Name: Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Poznaj metodę zakażenia ludzkich fibroblastów skórnych wirusem MCPyV w celu badania cyklu zakaźnego i interakcji z komórkami gospodarza. Protokół obejmuje izolację komórek, przygotowanie wirionów oraz barwienie immunofluorescencyjne i hybrydyzację in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Meenhardowi Herlynowi (Wistar Institute) i Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) za dostarczenie odczynników i wsparcia technicznego. Dziękujemy również członkom naszych laboratoriów za pomocną dyskusję. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 i R01CA142723), NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) oraz nagrodę Penn CFAR (P30 AI 045008).

Ludzkie napletki noworodków uzyskano z Centrum Badań nad Chorobami Skóry w Penn. Dorosłe ludzkie fibroblasty uzyskano z odrzuconej normalnej skóry po operacji. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Pensylwanii.
1. Izolacja ludzkich fibroblastów skórnych
<ol>
	<li>Użyj nożyczek, aby odciąć tłuszcz i tkankę podskórną z napletka ludzkiego noworodka i przeciąć próbkę skóry na połówki lub ćwiartki.</li>
	<li>Inkubować tkankę w 5 ml 10 mg/ml dypazy II w PBS uzupełnionym antybiotykiem przeciwgrzybiczym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>W sterylnym naczyniu o długości 10 cm ostrożnie oddziel naskórek od warstw skóry za pomocą kleszczy do mikrodysekcji.</li>
	<li>Przenieś powstałą tkankę skórną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml kolagenazy typu IV o stężeniu 2 mg/ml w pożywce wolnej od FBS, uzupełnionej antybiotykiem przeciwgrzybiczym.</li>
	<li>Próbkę inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 4–6 godzin, okresowo wytrząsając, aż pozostanie tylko kilka makroskopowych agregatów tkankowych.</li>
	<li>Uwolnij pojedyncze komórki ze skóry właściwej, pipetując energicznie w górę i w dół (rozcierając) dziesięć razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Wirować przy 180 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umieść zdysocjowane komórki w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% L-glutaminą w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Rekombinowany preparat wirionu MCPyV
<ol>
	<li>Trawić 50 μg plazmidu pR17b (przenoszącego genom MCPyV) z 250 U BamHI-HF w objętości 200 μl (4 godziny w temperaturze 37 °C), aby oddzielić genom wirusa od szkieletu wektora (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dodać 1200 μl buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do strawionego DNA i oczyść za pomocą 2 miniprep kolumn wirowych (pojemność 20 μg DNA). Eluować wytrawiony plazmid pR17b z każdej kolumny za pomocą 200 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Przygotować reakcję ligacji w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 400 μl oczyszczonego plazmidowego DNA z kroku 2.2, 8,6 ml 1,05x buforu ligazy T4 i 6 μl ligazy T4 o wysokim stężeniu. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać 45 ml buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do ligacji i użyć kolektora próżniowego, aby załadować przez 2 kolumny wirowe miniprep. Eluować każdą kolumnę za pomocą 50 μl buforu TE. Spodziewaj się plonu około 30 μg DNA.</li>
	<li>Późnym popołudniem/wieczorem wysiewaj 6 x 106 293TT28 komórek do 10 cm naczynia zawierającego pożywkę DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% L-glutaminą bez higromycyny B.</li>
	<li>Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne. Transfekcja przy użyciu 66 μl odczynnika do transfekcji (1,1 μL/cm2), 12 μg ponownie zligowanego izolatu MCPyV DNA R17b z kroku 2.4, 8,4 μg plazmidu o ekspresji ST pMtB i 9,6 μg plazmidu o ekspresji LT pADL*29.</li>
	<li>Kiedy transfekowane komórki są prawie zlewające się, następnego dnia trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowego naczynia w celu dalszej ekspansji.</li>
	<li>Opcjonalnie należy pobrać niewielką liczbę komórek 293TT po rozprężeniu i przeprowadzić barwienie IF dla MCPyV LT (CM2B4) i VP1 (MCV VP1 rabbit30) w celu określenia wydajności transfekcji. Na tym etapie jądrowy sygnał LT może być widoczny, ale ekspresja VP1 prawdopodobnie nie będzie wykrywalna.</li>
	<li>Gdy 15-centymetrowa szalka stanie się prawie zlewająca (zwykle 5-6 dni po początkowej transfekcji), przenieś komórki do trzech 15-centymetrowych szalek. Zbierz komórki z 15-centymetrowych szalek, gdy staną się prawie zlewające się i postępuj zgodnie z poniższym protokołem zbierania wirusa. 
	UWAGA: Opcjonalnie przeprowadź kontrolę jakości IF zgodnie z opisem w kroku 2.8. Na tym etapie większość komórek powinna być zarówno MCPyV LT, jak i VP1 dodatnia.</li>
	<li>Aby zebrać wirusa, trypsynizuj komórki, wiruj w temperaturze 180 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuń supernatant. Dodać jedną objętość osadu komórkowego DPBS-Mg (DPBS z 9,5 mM MgCl2 i 1x antybiotyk-antybiotyk). Następnie dodać 25 mM siarczanu amonu (z 1 M roztworu podstawowego o pH 9), a następnie 0,5% Triton X-100 (z 10% roztworu podstawowego), 0,1% benzonazy i 0,1% DNazy zależnej od ATP. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 15 minut na lodzie, a następnie dodać 0,17 objętości 5M NaCl. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w wirówce o temperaturze 4 °C. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwróć probówkę i powtórz etap wirowania. Przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą jednej objętości DPBS uzupełnionej 0,8 M NaCl i ponownie odwirować, jak opisano w kroku 2.11.</li>
	<li>Połączyć supernatanty z kroku 2.11 i 2.12 i ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 2.11.</li>
	<li>Wlewaj gradienty jodiksanolu do cienkościennych probówek poliamerowych o pojemności 5 ml, podkładając (27%, następnie 33%, a następnie 39%) w krokach ~0,7 ml za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w długą igłę lub pipetę p1000.</li>
	<li>Obciążyć 3 ml sklarowanego supernatantu zawierającego wirusa na przygotowany gradient jodiksanolu.</li>
	<li>Wirować przez 3,5 h przy 234 000 x g i temperaturze 16 °C w wirniku SW55ti. Ustaw przyspieszanie i zwalnianie na wolne.</li>
	<li>Po ultraodwirowaniu zebrać 12 frakcji w silikonowanych probówkach (każda frakcja to ~400 μL).</li>
	<li>Przeanalizuj frakcje pod kątem obecności wirusa za pomocą odczynnika dsDNA i/lub Western blot dla VP1 (MCV VP1 rabbit30). Połącz frakcje gradientu z pikową zawartością dsDNA i/lub VP1 i scharakteryzuj stado za pomocą ilościowego PCR, aby obliczyć ekwiwalent genomu wirusa31. Przechowywać zapas wirionu MCPyV w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Infekcja
<ol>
	<li>Utrzymuj pierwotne ludzkie fibroblasty skóry w DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutaminy. Po osiągnięciu konfluencji rozłup fibroblasty 1:4 bez wirowania w dół. 
	UWAGA: Aby uzyskać najwyższą skuteczność infekcji MCPyV, należy użyć pierwotnych fibroblastów między pasażami 5 i 12, które aktywnie dzielą się w czasie posiewu.</li>
	<li>Aby zainfekować ludzkie fibroblasty skóry, odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki schodzą z naczynia.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3 μM CHIR99021, z których wszystkie stymulują infekcję MCPyV24, do naczynia i przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować komórki w masie 180 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3μM CHIR99021 przy 2-4 x 104 komórkach na ml.</li>
	<li>Wysiewać 200 μl zawiesiny komórkowej uzupełnionej 1 mg/ml kolagenazy typu IV do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozmrozić wirion MCPyV na lodzie. Dodać 109 odpowiedników genomu wirusa wirionów MCPyV (obliczonych w kroku 2.18) na 1 μl jodiksanolu na każde 2500 do 5000 komórek, które mają być zakażone. Delikatnie postukaj w bok płytki i umieść ją w inkubatorze.</li>
	<li>Po inkubacji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48-72 h dodać 20% FBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Pozostawić infekcję do postępu w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 72-96 godzin.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Napraw komórki otrzymane w kroku 3.9 za pomocą 3% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki w buforze blokującym/permeabilizacyjnym (0,5% Triton X-100, 3% BSA w PBS przefiltrowanym przez filtr 0,22 μm) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować komórki z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: mysim monoklonalnym anty-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000) i króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-MCPyV VP1 (1:2000), w RT przez 3 godziny.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi: kozią anty-mysią IgG Fluor 594 (1:1000) i Fluor 488 kozią anty-króliczą IgG (1:500) w temperaturze RT przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Przeciwbarwić komórki 0,5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i przeanalizuj za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. DNA in situ HCR
UWAGA: Ta technika wymaga, aby komórki były umieszczane na szkiełkach nakrywkowych. W tym celu opisane powyżej warunki infekcji (krok 3) można przeskalować do formatu płytki 24-dołkowej.
<ol>
	<li>Utrwalić komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA w PBS przez 10 minut. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS, a następnie potraktuj je 70% etanolem, aby przepuszczalność komórek w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Utrwalone próbki mogą pozostawać w tym stanie przez kilka dni.</li>
	<li>Próbki należy wstępnie zhybrydyzować, zastępując etanol buforem do hybrydyzacji sondy i inkubując przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę(-y) (1 μM) (tabela 1) w roztworze buforowym do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 na 30 minut przed zakończeniem etapu wstępnej hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji odpipetować ~10 μl rozcieńczonej mieszanki sondy na szkiełko nakrywkowe na szkiełko mikroskopowe. Umieść szkiełka nakrywkowe, komórką do dołu, na odpowiednich kropelkach mieszanki sondy hybrydyzacyjnej. Uszczelnij krawędzie i grzbiety szkiełek nakrywkowych do szkiełek za pomocą dużej ilości cementu gumowego.</li>
	<li>Podgrzewać szkiełka z dodanymi sondami w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, ustawiając szkiełka na płaskiej stronie bloku grzewczego. Przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować w temperaturze 45 °C przez noc. Aby zrobić prostą nawilżoną komorę, lekko zwilż sterylne ręczniki papierowe o dH2O i umieść na dnie plastikowego pojemnika, który zamyka gumową uszczelką. 
	UWAGA: Podczas podgrzewania cement gumowy może przez chwilę bulgotać. Upewnij się jednak, że plomba nie pęknie.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij cement gumowy za pomocą kleszczy i umieść szkiełka nakrywkowe komórką do góry z powrotem w dołkach 24-dołkowej płytki. Umyj szkiełka nakrywkowe buforem do przemywania sondy w temperaturze RT trzy razy.</li>
	<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe w buforze do amplifikacji (200 μl na płytkach 24-dołkowych) w temperaturze 30-60 minut RT.</li>
	<li>W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy (Tabela 1) w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając do 94 °C przez 90 s i schładzając do RT przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Wymieszać dwie spinki do włosów w buforze do amplifikacji, każda w rozcieńczeniu 1:50.</li>
	<li>Przygotować powierzchnię do reakcji amplifikacji, rozciągając film parafinowy na otwartej powierzchni pokrywy 24-dołkowej płytki. Odpipetować 50-100 μl kropelek mieszaniny spinki do włosów/buforu wzmacniającego na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj kleszczyków, aby ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworu do wstępnego amplifikacji. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe, dotykając krawędzi porowatą jednorazową chusteczką i położyć komórką do dołu na kropli amplifikacji.</li>
	<li>Umieść pokrywkę płytki przytrzymującą szkiełka nakrywkowe w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Ponownie umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach. Próbki należy inkubować z 5x SSCT [5x chlorek sodu cytrynian sodu (SSC) 0,1% Tween 20 przefiltrowany przez filtr 0,22 μm] zawierający 0,5 μg/ml DAPI przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki dwukrotnie za pomocą 5x SSCT w RT.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych. Przeanalizuj komórki i zobrazuj próbki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Gjoerup, O., Chang, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGjoerup%2C+O+%22Advances+in+Cancer+Research%22">Advances in Cancer Research</a>. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).</li>
<li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li>
<li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li>
<li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li>
<li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li>
<li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li>
<li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li>
<li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li>
<li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li>
<li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).</li>
<li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).</li>
<li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181(2012).</li>
<li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).</li>
<li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li>
<li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+a+virus-induced+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li>
<li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+Changing+incidence+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li>
<li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li>
<li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li>
<li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Skin+Microbiota%3A+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499(2012).</li>
<li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+viruses+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468(2011).</li>
<li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+%28MCPyV%29+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112(2011).</li>
<li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li>
<li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li>
<li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane powyżej metody, w tym izolacja fibroblastów skóry z ludzkiej tkanki skórnej, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV, zakażenie hodowanych komórek, barwienie immunofluorescencyjne oraz czuła metoda FISH zaadaptowana z technologii HCR, która powinna umożliwić naukowcom analizę infekcji MCPyV27. Jednym z najważniejszych etapów prowadzących do zakażenia MCPyV in vitro jest produkcja preparatów wirionowych o wysokim mianie. Korzystając z opisanego tutaj protokołu otrzymywania rekombinowan...

Poliomawirus z komórek Merkla (MCPyV) to mały, dwuniciowy wirus DNA, który jest związany z rzadkim, ale agresywnym rakiem skóry, rakiem z komórek Merkla (MCC)1,2. Śmiertelność MCC, około 33%, przewyższa śmiertelność czerniaka3,4. MCPyV ma kolisty genom o wielkości ~5 kb1,5 podzielony przez niekodujący region regulatorowy (NCRR) na wczesne i późne regiony kodowania1. NCRR zawiera wirusowe pochodzenie replikacji (Ori) i dwukierunkowe promotory transkrypcji wirusa6,7. Wczesny region koduje białka antygenu nowotworowego zwane dużym T (LT), małym T (sT), 57kT, alternatywnym LT ORF (ALTO), a także autoregulacyjnym miRNA1,8,9,10. Późny region koduje białka kapsydu VP1 i VP211,12,13. LT i sT są najlepiej przebadanymi białkami MCPyV i wykazano, że wspierają replikację wirusowego DNA i nowotworzenie indukowane przez MCPyV5. Klonalna integracja DNA MCPyV z genomem gospodarza, którą zaobserwowano nawet w 80% MCC, jest prawdopodobnie czynnikiem sprawczym dla rozwoju nowotworu wirusowo-dodatniego14,15.
Częstość występowania MCC potroiła się w ciągu ostatnich dwudziestu lat16. Bezobjawowe zakażenie MCPyV jest również szeroko rozpowszechnione w populacji ogólnej17,18,19. Wraz z rosnącą liczbą diagnoz MCC i wysokim rozpowszechnieniem infekcji MCPyV istnieje potrzeba lepszego zrozumienia wirusa i jego potencjału onkogennego. Jednak wiele aspektów biologii MCPyV i mechanizmów onkogennych pozostaje słabo poznanych20. Dzieje się tak głównie dlatego, że MCPyV słabo replikuje się w ustalonych liniach komórkowych11,12,21,22,23 i do niedawna nie odkryto komórek skóry zdolnych do podtrzymywania infekcji MCPyV22. Badania mechanistyczne mające na celu pełne zbadanie MCPyV i jego interakcji z komórkami gospodarza były utrudnione przez brak systemu hodowli komórkowych do namnażania wirusa5.
Odkryliśmy, że pierwotne ludzkie fibroblasty skórne (HDF) wyizolowane z ludzkiego napletka noworodka wspierają silne zakażenie MCPyV zarówno in vitro, jak i ex vivo24. Na podstawie tego badania ustaliliśmy pierwszy model infekcji kulturą komórkową dla MCPyV24. Opierając się na tym systemie modelowym, wykazaliśmy, że indukcja genów metaloproteinazy macierzy (MMP) przez szlak sygnałowy WNT/β-kateniny i inne czynniki wzrostu stymuluje infekcję MCPyV. Co więcej, odkryliśmy, że zatwierdzony przez FDA antagonista MEK, trametynib, skutecznie hamuje infekcję MCPyV5,25. Na podstawie tych badań ustaliliśmy również zestaw protokołów do izolowania ludzkich fibroblastów skórnych24,25, przygotowując wiriony MCPyV11,12, przeprowadzając infekcję MCPyV na ludzkich fibroblastach skóry24,25 i wykrywając białka MCPyV przez barwienie IF26. Ponadto dostosowaliśmy technologię łańcuchowej reakcji hybrydyzacji DNA in situ (HCR)27, aby opracować wysoce czułą technikę FISH (HCR-DNA FISH) do wykrywania DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry. Te nowe metody będą przydatne do badania cyklu zakaźnego MCPyV, a także odpowiedzi komórkowej na zakażenie MCPyV. Naturalne komórki rezerwuarowe gospodarza, które utrzymują infekcję MCPyV, oraz komórki, które powodują nowotwory MCC, pozostają nieznane. Techniki, które opisujemy w tym manuskrypcie, mogą być stosowane do badania różnych typów komórek ludzkich w celu identyfikacji zarówno komórek rezerwuarowych, jak i pochodzenia guzów MCC. Nasze sprawdzone metody, takie jak HCR-DNA FISH, mogą być również wykorzystane do wykrywania innych wirusów nowotworowych DNA i charakteryzowania interakcji między komórkami gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Surowica płodu cielęcego</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GLUTAMAX I, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-Glutamina</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF, CF</td><td>R& Systemy D</td><td>236-EG-200</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>SML1046</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>DMEM Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11032</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-królik IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Ochrona przed światłem</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>anty-MCPyV LT (CM2B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-136172</td><td>Część # B2717</td></tr><tr><td>MCV VP1 królik</td><td></td><td>Królicza surowica poliklonalna #10965</td><td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe czynniki wzrostu fibroblastów (bFGF), ludzki rekombinowany</td><td>Corning</td><td>354060</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczna dla plazmidu DNaza zależna od ATP EPICENTRE</td><td></td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny sondy</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>Bufor do płukania sondy</td><td>Technologie</td><td></td> <td>molekularne</td></tr><tr><td>Bufor wzmacniający</td> Technologie <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Spinki do włosów z oznaczeniem Alexa 594</td><td>Technologie molekularne</td><td>B4</td><td>Ochrona przed światłem</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA</td><td>Odczynnik Thermo Fisher Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Buffer PB</td><td>Qiagen</td><td>19066</td><td></td></tr><tr><td>niebieska kolumna wirowa miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>50mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaza</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5602</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenie i wykrywanie poliomawirusa merkla

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Zakażenie poliomawirusem z komórek Merkla (MCPyV) może prowadzić do raka z komórek Merkla (MCC), wysoce agresywnej formy raka skóry. Badania mechanistyczne mające na celu pełne zbadanie biologii molekularnej MCPyV i mechanizmów onkogennych były utrudnione przez brak odpowiednich modeli hodowli komórkowych. W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów do przeprowadzania i wykrywania infekcji MCPyV pierwotnych ludzkich komórek skóry. Protokoły opisują izolację ludzkich fibroblastów skóry, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV oraz wykrywanie infekcji wirusowej zarówno za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF), jak i reakcji łańcuchowej hybrydyzacji DNA in situ (HCR), która jest bardzo czułym podejściem do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH). Zawarte w nich protokoły mogą być adaptowane przez zainteresowanych badaczy w celu zidentyfikowania innych typów komórek lub linii komórkowych, które wspierają infekcję MCPyV. Opisane podejście opracowane w ramach projektu FISH można również zaadaptować do wykrywania niskich poziomów wirusowego DNA obecnego w zakażonej skórze ludzkiej.

Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie pozwolił na izolację niemal jednorodnej populacji HDF (Rysunek 1). Jak wykazano w barwieniu immunofluorescencyjnym, niemal 100% ludzkich komórek skóry właściwej wyizolowanych zgodnie z warunkami opisanymi w niniejszym protokole wykazalo pozytywne barwienie na markery fibroblastów skóry właściwej: wimentynę oraz kolagen I.24, lecz wykazują brak ekspresji markera keratynocytów przesłonki prącia ...

Tutaj prezentujemy protokół infekowania pierwotnego ludzkiego fibroblastu skórnego MCPyV. Protokół obejmuje izolację fibroblastów skóry, przygotowanie wirionów MCPyV, zakażenie wirusem, barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Protokół ten można rozszerzyć w celu scharakteryzowania interakcji MCPyV-gospodarz i odkrycia innych typów komórek zakażonych przez MCPyV.

Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Zaprezentowaliśmy pierwszy model hodowli komórkowej w celu zakażenia poliomawirusem Merkel Cell. Protokół obejmuje izolację fibroblastów skóry, przygotowanie zakażenia wirusem MCPyV, barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Protokół ten umożliwia badanie cyklu zakaźnego MCPyV i interakcji z komórkami gospodarza przy jednoczesnym unikaniu artefaktów związanych z nadmierną ekspresją genów wirusa.Na początek użyj nożyczek, aby przyciąć tłuszcz i tkankę podskórną z ludzkiego napletka noworodka. Próbkę skóry należy przeciąć na połówki lub ćwiartki. Umieść tkankę w 5 mililitrach po 10 miligramów na mililitr nieodpartyzowanego II NPBS, uzupełnionego antybiotykiem przeciwgrzybiczym.Inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą kleszczy do mikrodysekcji ostrożnie oddziel naskórek od warstw skóry właściwej w 10-centymetrowym naczyniu. Przenieś powstałą tkankę skórną do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 5 mililitrów 2 miligramów na mililitr kolagenazy typu IV w pożywce wolnej od FBS, uzupełnionej antybiotykiem znieczulającym.Próbkę inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla z okresowym wytrząsaniem przez cztery do sześciu godzin, aż pozostanie tylko kilka makroskopowych agregatów tkankowych. Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety energicznie pipetuj roztwór próbki w górę iw dół 10 razy, uwalniając pojedyncze komórki ze skóry właściwej. Wirować przy 180 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant.Płytkę zdysocjowanych komórek w uzupełnionej pożywce DMEM. Późnym popołudniem lub wieczorem wysiew 6 milionów komórek 293TT28 do 10-centymetrowej pożywki zawierającej uzupełnioną pożywkę DMEM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne, a następnie przetransfekuj komórki 66 mikrolitrami odczynnika do transfekcji, 12 mikrogramami ponownie zligowanego izolatu MCPyV DNA R17B, 8,4 mikrograma plazmidu o ekspresji ST pMtB i 9,6 mikrograma plazmidu o ekspresji LT pADL. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia, gdy transfekowane komórki są już prawie zlewne, trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowej naczynia w celu dalszej ekspansji.Kiedy to naczynie stanie się prawie zlewne, przenieś komórki do trzech nowych 15-centymetrowych szalek. Kiedy te nowe naczynia staną się prawie zlewne, zbierz komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wirować przy 180 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie usunąć supernatant i dodać jedną objętość komórek magnezu DPBS. Dodać 25 mikromolowych siarczanów amonu, a następnie 0,5% Triton X-100, 0,1% benzonazy i 0,1% DNA zależnego od ATP. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia schłodzić mieszaninę na lodzie przez 15 minut. Następnie dodać 0,17 objętości chlorku sodu. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut.Wirować w 12 tys. g w 4 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki.Zawiesić osad w 1 objętości DPBS uzupełnionej 0,8 mola chlorku sodu. Wirować w 12 tys. g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie.Połączyć oba supernatanty i ponownie odwirować w temperaturze 12 tysięcy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety naniesiono gradienty jodiksanolu do cienkościennych pięciomililitrowych probówek poliallomerowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załadować 3 mililitry sklarowanego supernatantu zawierającego wirusa na przygotowany gradient jodiksanalu.Wirować z wirnikiem SW 55 Ti o masie 234 tys. g i temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 3,5 godziny, upewniając się, że przyspieszenie i opóźnienie są ustawione na wolne. Po zakończeniu ultrawirowania zbierz 12 frakcji w silikonowanych probówkach. Po utrzymaniu i odłączeniu komórek, w 10 mililitrach uzupełnionego DMEM i pożywki F12 do naczynia.Przenieś roztwór komórkowy do 15-mililitrowej probówki. Wirować przy 180 g przez dwie minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w uzupełnionym pożywce DMEM i F12 o gęstości komórek od 20 tysięcy do 40 tysięcy komórek na mililitr.Następnie wysiewaj 200 lub 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej uzupełnionej 1 miligramem na mililitr kolagenazy typu IV do każdego dołka odpowiednio 24 lub 96-dołkowej. Wyjmij bulion MCPyV viron z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść na lodzie do rozmrożenia. Dodać 1 miliard ekwiwalentów genomu wirusa wirionów MCPyV na jeden mikrolitr jodiksanolu na każde 2500 do 5000 komórek, które mają zostać zakażone.Delikatnie postukaj w bok płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Najpierw przymocuj komórki do szkiełek nakrywkowych z 4% PFA w PBS przez 10 minut, a następnie umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS i potraktuj je 70% etanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby przepuszczalność komórek. Następnego dnia zastąp etanol buforem hydratacyjnym sondy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60 minut w celu wstępnej hybrydyzacji próbek.Na 30 minut przed zakończeniem inkubacji przed hybrydyzacją rozcieńczyć sondy w roztworze do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 i inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji odpipetować około 10 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny sondy na szkiełko mikroskopowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na odpowiedniej kropli mieszanki hybrydyzacyjnej.Używając dużej ilości cementu gumowego, uszczelnij krawędzie i tył każdego szkiełka nakrywkowego do szkiełka. Ustaw szkiełko na płaskiej stronie bloku grzewczego i podgrzewaj je do 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie przenieś szkiełko do nawilżonej komory i inkubuj je w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij cement gumowy. Umieść szkiełka pokrywy stroną z komórkami do góry w dołkach 24-dołkowej płytki i umyj je trzykrotnie buforem do przemywania sondy w temperaturze pokojowej. Dodać 200 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut.W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając je do 94 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie schładzając je do temperatury pokojowej przez 30 minut. Wymieszać spinki do włosów w buforze wzmacniającym w rozcieńczeniu 1:50. Następnie rozciągnij folię parafinową na otwartej powierzchni pokrywy płytki 12-dołkowej, aby uzyskać powierzchnię do reakcji amplifikacji.Odpipetować 50-100 mikrolitrów kropelek mieszanki spinki do włosów na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń każde szkiełko nakrywkowe ze wstępnego amplifikacji roztwór i dotknij krawędzi porowatą jednorazową chusteczką do wyschnięcia. Umieść każdą wysuszoną szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na kropli amplifikacji.Przenieść pokrywkę płytki do wilgotnej komory i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej i w ciemności. Następnego dnia należy zwrócić szkiełka nakrywkowe do dołków płytki 24-dołkowej. Dodać 5X SSCT zawierający DAPI w stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie należy dwukrotnie przemyć próbki 5X SSCT w temperaturze pokojowej. Zamontuj umyte szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych i użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do analizy komórek i zobrazowania próbek. W tym badaniu wyizolowano prawie jednorodną populację ludzkich fibroblastów skóry.Barwienie immunofluorescencyjne ujawnia, że prawie 100% izolowanych ludzkich komórek skóry właściwej jest pozytywnie wybarwionych pod kątem markerów fibroblastów skóry, wimentyny i kolagenu, ale ujemnych dla ludzkiego markera keratynocytów napletka K14. Następnie generowane są wiriony MCPyV i po wizualizacji pasma wirionów MCPyV skoncentrowanych w rdzeniu gradientu, pobiera się 500 frakcji mikrolitrowych i wykonuje się MCPyV qPCR w celu identyfikacji frakcji pików. Pokazano tutaj immunofluorescencyjne barwione obrazy HDF zakażonych MCPyV, gdzie komórki, które są LT dodatnie, VP1 dodatnie lub zarówno LT, jak i VP1 dodatnie, są uważane za dodatnie pod względem infekcji MCPyV.Ponad 30% komórek jest LT dodatnich, a ponad 10% jest dodatnich VP1. Genomy MCPyV replikowane w zakażonych komórkach są wykrywane zarówno przy użyciu HCR-DNA FISH, jak i immunofluorescencyjnego HCR-DNA FISH. Podczas gdy HCR-DNA FISH ujawnia lokalizację DNA MCPyV obecnego w fabryce replikacji, metody immunofluorescencyjne-HCR-DNA FISH pozwalają na jednoczesne wykrywanie kolokalizacji zarówno DNA MCPyV, jak i białka LT w centrach replikacji.Aby osiągnąć najlepszą skuteczność infekcji wirusowej, bardzo ważne jest, aby MCPyV był skoncentrowany do co najmniej 2 x 10 do 8 genomu wirusa na mikrolitr, ponieważ jodoksanol jest toksyczny dla komórek. Po zakażeniu fibroblastów skóry MCPyV można przeprowadzić wiele molekularnych analiz biologicznych, w tym immunofluorescencję, immunoblokowanie, immunopozytyfikację i test oparty na qPCR. Opisany przez nas system infekcji umożliwia naukowcom badanie etapów infekcji MCPyV, takich jak handel jądrowy i pakowanie wirusów.MCPyV jest wirusem BSL-2, ale niewiele wiadomo na temat jego potencjału patologicznego w ilościach osiąganych w warunkach laboratoryjnych. Dlatego badacze powinni podjąć środki ostrożności, aby uniknąć narażenia na wirusa.

merkel-cell-polyomavirus-infection-and-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

W tym filmie pokazujemy przygotowanie poliomawirusa z komórek Merkla lub wirionów MCPyV przy użyciu komórek 273TT. Technologia ta pomaga w wytwarzaniu wysokiego miana rekombinowanych wirionów MCPyV.

Preparat wirionu rekombinowanego poliomawirusa z komórek Merkla (MCPyV): technika wytwarzania rekombinowanego wirionu MCPyV o wysokim mianie

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

Poznaj metodę zakażenia ludzkich fibroblastów skórnych wirusem MCPyV w celu badania cyklu zakaźnego i interakcji z komórkami gospodarza. Protokół obejmuje izolację komórek, przygotowanie wirionów oraz barwienie immunofluorescencyjne i hybrydyzację in situ.

Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla

Przeglądaj więcej filmów