając wkładki w 100% lodowatym metanolu na 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyj wkładki 3x 1x PBS i usuń PBS po ostatnim myciu. Ogniwa przymocowane do wkładek należy barwić przez 10 minut 0,2% fioletu krystalicznego w 20% etanolu.</li>
	<li>Spłucz 3x wodą dejonizowaną i odessaj wodę dejonizowaną po ostatnim myciu.</li>
	<li>Wkładki suszyć na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Za pomocą kleszczy i żyletki ostrożnie odetnij dolną membranę wkładu i zamontuj na szklanym szkiełku dolną stroną do góry. Pozostaw media montażowe do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uzyskaj co najmniej 4 unikalne obrazy zaatakowanych komórek na próbkę za pomocą mikroskopu świetlnego z obiektywem 20x. Policz całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie i znormalizuj liczbę komórek, aby kontrolować próbki i wykreślić dane (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Test proliferacji
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 1.4, policz trypsynizowane komórki z kolby za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiew na 6-dołkowe płytki o gęstości 2 x 105 komórek na basenik w standardowej pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 4 godziny lub do momentu, gdy komórki się zdrewnują.</li>
	<li>Zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej, uzupełnioną w razie potrzeby, w tym FBS inaktywowany termicznie, pozbawiony dekstranu węglowego i dodaj żądaną obróbkę. W opisanych eksperymentach dodano nośnik (1x PBS) lub 100 nM deksametazon rozcieńczony w 1x PBS. Umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
	<li>Usuń pożywkę i zastąp ją nową pożywką i obróbką co 48 godzin.</li>
	<li>Po 24, 48 lub 72 godzinach leczenia umyj komórki 1 ml 1x PBS i dodaj 500 μl trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze do momentu odłączenia komórek od płytki.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek od płytki dodaj 500 μl uzupełnionej pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Dodać 5 μl trypsynizowanych komórek do 5 μl błękitu trypanowego w osobnej probówce i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Policz komórki z każdej studzienki w dwóch egzemplarzach za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Uśrednij liczbę komórek w studzience w każdym punkcie czasowym i wykreśl ją w funkcji czasu (Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Procedura ta opiera się na wykorzystaniu testów migracji i inwazji w celu uwzględnienia szybkości proliferacji komórek jako potencjalnego czynnika przyczyniającego się do zmierzonych różnic w ruchu komórek trofoblastu. Stosowane razem, te testy in vitro są prostymi i skutecznymi metodami, które można wykorzystać do identyfikacji szlaków komórkowych regulujących migrację trofoblastów. Jak opisano powyżej, komórki trofoblastu mogą być traktowane hormonami, cytokinami, czynnikami wzrostu lub innymi cząsteczkami w celu okreś...

Rozwój łożyska jest kluczowym krokiem w zajściu w ciążę, wpływając zarówno na zdrowie matki, jak i płodu. Jednak mechanistyczne podstawy, za pomocą których zachodzi ten proces, nie są w pełni zrozumiałe. Migracja komórek jest ważnym procesem biologicznym, który przyczynia się do powstania i funkcji łożyska podczas ciąży. Po implantacji blastocysty trofektoderma różnicuje się na trofoblasty kosmkowe, które pokrywają powierzchnię kosmków kosmówkowych i biorą udział w wymianie gazów i składników odżywczych, oraz trofoblasty kosmkowe (EVT), które migrują z kosmków i atakują matczyne decidua i naczynia krwionośne1. Migracja EVT jest niezbędna do przebudowy tętnic spiralnych matki i ustanowienia krążenia maciczno-łożyskowego w celu wsparcia wzrostu płodu2. Niewystarczająca inwazja trofoblastu w czasie ciąży powoduje nieprawidłowy rozwój łożyska i może przyczyniać się do powikłań ciąży, takich jak stan przedrzucawkowy, nadciśnienie ciążowe, wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu i przedwczesny poród3,4. Dlatego zrozumienie czynników wpływających na ruchliwość trofoblastu jest niezbędne do określenia ścieżek wymaganych do prawidłowego łożyskowania.
Migracja trofoblastów jest kontrolowana przez złożoną sieć cząsteczek sygnałowych, w tym czynniki wzrostu, cytokiny, hormony i czynniki angiogenne5. Ze względu na ograniczenia związane z badaniem łożyska in vivo, testy in vitro z wykorzystaniem unieśmiertelnionych linii komórkowych ludzkiego trofoblastu miały kluczowe znaczenie dla identyfikacji czynników, które przyczyniają się do ruchliwości trofoblastu. Testy zadrapań i inwazji były szeroko stosowane do ilościowej oceny roli poszczególnych cząsteczek w migracji komórek trofoblastu6,7,8. Jednak, chociaż są przydatne w połączeniu do zbadania, w jaki sposób zmiany w migracji mogą być spowodowane zmianami inwazyjności komórek, te dwa testy nie uwzględniają dodatkowych mechanizmów, które mogą przyczyniać się do zmiany szybkości migracji komórek. Na przykład zmniejszenie tempa proliferacji komórek może skutkować mniejszą liczbą komórek dostępnych do migracji.
Tutaj opisujemy ilościowe metody in vitro do oceny migracji trofoblastów za pomocą testów scratch, proliferacji komórek i inwazji komórek. W teście zadrapań jednolita rana jest tworzona w monowarstwie komórki, a migracja komórek w celu wypełnienia luki jest mierzona za pomocą zautomatyzowanego, poklatkowego obrazowania wielkości rany i gęstości komórek w ranie. Test proliferacji komórek opiera się na obliczeniu stosunku komórek w każdym punkcie czasowym w porównaniu ze znaną początkową ilością komórek. W teście inwazji komórkowej komórki są wysiewane na szczycie komory wstawiania do hodowli komórkowych pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową (np. Transwell) i zliczana jest liczba komórek, które atakują przez macierz zewnątrzkomórkową w odpowiedzi na chemoatraktant.
Test scratch jest prostym i skutecznym narzędziem, które może być użyte do określenia, jak różne warunki środowiskowe wpływają na migrację komórek. Testy proliferacji i inwazji mogą być następnie wykorzystane do określenia udziału proliferacji i inwazyjności komórek w ogólnych zmianach w migracji komórek. Łącznie testy te zapewniają solidne pomiary procesów biologicznych, które mogą przyczyniać się do ruchliwości komórek. W opisanych testach wykorzystano dwie unieśmiertelnione linie komórek trofoblastu pierwszego trymestru, Swan.71 (Sw.71) i HTR-8/SVneo9,10. Jednak testy te mogą być również zoptymalizowane do stosowania w innych typach komórek w celu identyfikacji kluczowych modulatorów migracji i inwazji komórek.

<table><tbody><tr><td>0,4% Trypanowa niebieska plama</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM aminokwasy endogenne</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe wkłady transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td>Zawierają filtry poliwęglanowe z 8 &mu; m Rozmiar porów</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alfa;-fluoro-16&alfa;-metylo-11&beta;, 17, 21-triol-3, 20-dion; &ge; 98% TLC)</td><td>Steraloidy</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Szynka' s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24-dołkowe płytki ImageLock</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>W przypadku korzystania z systemu obrazowania IncuCyte Zoom, umieść komórki nasienne na płytkach IncuCyte ImageLock. Płytki te mają znaczniki odniesienia na spodzie płytki, które są używane jako odniesienie do powtarzania obrazowania w stałym polu widzenia.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie IncuCyte</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>System IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>Obrazy testu scratch zostały przechwycone i przeanalizowane przy użyciu ustawionego " Rana po zadrapaniu" parametrów w systemie IncuCyte ZOOM. Można również użyć innych mikroskopów poklatkowych.</td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Zredukowany czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX71</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (10 000 jednostek/ml)/streptomycyna (10 000 &mikro; g / mL)</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr> Bez <tr><td>czerwieni fenolowej DMEM/Ham's F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Półautomatyczne narzędzie do robienia ran</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Ruch komórek jest kluczową właściwością trofoblastów podczas rozwoju łożyska i wczesnej ciąży. O znaczeniu prawidłowej migracji i inwazji trofoblastu świadczą zaburzenia ciąży, takie jak stan przedrzucawkowy i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, które są związane z niewystarczającą inwazją trofoblastu na naczynia krwionośne matki. Niestety, nasza wiedza na temat mechanizmów, dzięki którym łożysko rozwija się z migrujących trofoblastów, jest ograniczona. Analiza in vitro migracji komórek za pomocą testu scratch jest użytecznym narzędziem w identyfikacji czynników regulujących zdolność migracji trofoblastu. Jednak sam ten test nie definiuje zmian komórkowych, które mogą powodować zmienioną migrację komórek. Protokół ten opisuje trzy różne testy in vitro, które są stosowane łącznie do oceny ruchu komórek trofoblastu: test zadrapania, test inwazji i test proliferacji. Opisane tutaj protokoły mogą być również modyfikowane do stosowania w innych liniach komórkowych w celu ilościowego określenia ruchu komórek w odpowiedzi na bodźce. Metody te pozwalają badaczom zidentyfikować poszczególne czynniki, które przyczyniają się do ruchu komórek i zapewniają dokładne zbadanie potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw pozornych zmian w migracji komórek.

W badaniach tych wykorzystano unieśmiertelnione linie komórek trofoblastu człowieka z pierwszego trymestru Sw.71 oraz HTR-8/SVneo, aby określić rolę glikokortykosteroidów w migracji komórek trofoblastu12. W eksperymentach zastosowano glikokortykosteroidy, ponieważ wykazano niedawno, że zmieniają one funkcje trofoblastu, choć możliwe byłoby zastosowanie alternatywnych metod traktowania12. W wszystkich doświadczeniach obie linie komórkowe trak...

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Metody te można wykorzystać do określenia czynników wpływających na inwazję trofoblastu, co może dostarczyć informacji na temat głównych niekorzystnych wyników położniczych. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wizualną i ilościową analizę kilku czynników, które mogą wpływać na inwazję trofoblastów, w tym proliferację i migrację. Aby rozpocząć test zarysowania, umieść odpowiednią liczbę komórek na 24-dołkowej płytce, aby osiągnąć 100% konfluencję w ciągu 48 godzin.Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej uzupełnioną inaktywowanym termicznie dekstranem z węgla drzewnego pozbawionym FBS. W dniu zadrapania dodaj pożądaną obróbkę do podłoża w każdym dołku, aby wstępnie traktować komórki przez 30 minut. Aby stworzyć jednolite rany, umieść sterylne końcówki do pipet o pojemności 10 mikrolitrów na kołkach narzędzia do tworzenia ran.Opuść końcówki do pierwszego rzędu studzienek i przesuwaj płytkę wzdłuż toru urządzenia do nawijania, aż końcówki pipet dotrą do drugiej strony dołka. Następnie przesuń płytkę z powrotem do pozycji wyjściowej, aby zapewnić stałe nawinięcie w poprzek średnicy studni. Opuść końcówki do następnego rzędu studzienek i powtarzaj, aż wszystkie dołki zostaną porysowane.Upewnij się, że rysa obejmuje szerokość studzienki, obserwując płytkę pod mikroskopem. Następnie ostrożnie odessać pożywkę i delikatnie umyć komórki dwukrotnie 1x PBS. Po ostatnim umyciu dodaj uzupełnione pożywki pozbawione czerwieni fenolowej lub o niskiej zawartości FBS z pożądaną obróbką.Następnie umieść płytkę z porysowanymi dołkami w automatycznym obrazie poklatkowym umieszczonym w inkubatorze, który zawiera temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności 95% atmosfery. W razie potrzeby obrazuj komórki w regularnych odstępach czasu, aby umożliwić komórkom całkowite gojenie się ran. Aby rozpocząć test inwazji, należy wysiać odpowiednią liczbę komórek na sześciodołkowe płytki w inkubatorze, który utrzymuje temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności 95% atmosfery.Pozwól komórkom osiągnąć 90% konfluencji w ciągu 48 godzin. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej uzupełnioną inaktywowanym termicznie dekstranem z węgla drzewnego pozbawionym FBS. Umieść fiolkę z 10 miligramami na mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej w lodówce na lodzie i pozostaw do rozmrożenia przez noc.Następnego dnia użyj schłodzonych końcówek pipet, aby rozcieńczyć 10 miligramów na mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką wolną od czerwieni fenolowej surowicy do końcowego stężenia pięciu miligramów na mililitr. Następnie dodaj 100 mililitrów rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej do schłodzonych wkładek, które zostały umieszczone w schłodzonej 24-dołkowej płytce. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby matryca stwardniała.Aby przygotować komórki do testu inwazji, umyj komórki jednym mililitrem 1x PBS. Następnie odessać PBS i dodać 500 mikrolitrów 1x Trypsyna EDTA do każdej studzienki. Umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze, który utrzymuje temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w atmosferze o wilgotności 95%, aż wszystkie komórki oderwą się od dna płytki.Po odłączeniu komórek dodaj 500 mikrolitrów pożywki wolnej od czerwieni fenolowej do każdej studzienki trypsynizowanych komórek. Następnie przenieś 1000 mikrolitrów oderwanych komórek do probówki mikrowirówkowej i wiruj przez pięć minut w temperaturze 400 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej.Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosuj objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 miliona komórek na mililitr. Dodaj 600 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki i umieść w niej wstępnie pokrytą wkładkę. Następnie dodaj 200 mikrolitrów ogniw na wierzchu każdej wstępnie powlekanej wkładki ogniw, co daje łącznie 0,1 miliona komórek.Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze, który utrzymuje temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w atmosferze o wilgotności 95% przez 24 godziny. Po całonocnej inkubacji odessać pozostałe pożywki z górnej i dolnej komory, nie naruszając macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie ostrożnie usuń macierz zewnątrzkomórkową i niezaatakowane komórki z górnej części wkładek za pomocą bawełnianego wacika.Umyj każdą wkładkę trzy razy, dodając 1x PBS zarówno do górnej, jak i dolnej komory studzienki. Odsysaj PBS po każdym praniu. Aby zamocować ogniwa przymocowane do wkładek, umieść je w 100% lodowatym metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut.Umyj wkładki trzy razy za pomocą 1x PBS i usuń PBS po ostatnim praniu. Zabarwić ogniwa przymocowane do wkładek 0,2% fioletem krystalicznym w 20% etanolu przez 10 minut. Spłucz trzykrotnie wodą dejonizowaną i odessaj wodę dejonizowaną po ostatnim praniu.Wkładki suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez godzinę. Na koniec za pomocą kleszczyków i żyletki ostrożnie odetnij dolną membranę wkładu i zamontuj ją na szklanym szkiełku dolną stroną skierowaną do góry. Używając mikroskopu świetlnego z obiektywem 20X, uzyskaj co najmniej cztery unikalne obrazy zaatakowanych komórek na próbkę.Aby rozpocząć test proliferacji, użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć trypsynizowane komórki z kolby. Komórki nasienne na sześciodołkowe płytki o gęstości 0,2 miliona komórek na studzienkę w standardowych pożywkach wzrostowych. Następnie umieść komórki w inkubatorze, który utrzymuje temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w atmosferze o wilgotności 95% przez cztery godziny lub do momentu, gdy komórki się przykleją.Następnie zmień pożywkę na pożywkę wolną od czerwieni fenolowej uzupełnioną dekstranem z węgla inaktywowanego termicznie, pozbawionym FBS i pożądanym traktowaniem. Umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze, który utrzymuje temperaturę 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności 95% atmosfery. Następnie należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką uzupełnianą pożądaną obróbką co 48 godzin.Po 24, 48 lub 72 godzinach leczenia umyj komórki jednym mililitrem 1x PBS i dodaj 500 mikrolitrów trypsyny EDTA do każdej studzienki. Umieścić sześciodołkową płytkę w inkubatorze do momentu, aż komórki odłączą się od płytki. Gdy komórki odłączą się od płytki, dodaj 500 mikrolitrów uzupełnionej pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, aby dezaktywować trypsynę.Na koniec dodaj pięć mikrolitrów trypsynizowanych komórek do pięciu mikrolitrów błękitu trypanowego w osobnej probówce i wymieszaj pipetując. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki z każdej studzienki w dwóch egzemplarzach. Uwieczniony ludzki trofoblast w pierwszym trymestrze ciąży Łabędź.71 komórek traktowano przez zero, osiem i 18 godzin nośnikiem 1x PBS lub 100 mikromolów syntetycznego glukokortykosteroidu deksametazonu w teście zadrapania. Pomiar wielkości rany i gęstości rany w Swan. 71 i komórki HTR-8 / SVneo poddane działaniu nośnika lub 100 nanomolowych deksów wykazały, że leczenie dex zmniejszyło szybkość zamykania ran, co wskazuje, że glikokortykosteroidy mogą hamować migrację komórek.Po teście inwazji leczenie glikokortykosteroidami zmniejszyło inwazyjność komórek, o czym świadczy 15% zmniejszenie liczby zaatakowanych komórek Swan. 71 i komórek HTR-8 / SVneo traktowanych 100 nanomolowym deksem przez 24 godziny w porównaniu z komórkami traktowanymi nośnikiem. Po teście proliferacji komórek leczenie glikokortykosteroidami zmniejszyło proliferację komórek, na co wskazuje mniejsza liczba Swanów.71 i komórek HTR-8/SVneo poddanych działaniu 100 nanomolowych deksów w porównaniu z komórkami potraktowanymi nośnikiem. Metody oceny śmierci komórki mogą być stosowane w połączeniu z tą procedurą w celu określenia, czy apoptoza lub nekroza przyczyniają się do zmiany funkcji trofoblastu. W unikalny sposób przyjęliśmy zastosowanie standardowych technik rutynowo stosowanych w biologii nowotworów do badania funkcji trofoblastu.Nie ma żadnych zagrożeń związanych z tymi metodami. Jedynym środkiem ostrożności, jaki powinni podjąć widzowie, jest użycie sterylnej techniki hodowli tkankowej.

in-vitro-assays-to-evaluate-migration-invasion-proliferation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.

Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Prezentowany tutaj jest protokół pobierania próbek ludzkiej tkanki kosmków łożyskowych, a następnie izolacji cytotrofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Leczenie trofoblastów TNFα podsumowuje stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości i ułatwia odkrycie celów molekularnych regulowanych przez stan zapalny w łożyskach z otyłością matczyną.

Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj trzy testy in vitro do oceny migracji, inwazji i proliferacji ludzkich komórek trofoblastu z pierwszego trymestru ciąży. Metody te umożliwiają wizualną i ilościową analizę czynników wpływających na inwazję trofoblastu.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży (Wideo) | JoVE Journal

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Przeglądaj więcej filmów