Name: Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę znakowania metabolicznego sialoglikanu do identyfikacji markerów powierzchniowych pierwotnych komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego. Technika umożliwia analizę proteomu powierzchniowego z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figure 1B, 1C, 1E and 1F są odtworzone z Bai et al.10 za zgodą Królewskiego Towarzystwa Chemicznego. Dziękujemy Yi Hao w laboratorium X. C. za edycję figur. Praca ta jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 91753206 do Q. S. i X. C., nr 31371093 do Q. S. oraz nr 21425204 i 21672013 do X. C.).

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez IACUC (Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt) Uniwersytetu Tsinghua i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC. Zakład dla zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Tsinghua został akredytowany przez AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). W przypadku oceny stopnia zaawansowania zarodków, środek dnia, w którym zidentyfikowano czop pochwowy, obliczono jako dzień embrionalny 0,5 (E0,5).
UWAGA: Wszystkie komórki są hodowane w inkubatorze komórkowym w warunkach 37 °C i 5% CO2 .
1. Przygotowanie hodowli śródbłonka myszy w przepuszczalnych wkładkach podporowych
UWAGA: Komórki BEND3 są utrzymywane zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę komórkową BEND3 (BM), dodając 50 ml FBS i 5 ml penicyliny-streptomycyny do 500 ml DMEM i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Odessać pożywkę z naczynia i przemyć kulturę komórek BEND3 1 ml PBS jeden raz. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek i inkubować komórki przez 4 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml BM do komórek, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie zdysocjować komórki. Przenieść zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadu przez odwirowanie w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki za pomocą 9 ml świeżego BM, a następnie dodać 1 ml zawiesiny komórek do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodać kolejne 2 ml świeżego BM na studzienkę w dolnej komorze matrycy. Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli pierwotnych NSPC kory mózgowej myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki hodowlanej, pożywki do trawienia papainy i korowej pożywki do hodowli przylegającej (AM)
	<ol>
		<li>Pokryj płytki 6-dołkowe poli-L-lizyną (PLL), dodając 1 ml roztworu PLL na studzienkę do płytek 6-dołkowych. Następnie inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść roztwór PLL do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj płytki 3 razy wodą podwójnie destylowaną. Wysuszyć talerze na powietrzu i odłóż je na bok do czasu użycia.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do trawienia papainy, dodając 50 j. papainy, 50 μl L-glutaminy i 50 μl 100 mg/ml acetylo-L-cysteiny do 5 ml DMEM. Krótko wymieszać pożywkę i ogrzać ją do 37 °C przez 30 minut w celu aktywacji enzymu.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do hodowli przylegającej do komórek korowych (AM): dodaj 500 μl L-glutaminy, 500 μl pirogronianu sodu, 500 μl 100 mg/ml N-acetylo-L-cysteiny, 500 μl N2, 1 ml witaminy B27 i 5 μl 100 μg/ml bFGF do 50 ml DMEM. Przed użyciem dobrze wymieszać podłoże i ogrzać je do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pierwotnych komórek kory mózgowej i późniejsze posiew
	<ol>
		<li>Poświęć ciężarną mysz z E10.5 przez zwichnięcie szyjki macicy. 
		nuta: W E10.5 większość komórek proliferuje NSPC w korze mózgowej, dając początek dużym klonom potomstwa in vitro.</li>
		<li>Wysterylizuj brzuch 75% etanolem. Użyj cienkich nożyczek i kleszczy z mikroząbkami, aby otworzyć brzuch, przecinając skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż prawej strony środkowej linii. Delikatnie usuń macicę z jamy brzusznej za pomocą ząbkowanych kleszczy i wytnij ją z jamy brzusznej drobnymi nożyczkami.</li>
		<li>Umyj macicę 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS na 10 cm szalce Petriego. Następnie przenieś macicę na nową 10-centymetrową szalkę Petriego i ponownie umyj ją 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS.</li>
		<li>Przenieś macicę na nową 10-centymetrową szalkę Petriego z 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Usuń zarodki z macicy i błony owodniowej, a następnie odetnij główki zarodków od pni za pomocą mikrokleszczyków Jewelers.</li>
		<li>Umyj głowy 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS i przenieś je na nową 10-centymetrową szalkę Petriego z 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Użyj mikrokleszczyków jubilerskich, aby usunąć skórę i chrząstki pokrywające mózg, a następnie odetnij korę mózgową i zbierz je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml ze wstępnie schłodzonym HBSS.</li>
		<li>Osadzać korę przez odwirowywanie przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i 300 x g. Odessać supernatant z probówki, a następnie dodać aktywowaną pożywkę do trawienia papainą i 15 μl 4 mg/ml DNazy I do osadu tkankowego.</li>
		<li>Ponownie zawiesić na krótko osad tkankowy poprzez delikatne wirowanie. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W tym czasie rozluźnij tkankę poprzez krótkie wirowanie co 10 minut. 
		nuta: Pod koniec trawienia w probówce nie powinny być widoczne żadne kawałki tkanki.</li>
		<li>Komórki korowe osadzać przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 450 x g. Odessać supernatant z probówki i przemyć osad komórkowy wstępnie schłodzonym DMEM. Powtórz ten krok raz. 
		nuta: Podczas trawienia i mycia należy uważać, aby nie pipetować tkanek i osadu komórkowego z grubsza, aby uniknąć uszkodzenia komórek dużą siłą ścinającą.</li>
		<li>Odessać supernatant z probówki, a następnie dodać do probówki 1,5 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Zdeocjuj osad komórek korowych na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując. Policz numer komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Dodaj 2 ml AM i 2 x 104 komórek korowych na studzienkę do płytek 6-dołkowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny, aby komórki mogły przyłączyć się do płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja kokultury neuronalno-śródbłonkowej i systemu znakowania Ac4ManNAz
<ol>
	<li>Dzień po posianiu komórek BEND3 we wkładkach, najpierw delikatnie zassać pożywkę w dolnej komorze, a następnie wkładki. Umyj powierzchnię wkładek 3 razy za pomocą wstępnie podgrzanego DMEM. Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM.</li>
	<li>Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego AM do jednej wkładki, a następnie przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi. Inkubować kokulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 12 godzin.</li>
	<li>Rozpuść Ac4ManNAz w DMSO, aby osiągnąć stężenie wyjściowe 200 mM. 12 godzin po założeniu kokultury nerwowo-śródbłonkowej dodać 1 μl materiału Ac4ManNAz na dolną komorę i 0,5 μl osadu na wkładkę do kokultury. Natychmiast i delikatnie wstrząśnij talerzami, aby dobrze wymieszać podłoże. W przypadku komórek kontrolnych dodaj równą objętość DMSO.</li>
	<li>Hodować komórki przez kolejne 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przygotuj AM z 10x bFGF jako pożywką do ponownego karmienia (RM). W tym czasie dodaj 100 μl RM na wkładkę i 200 μl RM na dolną komorę, aby co drugi dzień dokarmiać komórki śródbłonka i nerwowe. Podczas ponownego karmienia nie należy dostarczać do hodowli Ac4ManNAz ani DMSO.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w rozszerzonych pierwotnych NSPC i zróżnicowanych neuronach
<ol>
	<li>Przygotować kompleks BTTAA-CuSO4 1 30x bulion zawierający 1,5 mM CuSO4 i 9 mM BTTAA w wodzie podwójnie destylowanej. Przygotować świeżo sprzężony z biotyną bufor 1 zawierający 50 μM biotyny-alkinu, 2,5 mM askorbinianu sodu i 1x kompleksBTTAA-CuSO4 w PBS.</li>
	<li>Usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dolnych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie podgrzanym PBS.</li>
	<li>Odessać PBS ze studzienek. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 4% roztworu PBS paraformaldehydu na dołek do komórek i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS.</li>
	<li>Odessać PBS z dołków i dodać do komórek 1 ml świeżo przygotowanego buforu sprzężonego z biotyną 1 na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odessać bufor reakcyjny ze studzienek. Umyj komórki 3 razy PBS. Przygotować bufor barwiący zawierający 1% FBS i 1 μg/ml Alexa Fluor 647-streptawidyny. Dodać 1 ml buforu barwiącego na dołek do komórek i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Odessać bufor barwiący ze studzienek i umytych komórek 3 razy za pomocą wstępnie schłodzonego PBS. Przygotować bufor blokujący zawierający 5% BSA i 0,3% niejonowego detergentu-100 w PBS. Dodać 1 ml buforu blokującego na studzienkę do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając razem przeciwciała anty-nestyny i anty-β-tubuliny III w buforze blokującym w proporcjach odpowiednio 1:20 i 1:1 000. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając razem Alexa Fluor 488 kozią anty-mysią IgG1, Alexa Fluor 546 kozią anty-mysią IgG2b i DAPI w bufor blokujący w rozcieńczeniu 1:1,000. Odessać PBS z dołków i dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała ze studzienek i umyć komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Następnie komórki są gotowe do przechwycenia obrazu.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie sialoglykoprotein z rozszerzonych pierwotnych NSPC i zróżnicowanych neuronów
<ol>
	<li>Przygotować BTTAA-CuSO4 complex 2 15x stock zawierający 1,5 mM CuSO4 i 3 mM BTTAA w wodzie podwójnie destylowanej. Przygotować białkowy bufor do resuspensji A zawierający 4% SDS i 10 mM EDTA w wodzie podwójnie destylowanej; bufor do reprodukcji białek B zawierający 150 mM NaCl, 50 mM trietanoloaminy i 1% polioksyetylenooleilowego eteru (np. Brij97) w podwójnie destylowanej wodzie o pH 7,4. Przed użyciem należy zmieszać bufor A:bufor B = 1:8 (obj./obj.) w celu przygotowania pełnego buforu do resuspensji białka. Przygotować białkowy bufor do przemywania 1 zawierający 2% SDS w PBS; białkowy bufor płuczący 2 zawierający 8 M mocznika w 250 mM wodorowęglanie amonu (ABC); oraz bufor do przemywania białek 3 zawierający 2,5 M NaCl w PBS.</li>
	<li>Usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dennych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie schłodzonym PBS.</li>
	<li>Odessać PBS z dołków i dodać 200 μl wstępnie schłodzonego buforu RIPA na dołek do płytek. Inkubuj płytki na lodzie przez 5 minut. Zebrać lizę białka do probówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać resztki komórek przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 12 000 x g.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Określ stężenie białka za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosuj stężenie białka do 1 mg/ml.</li>
	<li>Dodaj 100 μM alkino-biotyny, 2,5 mM askorbinianu sodu i 1x kompleks BTTAA-CuSO4 2 do 1 ml lizy białek i dobrze wymieszaj roztwór. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieść roztwór reakcyjny do 20 ml wstępnie schłodzonego metanolu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -30 °C przez noc w celu wytrącenia białek.</li>
	<li>Wytrącić białko przez odwirowanie przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 4 500 x g. Umyj granulki białka dwukrotnie 20 ml wstępnie schłodzonego metanolu. Odessać supernatant z probówki. Zawiesić osad białkowy z 4 ml buforu do resuspensji białka i przenieść rezawiesinę białka do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Weź 50 μl kulek streptawidyny i umyj je 3 razy PBS. Dodać umyte kulki do wysiedlenia białka. Inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na rotatorze pionowym z prędkością obrotową 20 obr./min.</li>
	<li>Płukać kulki sekwencyjnie 6 rodzajami: buforem do płukania białek 1, buforem do płukania białek 2, buforem do płukania białek 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC i 0,05 M ABC.</li>
	<li>Po umyciu ponownie zawiesić kulki z 20 μl PBS i przenieść kulki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 20 μl 2x buforu ładującego białko do kulek i traktuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Próbki białek należy następnie poddać SDS-PAGE i wybarwić błękitem brylantowym Coomassie R-250 zgodnie z instrukcjami producenta. Pokrój białka w żelu zgodnie ze wskazaniami błękitu brylantowego Coomassie R-250 do analizy spektrometrii mas.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells%3A+Units+of+Development%2C+Units+of+Regeneration%2C+and+Units+in+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells%3A+Generating+and+Regenerating+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li>
<li>Gal, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Morphological+Heterogeneity+of+Neural+Precursors+in+the+Mouse+Neocortical+Proliferative+Zones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones.</a> Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).</li>
<li>Kawaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+profiling+defines+differential+progenitor+subclasses+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.</a> Development. 135, 3113-3124 (2008).</li>
<li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139, 1535-1546 (2012).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glial+Nature+of+Embryonic+and+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).</li>
<li>Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell+Biology+of+Neurogenesis%3A+Toward+an+Understanding+of+the+Development+and+Evolution+of+the+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li>
<li>Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+glycan+labeling-assisted+discovery+of+cell-surface+markers+for+primary+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells.</a> Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+CNS+cell+generation%3A+a+programmed+sequence+of+neuron+and+glial+cell+production+from+isolated+murine+cortical+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells.</a> Neuron. 28, 69-80 (2000).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan-based+interactions+involving+vertebrate+sialic-acid-recognizing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.</a> Nature. 446, 1023-1029 (2007).</li>
<li>Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Remodeling+of+Cell-Surface+Sialic+Acids%3A+Principles%2C+Applications%2C+and+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances.</a> ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).</li>
<li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li>
<li>Schmidt, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+Study+on+Mass+Spectrometry-Based+Analysis+of+the+Proteome+of+CD34%2BCD123%2B+Progenitor+Cells+for+the+Identification+of+Potential+Targets+for+Immunotherapy+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia.</a> Proteomes. 6, (2018).</li>
<li>Crisan, M., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development.</a> Development. 144, 4195-4195 (2017).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Cysteine+S-Glycosylation+Induced+by+Per-O-Acetylated+Unnatural+Monosaccharides+during+Metabolic+Glycan+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2018).</li>
<li>Gry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+RNA+and+protein+expression+profiles+in+23+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines.</a> BMC Genomics. 10, 365(2009).</li>
<li>Hennen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LewisX+Glycoprotein+Screen+Identifies+the+Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+1+%28LRP1%29+as+a+Modulator+of+Oligodendrogenesis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>O’Brian, C. A., Chu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReviewPost-translational+disulfide+modifications+in+cell+signaling%E2%80%94role+of+inter-protein%2C+intra-protein%2C+S-glutathionyl%2C+and+S-cysteaminyl+disulfide+modifications+in+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission.</a> Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).</li>
<li>Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+proteomics+to+unravel+stem+cell+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms.</a> Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).</li>
<li>Christensen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Type-specific+Post-translational+Modifications+of+Mouse+Osteopontin+Are+Associated+with+Different+Adhesive+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).</li>
<li>Yanagisawa, M., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+functions+of+glycoconjugates+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells.</a> Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Markery powierzchniowe są powszechnie stosowane do znakowania i oczyszczania określonych typów komórek in vitro i in vivo17,18. Odkrycie markerów powierzchniowych w znacznym stopniu przyczynia się do rozwoju medycyny regeneracyjnej i badań nad komórkami macierzystymi, dostarczając narzędzi molekularnych do selektywnego wzbogacania populacji komórek macierzystych z normalnych lub patologicznych tkanek i szalek hodowlanych, oferując oczyszczone zasoby komórkowe do ...

Neuronalne komórki macierzyste są definiowane jako populacja komórek multipotencjalnych, które mogą się samoodnawiać, aby utrzymać pulę komórek macierzystych i różnicować się w neurony i glej. Są to główne typy komórek w układzie nerwowym i mogą oferować ogromny potencjał terapeutyczny w medycynie regeneracyjnej poprzez przeszczepianie komórek do chorych i uszkodzonych mózgów1,2. Wraz z postępem rozwoju populacja nerwowych komórek macierzystych staje się niejednorodna3,4, a odsetek nerwowych komórek macierzystych w mózgu stopniowo maleje5. Ogólnie rzecz biorąc, embrionalne nerwowe komórki macierzyste i inne nerwowe komórki progenitorowe, zbiorczo nazywane nerwowymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (NSPC), znajdują się w strefach rozrodczych, strefie komorowej i strefie podkomorowej u myszy6. W mózgu embrionalnym nerwowe komórki macierzyste generują neurony bezpośrednio lub pośrednio przez pośrednie komórki progenitorowe (IPC), a u niektórych gatunków przez zewnętrzne progenitory strefy podkomorowej (oRGs)7,8. Specyficzna sygnatura molekularna, morfologia, lokalizacja w niszy komórek macierzystych i potencjał różnicowania określają rolę każdego podtypu w organogenezie mózgu i zastosowaniach klinicznych9. Jednak obecnie dostępne markery powierzchni komórek nie mogą jednoznacznie rozróżniać i oczyszczać różnych podtypów NSPC, co ogranicza zrozumienie i wykorzystanie tych podtypów.
Identyfikacja głównych znaczników powierzchni NSPC jest ograniczona przez trzy główne przeszkody. Pierwszym z nich jest ograniczona liczba komórek NSPC w tkance, co utrudnia przygotowanie próbek białek na powierzchni komórki do powszechnej analizy spektrometrii mas. Drugim ograniczeniem jest trudność w wytwarzaniu czystych podtypów komórek w celu generowania danych dotyczących białek błonowych specyficznych dla podtypu. Wreszcie trzecim wyzwaniem jest niski stosunek białek powierzchniowych komórek do białek całych komórek, co utrudnia ich wykrywanie za pomocą analizy spektrometrii mas.
Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy podejście chemoproteomiczne do selektywnego wzbogacania i identyfikowania białek powierzchniowych komórek w pierwotnych NSPC poprzez metaboliczne znakowanie sialoglykoprotein10. Aby wygenerować wystarczającą liczbę NSPC, skorzystaliśmy z ustalonego protokołu do ekspansji i utrzymania pierwotnych embrionalnych NSPC w niezróżnicowanych stanach in vitro, poprzez kohodowlę NSPC z liniami komórkowymi śródbłonka mózgu myszy przy użyciu przepuszczalnej wkładki macierzy nośnej (np. Transwell) system11. W przeciwieństwie do tego, NPSC hodowane samodzielnie bez komórek śródbłonka generują zróżnicowane potomstwo11,12. W ten sposób próbki białek z tych dwóch systemów hodowli mogą być analizowane porównawczo w celu zidentyfikowania białek, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w NSPC i zróżnicowanych neuronach. Ponieważ większość białek powierzchniowych komórek jest modyfikowana przez kwas sjalowy13, nienaturalny analog prekursora kwasu sjalowego N-azydoacetylmannozamin-tetraacylowany (Ac4ManNAz) został użyty do przejęcia wewnętrznego szlaku metabolicznego, tak że endogenne, nowo zsyntetyzowane syloglikany są znakowane grupami azydowymi, generując chemiczny uchwyt14. Poprzez reakcje bioortogonalne za pośrednictwem azydo-alkinów, które sprzężają biotynę z sialoglikanami, białka powierzchniowe komórek mogą być wizualizowane i wzbogacane w celu identyfikacji proteomicznej za pomocą fluoroforu sprzężonego ze streptawidyną lub matrycy14.
Tutaj przeprowadzamy barwienie żelem SDS-PAGE analizy powierzchni sialoglykoproteomu z NSPC rozprężonych w kokulturze śródbłonka i różnicujących komórki w systemie niekokulturowym. Selektywnie oczyszczamy również powierzchniowy sialoglykoproteom w dwóch systemach hodowli w celu porównania proteomicznego. Nasz protokół, w porównaniu z tradycyjnymi protokołami oczyszczania powierzchni komórek opartymi na wirowaniu15, zwiększa skuteczność ekstrakcji poprzez zmniejszenie procedur ekstrakcji białek powierzchniowych poprzez specyficzną koniugację znaczników i oczyszczanie powinowactwa. Tymczasem zwiększa czystość ekstrakcji białek powierzchniowych komórek w oparciu o założenie, że sialilacja zachodzi głównie w białkach powierzchniowych komórki. Chociaż czynniki śródbłonka nie mogą całkowicie zablokować różnicowania ekspandowanych NSPC, badanie porównawcze między kokulturą a kulturą zróżnicowaną zapewnia wygodną metodę wskazania białek powierzchniowych wzbogaconych komórkami macierzystymi bez konieczności analizy białek z NPC oczyszczonych przez FACS16. Uważamy, że to podejście można zastosować do badań białek powierzchniowych w innych układach z odpowiednimi modyfikacjami.

<table><tbody><tr><td>BEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-229</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>1%</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>1%</td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>1 do 100</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A7250</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003726</td><td>10 U/ml</td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>1 do 50</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Gibco</td><td>PHG0261</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10099141</td><td>10% </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA, 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%</td></tr> <tr><td>Sacharoza</td><td>Sangon</td><td>A100335</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Gibco</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Thermo Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący SDS-PAGE 2x</td><td>Solarbio</td><td>P1018</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine protein gel</td><td>invitrogen</td><td>xp00100box</td><td></td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne badanie rozwojowe anty-Nestin</td><td>Hybridoma Bank</td><td>Rat-401</td><td>1 do 20</td></tr><tr><td>Mysia monoklonalna anty-beta-tubulina III</td><td>Sigma</td><td>T8860</td><td>1 do 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysia IgG1</td><td>invitrogen</td><td>A-21121</td><td>1 do 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 koza anty-mysia IgG2b</td><td>invitrogen</td><td>A-21143</td><td>1 do 1,000</td></tr><tr><td>Albumina bydlęca V</td><td>Amresco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694</td><td></td></tr><tr><td>BCA zestaw testowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Brij97</td><td>Aladdin</td><td>B129088</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Alkino-biotyna</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>TA105</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1236</td><td></td></tr><tr><td>Ac4ManNAz</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1084</td><td>100 &micro; M</td></tr><tr><td>9AzSia</td><td>zsyntetyzowane w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A100322</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A100227</td><td></td></tr><tr><td>Mąka Alexa 647-sprzężona streptawidyna</td><td>invitrogen</td><td>S21374</td><td>1 do 1,000</td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptawidyna&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>970-00026-00</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>12 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe (NSPC) są komórkową podstawą złożonych struktur i funkcji mózgu. Znajdują się one w wyspecjalizowanych niszach in vivo i mogą być izolowane i namnażane in vitro, służąc jako ważny zasób do przeszczepu komórek w celu naprawy uszkodzeń mózgu. Jednak NSPC są niejednorodne i nie są jasno zdefiniowane na poziomie molekularnym ani oczyszczone z powodu braku specyficznych markerów powierzchni komórek. Przedstawiony protokół, który został już wcześniej opisany, łączy system kohodowli nerwowo-śródbłonkowej z metodą znakowania glikanów metabolicznych w celu identyfikacji powierzchniowego sialoglykoproteomu pierwotnych NSPC. System kohodowli NSPC-śródbłonek umożliwia samoodnawianie i ekspansję pierwotnych NSPC in vitro, generując wystarczającą liczbę NSPC. Sialoglikany w hodowanych NSPC są znakowane przy użyciu nienaturalnego reportera metabolicznego kwasu sjalowego z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi. Porównując sialoglykoproteom z samoodnawiających się NSPC namnażanych w kokulturze śródbłonka z różnicującą się hodowlą neuronalną, identyfikujemy listę białek błonowych, które są wzbogacone w NSPC. W szczegółach protokół obejmuje: 1) ustanowienie kokultury NSPC-śródbłonek i kultury różnicującej NSPC; 2) znakowanie azydocukrem per-O-acetylowaną N-azydoacetylomannosaminą (Ac4ManNAz); oraz 3) koniugacja biotyny ze zmodyfikowanym sialoglykanem do obrazowania po utrwaleniu hodowli neuronalnej lub ekstrakcji białka z hodowli neuronalnej do analizy spektrometrii mas. Następnie kandydaci na markery powierzchniowe wzbogacone o NSPC są wybierani poprzez analizę porównawczą danych spektrometrii mas zarówno z ekspandowanego NSPC, jak i zróżnicowanych kultur neuronowych. Protokół ten jest bardzo czuły w identyfikacji białek błonowych o niskiej obfitości w materiałach wyjściowych i może być stosowany do odkrywania markerów w innych systemach z odpowiednimi modyfikacjami

Cała procedura ekspansji in vitro i znakowania metabolicznego pierwotnych embrionalnych NSPC trwa 6 dni (Rycina 1A). Jakość linii komórkowej BEND3 oraz świeżo wyizolowanych pierwotnych NSPC są kluczowe dla powodzenia eksperymentu. Komórki BEND3 stanowią źródło rozpuszczalnych czynników stymulujących samoodnawianie i proliferację NSPC. Należy upewnić się, że komórki BEND3 są wolne od zanieczyszczeń i dzielą się aktywnie, przy minimalnym poziomie śmierci komórk...

Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe mogą samoodnawiać się i różnicować w różne typy komórek nerwowych, wspierając rozwój układu nerwowego i oferując zasoby dla medycyny regeneracyjnej. Komórki te są niejednorodne i musimy znać ich specyficzne markery powierzchni komórek, aby uzyskać oczyszczone populacje komórek i zrozumieć ich funkcje. Nasz protokół zapewnia prostą, czułą i wydajną technikę analizy białek błonowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, pomagając zidentyfikować nowe markery powierzchniowe dla tych komórek.Główną zaletą naszego protokołu jest jego zdolność do bezpośredniej analizy proteomu powierzchniowego pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych z poprawioną czułością i swoistością. Osiąga się to poprzez ich ekspansję poprzez kohodowlę w komórkach śródbłonka in vitro i szlak MAPK-ERK wewnętrznej celulacji o wysokiej jakości w celu znakowania porin powierzchniowych. Dzięki modyfikacjom porów na rozszerzające się komórki macierzyste in vitro, nasz protokół może być łatwo zastosowany do identyfikacji markerów powierzchniowych innych typów komórek macierzystych.Aby przygotować komórki śródbłonka, ponownie zawiesić osad komórek BEN3 na 10-centymetrowej szalce Petriego przy 90% zbiegu z dziewięcioma mililitrami pożywki komórkowej BEN3. Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodaj kolejne dwa mililitry pożywki BEN3 na studzienkę w dolnej komorze matrycy.Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Jednego dnia po posianiu komórek we wkładkach należy delikatnie zassać pożywkę, najpierw z dolnej komory, a następnie z wkładów. Umyj powierzchnię wkładek trzykrotnie wstępnie podgrzanym DMEM.Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanego AM do jednej wkładki. Przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi.Inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 12 godzin. Rozpuść Ac4ManAz w DMSO, aby osiągnąć stężenie podstawowe 200 milimolów. Pobrać płytkę do kokultury nerwowo-śródbłonkowej z inkubatora.Dodaj jeden mikrolitr bulionu Ac4ManAz do każdej dolnej komory i 0,5 mikrolitra na wkładkę do kokultury. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć dni. Podczas hodowli komórek dodaj 100 mikrolitrów RM na wkładkę i 200 mikrolitrów RM na dolną komorę, aby ponownie nakarmić komórki śródbłonka i nerwowe co drugi dzień.Najpierw wyjmij wkładki z płytek współkulturowych i odessaj pożywkę hodowlaną z dna studzienek. Następnie umyj komórki nerwowe raz podgrzanym PBS. Odessać PBS ze studzienek i dodać jeden mililitr wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki.Utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki trzykrotnie wstępnie schłodzonym PBS. Odessać PBS i dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego buforu sprzężonego z biotyną 1 do każdej studzienki.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odessać bufor reakcyjny ze studzienek i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Dodaj jeden mililitr buforu barwiącego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie odessać bufor barwiący ze studzienek i trzykrotnie umyć komórki wstępnie schłodzonym PBS. Dodaj jeden mililitr buforu blokującego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki trzykrotnie wstępnie schłodzonym PBS.Odessać PBS z dołków i dodać jeden mililitr przeciwciała wtórnego do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie odessać roztwór ze studzienek i trzykrotnie umyć komórki wstępnie schłodzonym PBS.Najpierw należy przygotować kompleks siarczanu miedzi BTTAA 2, bufor do re-zawiesiny pełnego białka, bufor do płukania białek 1, bufor do płukania białek 2 i bufor do płukania białek 3, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dennych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie schłodzonym PBS.Odessać PBS i dodać 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu RIPA do każdej studzienki. Inkubuj płytki na lodzie przez pięć minut, a następnie zbierz lizę białka do 1,5 mililitrowych probówek. Wirować w temperaturze 12000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać resztki komórek.Przenieś supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra i oznacz stężenie białka za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dostosuj stężenie białka do jednego miligrama na mililitr. Dodaj 100 mikromolowych biotyn alkidowych, 2,5 milimolowego askorbinianu sodu i kompleks siarczanu miedzi 1XBTTAA 2 do jednego mililitra lizy białka.Dobrze wymieszaj roztwór i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przenieś roztwór reakcyjny do 20 mililitrów wstępnie schłodzonego metanolu w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza, aby wytrącić białka.Wirować w temperaturze 4500 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby osady białkowe były granulowane. Umyj granulkę dwukrotnie, używając 20 mililitrów wstępnie schłodzonego metanolu na pranie. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad białkowy w czterech mililitrach buforu do re-zawiesiny.Przenieś re-zawiesinę białka do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umyj 50 mikrolitrów kulek streptawidyny trzykrotnie za pomocą PBS. Dodać umyte kulki do rezawiesiny białka i inkubować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny na pionowym rotatorze z prędkością obrotową 20 obr./min.Następnie umyj koraliki sekwencyjnie za pomocą każdego pokazanego tutaj bufora do mycia. Ponownie zawieś umyte kulki za pomocą 20 mikrolitrów PBS i przenieś je do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 20 mikrolitrów buforu ładującego białko 2X i traktuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie przetrzyj próbki białek za pomocą SDS-PAGE i wybarwij je Coomassie Brilliant Blue, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu pierwotne embrionalne NSPC są ekspandowane i znakowane metabolicznie in vitro. Udana kokultura śródbłonka prowadzi do tworzenia dużych klonów przypominających arkusze.Barwienie immunologiczne za pomocą przeciwciał ujawnia, że w klonie większość komórek to NSPC Nestin dodatnie, podczas gdy bardzo niewiele to komórki neuronalne z dodatnim wynikiem beta tubuliny 3. W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek Nestin dodatnich i komórek neuronalnych beta tubuliny 3 dodatnich w klonach powstałych w systemie bez kokultury jest prawie taki sam. Reporter chemiczny Ac4ManAz jest analogiem metabolicznym i może być włączony do wewnętrznego szlaku sialacji białek.Stosuje się zoptymalizowane stężenie znakowania wynoszące 100 mikromoli dla pierwotnych NSPC, a kombinacyjna ocena śmierci komórki wskazywana przez morfologię komórek i jąder sugeruje, że to stężenie znakowania nie powoduje oczywistych efektów cytotoksycznych i jest w stanie skutecznie znakować NSPC. Nie ma to wpływu na morfologię klonalną, potencjał samoodnawiania i różnicowania NSPC zarówno w kokulturze śródbłonka, jak i w systemie niekokulturowym. Próbki białek przygotowane z kultury znakowanej Ac4ManAz metodą koniugacji biotyny i oczyszczania kulek streptawidyny wykazują silny sygnał barwienia Coomassie Brilliant Blue w żelach SDS-PAGE.Tymczasem na torach załadowanych próbkami białek z grupy kontrolnej DMSO występowały tylko tła barwiące i niespecyficzne sygnały wiązania. Wskazuje to również na efektywne etykietowanie NSPC przez Ac4ManAz. Podczas próby zastosowania tego protokołu wszystkie roztwory potrzebne do reakcji biokomórkowej powinny być przygotowane na świeżo, a czas reakcji powinien być ściśle kontrolowany, aby zapobiec nadmiernej reakcji.Zgodnie z naszym protokołem można analizować strukturę glikanu powierzchniowego wzbogaconego w neurokomórki macierzyste. Nasz protokół neuronalnych białek powierzchniowych wzbogaconych w komórki macierzyste i progenitorowe nie tylko zwiększa markery wzrostu, ale także odgrywa ważne funkcje w strategii oczyszczania wypukłego wzorca i ilustracji sztywnych obwodów sygnałowych dla tej populacji komórek.

identifying-cell-surface-markers-primary-neural-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film demonstruje protokół wspólnego hodowania komórek śródbłonka mózgu myszy i pierwotnych korowych komórek macierzystych oraz znakowania glikoprotein na powierzchni komórki za pomocą Ac4ManNAz (azydocukier per O-acetylowany N-azydoacetylomannosamin). Metoda ta pozwala na selektywne wzbogacanie i identyfikację białek powierzchniowych komórek w komórkach pierwotnych.

Znakowanie markerów powierzchni komórek nerwowych za pomocą azydocukru podczas wspólnej hodowli z komórkami śródbłonka

Ten film demonstruje biotynylację i fluorescencyjne znakowanie zmodyfikowanych sialoglykoprotein w pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych i progenitorowych, a także neuronach, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w neuronalnych komórkach progenitorowych i neuronach

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę znakowania metabolicznego sialoglikanu do identyfikacji markerów powierzchniowych pierwotnych komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego. Technika umożliwia analizę proteomu powierzchniowego z wysoką czułością.

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Przeglądaj więcej filmów