Name: Model iniekcji policzkowej do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Poznaj model iniekcji policzkowej u myszy do jednoczesnego pomiaru bólu i swędzenia. Ta metoda pozwala odróżnić drapanie od wycierania i analizować zachowania związane z oboma doznaniami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorom Stevenowi G. Shimadzie i Robertowi H. LaMotte (Yale University School of Medicine, Connecticut), z których metod (odnośnik 4) ta technika została zaadaptowana. Dziękujemy również Panu Kentaro Miyaharze za stworzenie ilustracji myszy. Badanie to zostało wsparte przez Grant-in-Aid for Scientific Research z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii w Japonii (nr 15H02501 i 15H05928 dla M.T. oraz nr 16K21691 dla H.K.) oraz Uehara Memorial Foundation (dla H.K.). Doceniamy wprowadzenie metody iniekcji policzkowej przez prof. LaMotte na Uniwersytecie Yale.

Wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i ich wykorzystaniem zostały zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Narodowego Instytutu Nauk Przyrodniczych (16A074) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Nauk Fizjologicznych.
UWAGA: Oryginalny protokół został opisany przez Stevena G. Shimadę i Roberta H. LaMotte'a4, a niniejszy raport przedstawia te metody z kilkoma modyfikacjami, w tym dodaniem osłony zapobiegającej wzajemnemu widzeniu się zwierząt, rezygnacją z lustra, zmianą liczby myszy na jedno nagranie, szczepu myszy, rozmiaru klatki oraz czasu nagrywania.
1. Model iniekcji w policzek
<ol>
	<li>Przygotowanie eksperymentu
	<ol>
		<li>Klatka
		<ol>
			<li>Ustaw cztery klatki pod kamerą, zgodnie z Rysunkiem 1. Ustaw ekran, aby myszy nie widziały się nawzajem. Umieść każdą mysz w osobnej klatce i załóż akrylową pokrywę, aby zapobiec ucieczce zwierząt. Należy pamiętać, że nagrania powinny być przeprowadzane w środowisku z kontrolowaną temperaturą, wilgotnością i poziomem hałasu. 
			UWAGA: Zachowania można rejestrować również bez pokrywy, jeśli klatka jest wystarczająco wysoka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Igła i strzykawka
		<ol>
			<li>Do wstrzykiwania substancji testowych należy użyć igły 29 G lub 30 G przymocowanej do strzykawki 0.5 mL. Jeśli roztwór substancji testowej jest bardzo lepki, wymagane są większe igły. Należy jednak pamiętać, że duże igły mogą powodować dodatkowe efekty uboczne o charakterze fizycznym. 
			UWAGA: Można zastosować igłę połączoną ze strzykawką za pomocą rurki polietylenowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kamera wideo
		<ol>
			<li>Do pomiaru epizodów drapania i zachowań przecierania należy użyć kamery wideo o wystarczająco wysokiej częstotliwości klatek (30-60 frames/s) i względnie wysokiej rozdzielczości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oprogramowanie do analizy wideo
		<ol>
			<li>Do odtwarzania i analizy nagrań należy użyć oprogramowania do edycji wideo. Do precyzyjnej analizy niezbędne są tryb przyspieszonego odtwarzania oraz tryb odtwarzania klatka po klatce.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ eksperymentu behawioralnego z kamerą wideo, akrylową klatką dla myszy i ekranem (tekturowym)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ kamery wideo i klatek. Użyto czterech akrylowych klatek z akrylowymi pokrywami, aby zapobiec ucieczce myszy, oraz ekranu zapobiegającego zaraźliwemu świądowi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Iniekcja i rejestracja
	<ol>
		<li>Na dzień przed eksperymentem należy ogolić sierść na policzku myszy za pomocą maszynki do strzyżenia (Film 1). Przed goleniem nie należy unieruchamiać myszy. 
		UWAGA: W tym modelu najczęściej stosowano myszy CD-1 lub C57BL/64,5. W niniejszym artykule użyto samców myszy C57BL/6N w wieku 6-12 tygodni. Należy pamiętać, że wrażliwość na substancje chemiczne może się różnić w zależności od szczepu myszy3,6,7.</li>
		<li>Dzień po goleniu należy przenieść mysz do klatki rejestracyjnej na 1 h, aby zaadaptowała się do warunków rejestracji. W przypadku stosowania aplikacji miejscowej, należy ją wykonać w tym okresie aklimatyzacji. 
		UWAGA: W niniejszym raporcie 30 min przed rejestracją miejscowo aplikowano 10 μL 2% (w/v) soli chlorowodorku difenhydraminy w soli fizjologicznej.</li>
		<li>Należy ustawić kamerę wideo nad klatką i rozpocząć nagrywanie przed iniekcją substancji testowej. Wstrzyknąć 10 μL roztworu substancji testowej śródskórnie w ogolony policzek w stanie czuwania (Film 2). Po iniekcji należy umieścić mysz z powrotem w klatce rejestracyjnej. 
		UWAGA: W niniejszym raporcie jako substancje testowe zastosowano 50 μg/10 μL histaminy, 40 μg/10 μL kapsaicyny lub nośnik (7% tween 80 w soli fizjologicznej).</li>
		<li>Zamknąć pokrywę klatki i kontynuować nagrywanie wideo przez 30 min. 
		UWAGA: Całkowity czas rejestracji zależy od warunków eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza behawioralna
	<ol>
		<li>Należy policzyć odpowiednio serie drapania oraz zachowania przecierające. Myszy unoszą tylną łapę w stronę policzka i drapią kilka razy w ciągu jednej lub kilku sekund, a następnie opuszczają łapę. Taka seria czynności jest liczona jako jedna seria drapania. Drapanie innych obszarów nie powinno być wliczane. Myszy używają jednej przedniej łapy do przecierania, a obu przednich łap do pielęgnacji (groomingu). Czynności te należy rozróżnić. Tylko zachowania przecierające są liczone jako zachowania związane z bólem. 
		UWAGA: Każda z tych czynności jest pokazana na Rysunku 2, w Filmie 3, Filmie 4 oraz Filmie 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Ilustracja zachowań gryzoni przedstawiająca przecieranie, drapanie i pielęgnację. Badanie analizy zachowań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Typowa aktywność myszy podczas rejestracji. Panele A-C to ilustracje przedstawiające zachowanie polegające na przecieraniu prawą przednią łapą (A), drapaniu prawą tylną łapą (B) oraz pielęgnacji obiema przednimi łapami (C). Myszy unoszą tylną łapę w kierunku policzka i dapią kilka razy w ciągu jednej lub kilku sekund, a następnie opuszczają łapę. Taka seria czynności jest liczona jako jeden epizod drapania. Drapanie innych obszarów nie powinno być wliczane. Myszy używają jednej przedniej łapy do przecierania i obu przednich łap do pielęgnacji. Należy rozróżniać te czynności. Tylko zachowania polegające na przecieraniu są liczone jako zachowania związane z bólem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Model iniekcji szyjnej
<ol>
	<li>Iniekcja i rejestracja
	<ol>
		<li>Na dzień przed eksperymentem, po około 2-3 min inhalation 5% izofluranu, należy ogolić futro na karku myszy za pomocą maszynki do strzyżenia.</li>
		<li>Dzień po goleniu przenieś mysz do klatki rejestracyjnej na 1 h, aby zaaklimatyzowała się do warunków pomiarowych.</li>
		<li>Ustaw kamerę wideo nad klatką (Rysunek 1) i rozpocznij nagrywanie przed iniekcją substancji testowej. Wstrzyknij 10 μL roztworu substancji testowej śródskórnie w ogolony kark u zwierzęcia w stanie czuwania. Po iniekcji zwróć mysz do klatki rejestracyjnej. 
		UWAGA: W niniejszym artykule jako substancje testowe zastosowano 50 μg/10 μL histaminy, 10 μg/10 μL lub 40 μg/10 μL kapsaicyny lub nośnik (7% tween 80 w soli fizjologicznej).</li>
		<li>Zamknij pokrywę klatki i kontynuuj nagrywanie wideo przez 30 min. 
		UWAGA: Całkowity czas rejestracji zależy od warunków eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza behawioralna
	<ol>
		<li>Policz serie zachowań drapania (scratch bouts). Myszy unoszą tylną łapę w stronę karku i drapią kilkakrotnie w ciągu jednej lub kilku sekund, a następnie opuszczają łapę. Taka seria czynności jest liczona jako jeden epizod drapania. Drapania innych obszarów nie należy wliczać. 
		​UWAGA: Czynność drapania jest podobna do tej w modelu iniekcji w policzek, z wyjątkiem tego, że miejsce drapania jest przesunięte na kark.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ikoma, A., Steinhoff, M., Stander, S., Yosipovitch, G., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of itch.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (7), 535-547 (2006).</li>
<li>Kuraishi, Y., Nagasawa, T., Hayashi, K., Satoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+behavior+induced+by+pruritogenic+but+not+algesiogenic+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Scratching behavior induced by pruritogenic but not algesiogenic agents in mice.</a> European Journal of Pharmacology. 275 (3), 229-233 (1995).</li>
<li>Kuraishi, Y., Yamaguchi, T., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch-scratch+responses+induced+by+opioids+through+central+mu+opioid+receptors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Itch-scratch responses induced by opioids through central mu opioid receptors in mice.</a> Journal of Biomedical Science. 7 (3), 248-252 (2000).</li>
<li>Shimada, S. G., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+differentiation+between+itch+and+pain+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Behavioral differentiation between itch and pain in mouse.</a> Pain. 139 (3), 681-687 (2008).</li>
<li>Kittaka, H., Uchida, K., Fukuta, N., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid-induced+itch+is+mediated+by+signalling+of+LPA5+receptor%2C+phospholipase+D+and+TRPA1%2FTRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid-induced itch is mediated by signalling of LPA5 receptor, phospholipase D and TRPA1/TRPV1.</a> The Journal of Physiology. 595 (8), 2681-2698 (2017).</li>
<li>Maekawa, T., Nojima, H., Kuraishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch-associated+responses+of+afferent+nerve+innervating+the+murine+skin%3A+different+effects+of+histamine+and+serotonin+in+ICR+and+ddY+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Itch-associated responses of afferent nerve innervating the murine skin: different effects of histamine and serotonin in ICR and ddY mice.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 84 (4), 462-466 (2000).</li>
<li>Inagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+behavior+in+various+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Applied+Skin+Physiology%22%5BJournal%5D)">Scratching behavior in various strains of mice.</a> Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 14 (2), 87-96 (2001).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+surfactant-induced+pruritus%3A+involvement+of+histamine+released+from+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Topical surfactant-induced pruritus: involvement of histamine released from epidermal keratinocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 344 (2), 459-466 (2012).</li>
<li>Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+assessment+of+facial+pain+in+rats%3A+face+grooming+patterns+after+painful+and+non-painful+sensory+disturbances+in+the+territory+of+the+rat%27s+infraorbital+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Behavioral assessment of facial pain in rats: face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rat's infraorbital nerve.</a> Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).</li>
<li>Yeo, J. F., Ong, W. Y., Ling, S. F., Farooqui, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injection+of+phospholipases+A2+inhibitors+modulates+allodynia+after+facial+carrageenan+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injection of phospholipases A2 inhibitors modulates allodynia after facial carrageenan injection in mice.</a> Pain. 112 (1-2), 148-155 (2004).</li>
<li>Yeo, J. F., Ling, S. F., Tang, N., Ong, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effect+of+CNS+peroxynitrite+scavenger+in+a+mouse+model+of+orofacial+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effect of CNS peroxynitrite scavenger in a mouse model of orofacial pain.</a> Experimental Brain Research. 184 (3), 435-438 (2008).</li>
<li>Hashimoto, T., Ohata, H., Momose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch-scratch+responses+induced+by+lysophosphatidic+acid+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Itch-scratch responses induced by lysophosphatidic acid in mice.</a> Pharmacology. 72 (1), 51-56 (2004).</li>
<li>Kremer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+is+a+potential+mediator+of+cholestatic+pruritus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid is a potential mediator of cholestatic pruritus.</a> Gastroenterology. 139 (3), 1008-1018 (2010).</li>
<li>Alemi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGR5+receptor+mediates+bile+acid-induced+itch+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TGR5 receptor mediates bile acid-induced itch and analgesia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (4), 1513-1530 (2013).</li>
<li>Nieto-Posadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+directly+activates+TRPV1+through+a+C-terminal+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid directly activates TRPV1 through a C-terminal binding site.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 78-85 (2011).</li>
<li>Akiyama, T., Carstens, M. I., Carstens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+itch-+and+pain-related+behavioral+responses+and+%C2%B5-opoid+modulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">Differential itch- and pain-related behavioral responses and µ-opoid modulation in mice.</a> Acta Dermato-Venereologica. 90 (6), 575-581 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiono model iniekcji do policzka, który okazał się przydatny do analizy zachowań związanych z bólem i swędzeniem.
Poprzedni raport wykazał, że substancje algezyjne wywołują drapanie w modeluwstrzykiwania szyi myszy 4. W przeciwieństwie do tego, kapsaicyna zmniejszała zachowania związane z drapaniem w innych eksperymentach z wstrzykiwaniem szyi (ryc. 3). Dlatego wpływ bólu na zachowanie podczas drapania pozostaje niejasny. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody jednoczesnego badania bólu i swędzenia za pomocą testów behawioralnych. Korzystając z modelu iniekcji do policzków, można ocenić wpływ substancji zarówno na ból, jak i swędzenie.
Wcześniej donoszono, że wewnątrzkomórkowy LPA bezpośrednio aktywuje TRPV1 i TRPA1 jako mechanizm swędzeniawywołanego przez LPA 5. W związku z tym swędzenie wywołane przez LPA może być niezależne od histaminy. Poprzednie badanie wykazało również, że model iniekcji policzka może być wykorzystany do oceny świądu niezależnego od histaminy16. Dlatego model ten może być stosowany zarówno w przypadku świądu zależnego, jak i niezależnego od histaminy.
Jednym z kluczowych etapów tego eksperymentu jest wstrzyknięcie. Ponieważ jest to ostry test behawioralny, znieczulenie nie może być stosowane na etapie wstrzyknięcia, ponieważ może to wpłynąć na te zachowania. Dlatego mysz musi być bezpiecznie trzymana, aby wykonać precyzyjne wstrzyknięcie. Gdy chwyt zwierzęcia nie jest pewny, zwłaszcza podczas wstrzykiwania silnych algogenów, myszy mogą mieć problemy, co prowadzi do niedokładnej objętości i głębokości wstrzyknięcia, a następnie trudności w interpretacji wyników. Podczas obsługi myszy pociągnij skórę na karku między kciukiem a palcem wskazującym, aby zahamować ruch myszy.
Kolejnym krytycznym krokiem jest analiza behawioralna. Ponieważ drapanie jest bardzo szybkie, film należy uważnie obejrzeć. Co więcej, wycieranie może być trudne do odróżnienia od pielęgnacji. Dlatego podczas pierwszego eksperymentu zaleca się stosowanie substancji chemicznych do kontroli pozytywnej, takich jak kapsaicyna. Warunki nagrywania i odtwarzania mogą również wpływać na zliczanie obu zachowań. Jeśli trudno jest wyraźnie zaobserwować zachowania, wokół klatek można użyć luster, aby poprawić kąty widzenia4.
Należy zauważyć, że model iniekcji policzka może wykazywać mniejszą dokładność ilościową dla badanych substancji chemicznych niż w modelu iniekcji na szyję. Jak pokazano na rycinie 3 i rycinie 4, ta sama ilość histaminy wywołała więcej zachowań związanych z drapaniem w modelu szyi niż w modelu policzkowym i wykazała mniejszą zmienność w modelu wstrzykiwania szyi. Po wykazaniu, że badana substancja jest świądem o niskim działaniu algicznym w modelu iniekcji policzka, model iniekcji szyi jest zalecany do dodatkowej analizy ilościowej. Nawet przy tych ograniczeniach, model iniekcji do policzka jest przydatny do precyzyjnej oceny badanych substancji, zwłaszcza w dziedzinie badań nad swędzeniem.

Swędzenie było pierwotnie charakteryzowane jako uczucie, które wywołuje zachowania związane z drapaniem w celu usunięcia szkodliwych materiałów z powierzchni skóry. Jednak swędzenie było przedmiotem terapii nieprzyjemnych doznań spowodowanych wieloma chorobami, takimi jak atopowe zapalenie skóry, zmiany neurogenne i cholestaza1. W takich przypadkach swędzenie jest poważnym nieprzyjemnym uczuciem podobnym do bólu. Dlatego swędzenie stanowi ważny cel badań. Drapienie się jest głównym wskaźnikiem swędzenia w eksperymentach na zwierzętach, a drapanie można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie prefinogenów w skórę na szyi2,3. Jednak poprzednie badanie wykazało, że kapsaicyna, algogen, wywołuje również zachowania związane z drapaniem w modelu iniekcji na szyję4, co utrudnia odróżnienie swędzenia od bólu w tym modelu. Stwierdzono natomiast, że kapsaicyna zmniejsza zachowania związane z drapaniem w modelu iniekcji na szyję, co wskazuje, że wpływ bólu na zachowania związane z drapaniem jest skomplikowany i zależy od warunków eksperymentalnych. Dlatego jednoczesne pomiary zachowań związanych z bólem i swędzeniem umożliwiłyby precyzyjną analizę świądów i algogenów. Stevenowi G. Shimadzie i Robertowi H. LaMotte'owi udało się przeprowadzić jednoczesne pomiary bólu i zachowań związanych ze swędzeniem, zmieniając miejsce wstrzyknięcia z szyi na policzek4. W modelu wstrzykiwania w policzek kapsaicyna indukowała wycieranie, ale nie drapanie, podczas gdy histamina, świąd, indukowała tylko drapanie. Dlatego model ten umożliwia niezależną ocenę swędzenia i bólu, dzięki czemu iniekcja do policzka jest użytecznym modelem do badań nad swędzeniem. Podczas próby ustalenia, czy substancja badana jest świądem i/lub algogenem, model ten dostarcza więcej informacji niż model iniekcji na szyję. W artykule opisano praktyczną metodę wykonywania iniekcji w policzki i liczenia napadów drapania lub wycierania, a także wykazano przydatność tej metody do oceny zachowań związanych z drapaniem wywołanych kwasem lizofosfatydowym (LPA).

<table><tbody><tr><td>Kapsaicyna</td><td>Sigma</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek difenhydraminy</td><td>Wako</td><td>044-19772</td><td></td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>iMovie</td><td>Kwas</td> lizofosfatydowy jabłkowy <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>325465-93-8</td><td></td></tr><tr><td>Myjector</td><td>Terumo</td><td>ss-05M2913</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>Panasonic</td><td>VX985M</td><td></td></tr></tbody></table>

model iniekcji policzkowej do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Swędzenie zostało zdefiniowane przez Rothmana w 1941 roku jako "nieprzyjemne uczucie skórne, które wywołuje chęć drapania". W modelach mysich napady zadrapań są zwykle liczone w celu oceny swędzenia wywołanego przez świodory. Jednak wcześniejsze doniesienia wykazały, że substancje algezowe wywołują również zachowania związane z drapaniem w modelu wstrzykiwania szyi myszy, który jest najczęstszym testem stosowanym do zachowań związanych z drapaniem. To odkrycie utrudnia badanie swędzenia u myszy. W przeciwieństwie do tego, kapsaicyna, powszechny algogen, zmniejszyła zachowania związane z drapaniem w niektórych eksperymentach z wstrzykiwaniem szyi. Dlatego wpływ bólu na zachowania związane z drapaniem pozostaje niejasny. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody jednoczesnego badania swędzenia i odczuwania bólu za pomocą testów behawioralnych. Tutaj wprowadzany jest model iniekcji policzka, który może być używany do jednoczesnego pomiaru zachowań związanych z bólem i swędzeniem. W tym modelu świodogeny wywołują zachowania związane z drapaniem, podczas gdy substancje algetyczne wywołują zachowania związane z wycieraniem. Korzystając z tego modelu, wykazano, że kwas lizofosfatydowy (LPA), mediator swędzenia występujący u pacjentów z cholestatycznym świądem, wywołuje wyłącznie swędzenie, ale nie ból. Jednak w modelach mysich doniesiono, że LPA jest zarówno świądem, jak i algogenem. Badanie wpływu LPA w modelu wstrzykiwania policzka myszy wykazało, że LPA wywoływało tylko drapanie, ale nie wycieranie. Wskazuje to, że LPA działa jako świąd podobnie u myszy i ludzi, i pokazuje przydatność modelu iniekcji do policzka w badaniach nad swędzeniem.

W modelu wstrzykiwania w kark histamina wywołała silne zachowania drapania (Rycina 3). Nośnik (7% tween 80 w soli fizjologicznej) również wywołał zachowania drapania. Wcześniejszy raport wykazał, że detergent indukuje świąd poprzez produkcję histaminy przez keratynocyty8. Tween 80 mógł indukować świąd za pomocą podobnych mechanizmów, podczas gdy kapsaicyna zmniejszyła zachowania drapania wywołane nośnikiem, co jest sprzeczne z wcześniejszym raportem4. Jest możliwe, że różnice między szczepami myszy mogły wpłynąć na te odmienne wyniki. Wyniki te wskazują, że wpływ bólu na zachowania drapania jest złożony. Dlatego jednoczesny pomiar zachowań związanych z bólem i świądem może umożliwić precyzyjną analizę pruritogenów i algogenów. W modelu wstrzykiwania w policzek kapsaicyna nie wywołała zachowań drapania, a jedynie zachowania wycierania, które uważa się za związane z bólem9,10,11 (Rycina 4). Wstrzyknięcie kapsaicyny zwiększyło również zachowania pielęgnacyjne (dane nie przedstawiono). Po wstrzyknięciu w policzek histamina wywołała głównie zachowania drapania przy słabych zachowaniach wycierania. Zastosowanie odczynnika przeciwhistaminowego, difenhydraminy, zahamowało drapanie. Wynik ten sugeruje, że zachowania drapania wywołane histaminą są spowodowane działaniem histaminy na receptory histaminowe. Tutaj, jako przykład, pokazano efekty LPA w modelu wstrzykiwania w policzek (Rycina 5). LPA jest mediatorem świądu występującym u pacjentów z cholestazą ze świądem. Jednak w modelach mysich LPA raportowano zarówno jako pruritogen, jak i algogen12,13,14,15. W związku z tym zbadano efekty LPA w modelu wstrzykiwania w policzek, a wyniki wykazały, że LPA wywołało drapanie, ale nie zachowania wycierania. Wskazuje to, że LPA jest pruritogenem, a nie algogenem u myszy, podobnie jak w przypadku jego działania u ludzi.
<img alt="Analiza drapania; efekty histaminy i kapsaicyny; wykres liniowy i słupkowy; badanie reakcji świądowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Efekty histaminy i kapsaicyny w modelu iniekcji w szyję. (A) Zachowania drapania wywołane iniekcją w szyję nośnika (7% tween 80 w soli fizjologicznej, otwarte kwadraty), histaminy (50 μg/10 μL na miejsce, wypełnione koła) lub kapsaicyny (10 μg/10 μL na miejsce, otwarte trójkąty; 40 μg/10 μL na miejsce, wypełnione trójkąty) oceniano co 5 min przez łącznie 30 min. (B) Analiza ilościowa zachowań drapania w ciągu 30 min przedstawionych na panelu A. ∗∗P &lt; 0,01 metodą ANOVA z korektą Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 6-8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Reakcje wycierania i drapania na histaminę i kapsaicynę; wykresy liniowe i słupkowe; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Efekty pruritogenu i algogenu w modelu wstrzykiwania w policzek. Zachowania wycierania (A) i drapania (B) indukowane wstrzyknięciem nośnika (7% tween 80 w soli fizjologicznej, otwarte kwadraty), histaminy (50 μg/10 μL na miejsce, wypełnione koła) lub kapsaicyny (40 μg/10 μL na miejsce, wypełnione trójkąty) do prawego policzka myszy oceniano co 5 min przez łącznie 30 min. Grupa przedstawiona jako otwarte koła była leczona perkutannie 10 μL 2% (w/v) chlorowodorku difenhydraminy (DHHCL) na 30 min przed wstrzyknięciem histaminy (50 μg/10 μL na miejsce). DHHCl rozpuszczono w soli fizjologicznej. Analiza ilościowa zachowań wycierania (C) i drapania (D) w ciągu 30 min w panelach A i B; n = 8 zwierząt na grupę. ∗P &lt; 0.05, ∗∗P &lt; 0.01 za pomocą ANOVA z następczą korekcją Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wycierania i drapania; wykresy porównujące efekty podania nośnika i LPA w czasie; dane z badania behawioralnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5LPA indukuje zachowania drapania, ale nie wycierania w modelu z iniekcją w policzek. Drapanie (A) i wycierania (Bzachowania wywołane wstrzyknięciem nośnika (sól fizjologiczna, otwarte kwadraty) lub LPA (100 nmol/10 μL na miejsce, wypełnione kółka) w prawy policzek myszy oceniano co 5 min przez łącznie 30 min. Ilościowa analiza drapania (C) i przecieranie (Dzachowania w ciągu 30-minutowego okresu na panelach A i B; n = 17 dla grupy kontrolnej (vehicle) i n = 20 dla LPA. ∗P &lt; 0.05, ∗∗P &lt; 0,01 według testu Welcha t test. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kittaka i wsp.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Golenie myszy w celu przygotowania do eksperymentu; dłoń w rękawiczce trzyma maszynkę elektryczną podczas procedury laboratoryjnej." src="/files/ftp_upload/58943/58943movie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 1"> 
Film 1: Film demonstrujący sposób golenia policzka myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<img alt="Obsługa myszy laboratoryjnej podczas procesu badawczego; odpowiednia do konfiguracji eksperymentu behawioralnego." src="/files/ftp_upload/58943/58943movie2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 2"> 
Film 2: Film demonstrujący iniekcję w policzek myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Badanie neurobehawioralne myszy; analiza zachowania przecierania, obserwacja eksperymentalna w warunkach laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/58943/58943movie3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 3"> 
Film 3: Film demonstrujący typowe zachowanie przecierania. Film ten jest wyświetlany z prędkością 25%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_3.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Analiza zachowania gryzoni, schemat z widokiem z góry, przedstawiający drapanie w kontrolowanych warunkach doświadczalnych." src="/files/ftp_upload/58943/58943movie4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 4"> 
Film 4: Film przedstawiający typowe zachowanie drapania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<img alt="Zachowanie pielęgnacyjne myszy w warunkach badawczych, badanie behawioralne, model zwierzęcy, eksperyment neurobiologiczny." src="/files/ftp_upload/58943/58943movie5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 5"> 
Film 5: Film przedstawiający typowe zachowanie pielęgnacyjne. Film jest wyświetlany z prędkością 25%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_5.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Zazwyczaj, model wstrzykiwania szyi myszy jest używany do oceny zachowań związanych z zadrapaniami wywołanymi przez świąd. Jednak model dostarcza informacji tylko o swędzeniu, a nie bólu. Tutaj u myszy wprowadza się model wstrzykiwania policzka, który może być używany do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem.

Model iniekcji policzkowej do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Nasze dane wskazują, że algogeny zmniejszają zachowania związane z drapaniem, ale wpływ kapsaicyny na zachowania związane z drapaniem pozostaje niejasny. Dlatego ważne jest jednoczesne mierzenie każdej ilości bólu. Tradycyjna metoda dostarcza informacji tylko o odczuciach swędzenia lub bólu, ale model iniekcji policzka dostarcza informacji o swędzeniu i bólu, osobno i jednocześnie.Wstrzyknięcie w policzek może być na początku trudne, ponieważ potrzeba praktyki, aby rozróżnić zachowania związane z drapaniem, wycieraniem i pielęgnacją. Demonstracja wideo iniekcji i analiza behawioralna mogą być pomocne w opanowaniu technik. W przypadku eksperymentu z wstrzykiwaniem w policzek, dzień przed oceną, ogol sierść na policzku każdej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i zamontuj kamerę wideo z częstotliwością odświeżania od 30 do 60 klatek na sekundę na statywie, w środowisku o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i dźwięku.Umieść cztery klatki pod kamerą we wskazanej orientacji i umieść ekrany między każdą klatką, aby myszy nie widziały się nawzajem. Jednego dnia po goleniu umieść jedną mysz w każdej klatce nagrywającej na godzinę, aby zaaklimatyzować zwierzęta do warunków nagrywania. Jeśli ma być stosowane leczenie miejscowe, należy je zastosować w tym czasie.Podczas gdy zwierzęta się aklimatyzują, załadować badaną substancję będącą przedmiotem zainteresowania do jednej strzykawki o pojemności 0,5 mililitra, wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 lub 30 na mysz. Pod koniec okresu aklimatyzacji należy rozpocząć nagrywanie wideo przed wstrzyknięciem. Następnie wstrzyknąć śródskórnie 10 mikrolitrowy roztwór substancji badanej w ogolony policzek obudzonego zwierzęcia.Następnie należy umieścić wstrzyknięte myszy w odpowiednich klatkach i kontynuować nagrywanie wideo przez 30 minut. Pod koniec eksperymentu załaduj wideo do odpowiedniego oprogramowania do edycji wideo. Policz za każdym razem, gdy mysz podnosi tylną nogę w kierunku policzka i drapie się kilka razy w ciągu jednej lub kilku sekund, zanim położy nogę w jednym zadrapaniu.Myszy używają jednej przedniej nogi do wycierania i obu przednich nóg do pielęgnacji, ale tylko zachowania związane z wycieraniem są liczone jako zachowania związane z bólem. W eksperymencie z wstrzykiwaniem w szyję, dzień przed eksperymentem, ogol futro na karku każdej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Jednego dnia po goleniu zaaklimatyzować myszy w klatkach rejestrujących przez godzinę przed wstrzyknięciem śródskórnie 10 mikrolitrów badanej substancji będącej przedmiotem zainteresowania w ogoloną szyję, w warunkach czuwania.Zwierzętom, którym wstrzyknięto wstrzyknięcie, należy umieścić w klatkach i rejestrować zachowania myszy przez 30 minut. Następnie policz ataki drapania na szyi i wszelkie zachowania związane z wycieraniem twarzy, jak właśnie pokazano. W modelu z wtryskiem szyjki histamina wywołuje silne drapanie, podczas gdy pojazd wywołuje łagodne drapanie.W modelu iniekcji policzkowej kapsaicyna nie wywołuje zachowań związanych z drapaniem, ale wywołuje zachowania związane z wycieraniem, które uważa się za związane z bólem. Po wstrzyknięciu w policzek histamina wywołuje głównie drapanie ze słabymi właściwościami wycierania. Zastosowanie odczynnika przeciwhistaminowego hamuje drapanie, co sugeruje, że drapanie wywołane histaminą jest spowodowane reakcją histaminy na receptory histaminowe.W tym eksperymencie zastosowanie mediatora swędzenia wywołało drapanie, ale nie wycieranie, co wskazuje, że badany mediator działa jako świąd, ale nie algogen u myszy, podobnie jak jego działanie u ludzi. Ta metoda pozwala łatwo i wyraźnie rozróżnić odczucia swędzenia i bólu za pomocą jednego zabiegu. Szczegółową analizę zachowania można przeprowadzić, skupiając się na odczuciu swędzenia lub bólu.Zachowania związane ze swędzeniem i bólem wywołują różne reakcje. Również te techniki nie są trudne. Procedura iniekcji i obserwacji policzka może pozwolić różnym naszym rówieśnikom na opanowanie treningu.Doceniamy wprowadzenie modelu iniekcji do policzków przez profesora LaMotte na Uniwersytecie Yale.

cheek-injection-model-for-simultaneous-measurement-pain-itch-related

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono algorytmy oceniające progi bólu cieplnego i mechanicznego w eksperymentalnie wywołanym stanie zapalnym skóry u badanych ludzi. Dwa paradygmaty testowania bólu niezależnie badają przetwarzanie nocyceptywne przez dwie główne populacje obwodowych włókien nerwowych przekazujących ból, tj. nieumielinowane włókna C oraz małe umielinowane włókna A-delta.

Wyznaczanie progu bólu termicznego i mechanicznego w zapaleniu skóry u ludzi

Wydłużenie czasu posiłku reprezentuje ustno-twarzowe zachowanie nocyceptywne u gryzoni, podobne do zachowania ochronnego u ludzi z bólem ustno-twarzowym. Jedzenie jest zachowaniem, które nie wymaga treningu ani manipulacji zwierzętami, wymaga udziału kory mózgowej i nie konkuruje z innymi zachowaniami wywołanymi eksperymentalnie, co odróżnia ten test od alternatywnych pomiarów odruchowych lub instrumentalnych.

Czas trwania posiłku jako miara ustno-twarzowych odpowiedzi nocyceptywnych u gryzoni

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), czyli choroba zwyrodnieniowa stawów, jest wyniszczającym stanem związanym z bólem, który pozostaje tylko częściowo kontrolowany przez dostępne leki przeciwbólowe. Opracowywane są modele zwierzęce, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów bólu związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym miejscu opisujemy metodologię monojodooctanowego modelu bólu zwyrodnieniowego stawów u myszy.

Model monojodooctanu bólu związanego z chorobą zwyrodnieniową stawów u myszy

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Opracowaliśmy wywołaną miarę bólu stawów i połączyliśmy ją ze standardową metodą pomiaru spontanicznego bólu w różnych mysich modelach chemicznie wywołanego zapalenia stawów. Miary te są czułe i powtarzalne dla różnych rodzajów bólu stawów.

Spontaniczne i wywołane pomiary bólu w mysich modelach jednostawowego bólu kolana

Dostarczony jest tutaj protokół, który szczegółowo opisuje kroki prowadzące do stworzenia zwierzęcego modelu przewlekłego bólu po niedokrwieniu (CPIP). Jest to dobrze rozpoznawalny model naśladujący ludzki złożony zespół bólu regionalnego typu I. Dalej oceniane są nadwrażliwości mechaniczne i termiczne, a także zachowania nocyfensywne wywołane kapsaicyną obserwowane w modelu szczurzym CPIP.

Model przewlekłego bólu po niedokrwieniu złożonego zespołu bólu regionalnego typu I u szczurów

To badanie opisuje metodę dostawowego wstrzykiwania mono-jodooctanu u szczurów i omawia wynikające z tego zachowania związane z bólem i zmianami histopatologicznymi, które dostarczają punktów odniesienia dla przyszłych zastosowań.

Model bólu związanego z chorobą zwyrodnieniową stawów wywołany dostawowym wstrzyknięciem monojodooctanu u szczurów

Mechaniczny test unikania konfliktów jest używany jako nierefleksyjny odczyt wrażliwości na ból u myszy, który może być wykorzystany do lepszego zrozumienia reakcji afektywno-motywacyjnych w różnych modelach bólu myszy.

Mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy

Ten protokół opisuje ocenę mechanicznej nadwrażliwości w modelu szczura neuropatycznego bólu ustno-twarzowego przy użyciu instrumentalnego urządzenia do oceny bólu ustno-twarzowego.

Ocena nadwrażliwości mechanicznej wywołanej uszkodzeniem nerwów u szczurów za pomocą operacyjnego testu bólu ustno-twarzowego

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany model bólu zapalnego z wstrzyknięciem karagenu zarówno tylnej łapy, jak i w celu oceny efektu przeciwbólowego.

Zmodyfikowany model bólu zapalnego do badania działania przeciwbólowego u myszy

Poznaj model iniekcji policzkowej u myszy do jednoczesnego pomiaru bólu i swędzenia. Ta metoda pozwala odróżnić drapanie od wycierania i analizować zachowania związane z oboma doznaniami.

Model iniekcji policzkowej do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem

Przeglądaj więcej filmów