Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu
7 września 2019
Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.
Nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe mogą samoodnawiać się i różnicować w różne typy komórek nerwowych, wspierając rozwój układu nerwowego i oferując zasoby dla medycyny regeneracyjnej. Komórki te są niejednorodne i musimy znać ich specyficzne markery powierzchni komórek, aby uzyskać oczyszczone populacje komórek i zrozumieć ich funkcje. Nasz protokół zapewnia prostą, czułą i wydajną technikę analizy białek błonowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, pomagając zidentyfikować nowe markery powierzchniowe dla tych komórek.
Główną zaletą naszego protokołu jest jego zdolność do bezpośredniej analizy proteomu powierzchniowego pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych z poprawioną czułością i swoistością. Osiąga się to poprzez ich ekspansję poprzez kohodowlę w komórkach śródbłonka in vitro i szlak MAPK-ERK wewnętrznej celulacji o wysokiej jakości w celu znakowania porin powierzchniowych. Dzięki modyfikacjom porów na rozszerzające się komórki macierzyste in vitro, nasz protokół może być łatwo zastosowany do identyfikacji markerów powierzchniowych innych typów komórek macierzystych.
Aby przygotować komórki śródbłonka, ponownie zawiesić osad komórek BEN3 na 10-centymetrowej szalce Petriego przy 90% zbiegu z dziewięcioma mililitrami pożywki komórkowej BEN3. Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodaj kolejne dwa mililitry pożywki BEN3 na studzienkę w dolnej komorze matrycy.
Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Jednego dnia po posianiu komórek we wkładkach należy delikatnie zassać pożywkę, najpierw z dolnej komory, a następnie z wkładów. Umyj powierzchnię wkładek trzykrotnie wstępnie podgrzanym DMEM.
Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanego AM do jednej wkładki. Przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi.
Inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 12 godzin. Rozpuść Ac4ManAz w DMSO, aby osiągnąć stężenie podstawowe 200 milimolów. Pobrać płytkę do kokultury nerwowo-śródbłonkowej z inkubatora.
Dodaj jeden mikrolitr bulionu Ac4ManAz do każdej dolnej komory i 0,5 mikrolitra na wkładkę do kokultury. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć dni. Podczas hodowli komórek dodaj 100 mikrolitrów RM na wkładkę i 200 mikrolitrów RM na dolną komorę, aby ponownie nakarmić komórki śródbłonka i nerwowe co drugi dzień.
Najpierw wyjmij wkładki z płytek współkulturowych i odessaj pożywkę hodowlaną z dna studzienek. Następnie umyj komórki nerwowe raz podgrzanym PBS. Odessać PBS ze studzienek i dodać jeden mililitr wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki.
Utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki trzykrotnie wstępnie schłodzonym PBS. Odessać PBS i dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego buforu sprzężonego z biotyną 1 do każdej studzienki.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odessać bufor reakcyjny ze studzienek i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Dodaj jeden mililitr buforu barwiącego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie odessać bufor barwiący ze studzienek i trzykrotnie umyć komórki wstępnie schłodzonym PBS. Dodaj jeden mililitr buforu blokującego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki trzykrotnie wstępnie schłodzonym PBS.
Odessać PBS z dołków i dodać jeden mililitr przeciwciała wtórnego do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie odessać roztwór ze studzienek i trzykrotnie umyć komórki wstępnie schłodzonym PBS.
Najpierw należy przygotować kompleks siarczanu miedzi BTTAA 2, bufor do re-zawiesiny pełnego białka, bufor do płukania białek 1, bufor do płukania białek 2 i bufor do płukania białek 3, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dennych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie schłodzonym PBS.
Odessać PBS i dodać 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu RIPA do każdej studzienki. Inkubuj płytki na lodzie przez pięć minut, a następnie zbierz lizę białka do 1,5 mililitrowych probówek. Wirować w temperaturze 12000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać resztki komórek.
Przenieś supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra i oznacz stężenie białka za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dostosuj stężenie białka do jednego miligrama na mililitr. Dodaj 100 mikromolowych biotyn alkidowych, 2,5 milimolowego askorbinianu sodu i kompleks siarczanu miedzi 1XBTTAA 2 do jednego mililitra lizy białka.
Dobrze wymieszaj roztwór i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przenieś roztwór reakcyjny do 20 mililitrów wstępnie schłodzonego metanolu w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza, aby wytrącić białka.
Wirować w temperaturze 4500 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby osady białkowe były granulowane. Umyj granulkę dwukrotnie, używając 20 mililitrów wstępnie schłodzonego metanolu na pranie. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad białkowy w czterech mililitrach buforu do re-zawiesiny.
Przenieś re-zawiesinę białka do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umyj 50 mikrolitrów kulek streptawidyny trzykrotnie za pomocą PBS. Dodać umyte kulki do rezawiesiny białka i inkubować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny na pionowym rotatorze z prędkością obrotową 20 obr./min.
Następnie umyj koraliki sekwencyjnie za pomocą każdego pokazanego tutaj bufora do mycia. Ponownie zawieś umyte kulki za pomocą 20 mikrolitrów PBS i przenieś je do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 20 mikrolitrów buforu ładującego białko 2X i traktuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie przetrzyj próbki białek za pomocą SDS-PAGE i wybarwij je Coomassie Brilliant Blue, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu pierwotne embrionalne NSPC są ekspandowane i znakowane metabolicznie in vitro. Udana kokultura śródbłonka prowadzi do tworzenia dużych klonów przypominających arkusze.
Barwienie immunologiczne za pomocą przeciwciał ujawnia, że w klonie większość komórek to NSPC Nestin dodatnie, podczas gdy bardzo niewiele to komórki neuronalne z dodatnim wynikiem beta tubuliny 3. W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek Nestin dodatnich i komórek neuronalnych beta tubuliny 3 dodatnich w klonach powstałych w systemie bez kokultury jest prawie taki sam. Reporter chemiczny Ac4ManAz jest analogiem metabolicznym i może być włączony do wewnętrznego szlaku sialacji białek.
Stosuje się zoptymalizowane stężenie znakowania wynoszące 100 mikromoli dla pierwotnych NSPC, a kombinacyjna ocena śmierci komórki wskazywana przez morfologię komórek i jąder sugeruje, że to stężenie znakowania nie powoduje oczywistych efektów cytotoksycznych i jest w stanie skutecznie znakować NSPC. Nie ma to wpływu na morfologię klonalną, potencjał samoodnawiania i różnicowania NSPC zarówno w kokulturze śródbłonka, jak i w systemie niekokulturowym. Próbki białek przygotowane z kultury znakowanej Ac4ManAz metodą koniugacji biotyny i oczyszczania kulek streptawidyny wykazują silny sygnał barwienia Coomassie Brilliant Blue w żelach SDS-PAGE.
Tymczasem na torach załadowanych próbkami białek z grupy kontrolnej DMSO występowały tylko tła barwiące i niespecyficzne sygnały wiązania. Wskazuje to również na efektywne etykietowanie NSPC przez Ac4ManAz. Podczas próby zastosowania tego protokołu wszystkie roztwory potrzebne do reakcji biokomórkowej powinny być przygotowane na świeżo, a czas reakcji powinien być ściśle kontrolowany, aby zapobiec nadmiernej reakcji.
Zgodnie z naszym protokołem można analizować strukturę glikanu powierzchniowego wzbogaconego w neurokomórki macierzyste. Nasz protokół neuronalnych białek powierzchniowych wzbogaconych w komórki macierzyste i progenitorowe nie tylko zwiększa markery wzrostu, ale także odgrywa ważne funkcje w strategii oczyszczania wypukłego wzorca i ilustracji sztywnych obwodów sygnałowych dla tej populacji komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół, który wykorzystuje in vitro system współkultury komórek nerwowo-endotelialnych do ekspansji pierwotnych komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego. Podejście polega na oznakowaniu sjaloglikoprotein powierzchniowych poprzez metaboliczne włączenie z użyciem bioortogonalnych grup funkcyjnych, ułatwiające obrazowanie i analizę spektrometrii masowej w celu identyfikacji markerów powierzchniowych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki hodowli komórek
Tło
- Komórki macierzyste i progenitorowe układu nerwowego mają zdolności do samoregeneracji i różnicowania.
- Rozumienie markerów powierzchniowych jest kluczowe dla oczyszczania populacji komórek.
- Protokół oferuje wrażliwą i efektywną metodę analizy białek błonowych.
- Identyfikowanie nowych markerów powierzchniowych może poprawić nasze zrozumienie funkcji komórek.
Cel badania
- Zbadanie markerów powierzchniowych specyficznych dla pierwotnych komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego.
- Zapobieganie analizie proteomu powierzchniowego z poprawioną czułością i specyficznością.
- Rozwój metody mającej zastosowanie do innych typów komórek macierzystych.
Stosowane metody
- Badanie wykorzystuje in vitro system współkultury komórek nerwowo-endotelialnych.
- Pierwotne komórki macierzyste i progenitorowe układu nerwowego są ekspandowane poprzez współhodowlę z komórkami endotelialnymi.
- Markery powierzchniowe są oznakowane poprzez metaboliczne włączenie sjaloglikany.
- Hodowla komórek jest prowadzona w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez kilka dni.
- Szczegółowe kroki dotyczące przygotowania komórek endotelialnych i analizy komórek nerwowych są opisane.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia bezpośrednią analizę proteomu powierzchniowego komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego.
- Osiągnięto poprawę czułości i specyficzności w identyfikacji markerów powierzchniowych.
- Podkreślono potencjalne zastosowania do identyfikacji markerów powierzchniowych innych typów komórek macierzystych.
Wnioski
- Badanie umożliwia efektywną identyfikację markerów powierzchniowych na komórkach macierzystych i progenitorowych układu nerwowego.
- Mimo że nie jest zaangażowana żadna analiza multiomika, metoda wspiera postęp w medycynie regeneracyjnej.
- Badania te przyczyniają się do lepszego zrozumienia mechanizmów neuronowych i interakcji komórkowych w układzie nerwowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying specific cell surface markers for primary neural stem and progenitor cells (NSPCs) addresses a critical bottleneck in regenerative medicine and cell therapy development. The lack of defined surface markers hinders purification, functional characterization, and scalable manufacturing of NSPC-based therapeutics. This protocol enables sensitive detection of low-abundance membrane proteins, supporting target de-risking and assay readiness for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying NSPC-enriched surface proteins for target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through comparative sialoglycoproteome analysis between self-renewing and differentiating states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing mechanistic insight into NSPC identity and function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining surface marker panels.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through metabolic labeling and biotin-streptavidin capture.
- Scalability: Supports platform reuse across stem cell types with appropriate modifications to the labeling workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking surface marker expression to NSPC self-renewal and differentiation potential.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent phenotypic readouts.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in cell identity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling biomarker-aligned progression to preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating NSPC-specific surface proteomes.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible outputs compatible with mass spectrometry and imaging.
- Analytics: Generates comparative protein expression data that enable condition-to-condition benchmarking and target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating surface markers in expanded, functional NSPC populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for surface marker discovery across multiple stem cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives in marker identification.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined metabolic labeling and purification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of cellular therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through objective, data-driven surface marker selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural cell culture, metabolic labeling, and bioorthogonal chemistry.
- Depends on instrumentation for cell culture, protein lysis, biotinylation, streptavidin purification, and mass spectrometry.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture conditions, labeling duration, and reagent preparation.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-neural stem cell systems.
- Includes practical limitations such as the need for fresh reagent preparation and strict reaction timing to avoid incomplete labeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Preparation of Mouse Endothelial Culture in Permeable Support Inserts
1:55
Set-up of Neural-endothelial Co-culture and Ac4ManNAz Labeling System
3:25
Immunofluorescent Staining of Sialoglycoproteins in Expanded Primary NSPCs and Differentiated Neurons
5:25
Purification of Sialoglycoproteins from Expanded Primary NSPCs and Differentiated Neurons
8:45
Results: Identifying Cell Surface Markers by Metabolic Labeling of Sialoglycan
10:47
Conclusion
