Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla

Zaprezentowaliśmy pierwszy model hodowli komórkowej w celu zakażenia poliomawirusem Merkel Cell. Protokół obejmuje izolację fibroblastów skóry, przygotowanie zakażenia wirusem MCPyV, barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Protokół ten umożliwia badanie cyklu zakaźnego MCPyV i interakcji z komórkami gospodarza przy jednoczesnym unikaniu artefaktów związanych z nadmierną ekspresją genów wirusa.

Na początek użyj nożyczek, aby przyciąć tłuszcz i tkankę podskórną z ludzkiego napletka noworodka. Próbkę skóry należy przeciąć na połówki lub ćwiartki. Umieść tkankę w 5 mililitrach po 10 miligramów na mililitr nieodpartyzowanego II NPBS, uzupełnionego antybiotykiem przeciwgrzybiczym.

Inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą kleszczy do mikrodysekcji ostrożnie oddziel naskórek od warstw skóry właściwej w 10-centymetrowym naczyniu. Przenieś powstałą tkankę skórną do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 5 mililitrów 2 miligramów na mililitr kolagenazy typu IV w pożywce wolnej od FBS, uzupełnionej antybiotykiem znieczulającym.

Próbkę inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla z okresowym wytrząsaniem przez cztery do sześciu godzin, aż pozostanie tylko kilka makroskopowych agregatów tkankowych. Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety energicznie pipetuj roztwór próbki w górę iw dół 10 razy, uwalniając pojedyncze komórki ze skóry właściwej. Wirować przy 180 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant.

Płytkę zdysocjowanych komórek w uzupełnionej pożywce DMEM. Późnym popołudniem lub wieczorem wysiew 6 milionów komórek 293TT28 do 10-centymetrowej pożywki zawierającej uzupełnioną pożywkę DMEM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne, a następnie przetransfekuj komórki 66 mikrolitrami odczynnika do transfekcji, 12 mikrogramami ponownie zligowanego izolatu MCPyV DNA R17B, 8,4 mikrograma plazmidu o ekspresji ST pMtB i 9,6 mikrograma plazmidu o ekspresji LT pADL. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia, gdy transfekowane komórki są już prawie zlewne, trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowej naczynia w celu dalszej ekspansji.

Kiedy to naczynie stanie się prawie zlewne, przenieś komórki do trzech nowych 15-centymetrowych szalek. Kiedy te nowe naczynia staną się prawie zlewne, zbierz komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wirować przy 180 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie usunąć supernatant i dodać jedną objętość komórek magnezu DPBS. Dodać 25 mikromolowych siarczanów amonu, a następnie 0,5% Triton X-100, 0,1% benzonazy i 0,1% DNA zależnego od ATP. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia schłodzić mieszaninę na lodzie przez 15 minut. Następnie dodać 0,17 objętości chlorku sodu. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut.

Wirować w 12 tys. g w 4 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki.

Zawiesić osad w 1 objętości DPBS uzupełnionej 0,8 mola chlorku sodu. Wirować w 12 tys. g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie.

Połączyć oba supernatanty i ponownie odwirować w temperaturze 12 tysięcy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety naniesiono gradienty jodiksanolu do cienkościennych pięciomililitrowych probówek poliallomerowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załadować 3 mililitry sklarowanego supernatantu zawierającego wirusa na przygotowany gradient jodiksanalu.

Wirować z wirnikiem SW 55 Ti o masie 234 tys. g i temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 3,5 godziny, upewniając się, że przyspieszenie i opóźnienie są ustawione na wolne. Po zakończeniu ultrawirowania zbierz 12 frakcji w silikonowanych probówkach. Po utrzymaniu i odłączeniu komórek, w 10 mililitrach uzupełnionego DMEM i pożywki F12 do naczynia.

Przenieś roztwór komórkowy do 15-mililitrowej probówki. Wirować przy 180 g przez dwie minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w uzupełnionym pożywce DMEM i F12 o gęstości komórek od 20 tysięcy do 40 tysięcy komórek na mililitr.

Następnie wysiewaj 200 lub 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej uzupełnionej 1 miligramem na mililitr kolagenazy typu IV do każdego dołka odpowiednio 24 lub 96-dołkowej. Wyjmij bulion MCPyV viron z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść na lodzie do rozmrożenia. Dodać 1 miliard ekwiwalentów genomu wirusa wirionów MCPyV na jeden mikrolitr jodiksanolu na każde 2500 do 5000 komórek, które mają zostać zakażone.

Delikatnie postukaj w bok płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Najpierw przymocuj komórki do szkiełek nakrywkowych z 4% PFA w PBS przez 10 minut, a następnie umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS i potraktuj je 70% etanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby przepuszczalność komórek. Następnego dnia zastąp etanol buforem hydratacyjnym sondy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60 minut w celu wstępnej hybrydyzacji próbek.

Na 30 minut przed zakończeniem inkubacji przed hybrydyzacją rozcieńczyć sondy w roztworze do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 i inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji odpipetować około 10 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny sondy na szkiełko mikroskopowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na odpowiedniej kropli mieszanki hybrydyzacyjnej.

Używając dużej ilości cementu gumowego, uszczelnij krawędzie i tył każdego szkiełka nakrywkowego do szkiełka. Ustaw szkiełko na płaskiej stronie bloku grzewczego i podgrzewaj je do 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie przenieś szkiełko do nawilżonej komory i inkubuj je w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij cement gumowy. Umieść szkiełka pokrywy stroną z komórkami do góry w dołkach 24-dołkowej płytki i umyj je trzykrotnie buforem do przemywania sondy w temperaturze pokojowej. Dodać 200 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut.

W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając je do 94 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie schładzając je do temperatury pokojowej przez 30 minut. Wymieszać spinki do włosów w buforze wzmacniającym w rozcieńczeniu 1:50. Następnie rozciągnij folię parafinową na otwartej powierzchni pokrywy płytki 12-dołkowej, aby uzyskać powierzchnię do reakcji amplifikacji.

Odpipetować 50-100 mikrolitrów kropelek mieszanki spinki do włosów na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń każde szkiełko nakrywkowe ze wstępnego amplifikacji roztwór i dotknij krawędzi porowatą jednorazową chusteczką do wyschnięcia. Umieść każdą wysuszoną szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na kropli amplifikacji.

Przenieść pokrywkę płytki do wilgotnej komory i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej i w ciemności. Następnego dnia należy zwrócić szkiełka nakrywkowe do dołków płytki 24-dołkowej. Dodać 5X SSCT zawierający DAPI w stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie należy dwukrotnie przemyć próbki 5X SSCT w temperaturze pokojowej. Zamontuj umyte szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych i użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do analizy komórek i zobrazowania próbek. W tym badaniu wyizolowano prawie jednorodną populację ludzkich fibroblastów skóry.

Barwienie immunofluorescencyjne ujawnia, że prawie 100% izolowanych ludzkich komórek skóry właściwej jest pozytywnie wybarwionych pod kątem markerów fibroblastów skóry, wimentyny i kolagenu, ale ujemnych dla ludzkiego markera keratynocytów napletka K14. Następnie generowane są wiriony MCPyV i po wizualizacji pasma wirionów MCPyV skoncentrowanych w rdzeniu gradientu, pobiera się 500 frakcji mikrolitrowych i wykonuje się MCPyV qPCR w celu identyfikacji frakcji pików. Pokazano tutaj immunofluorescencyjne barwione obrazy HDF zakażonych MCPyV, gdzie komórki, które są LT dodatnie, VP1 dodatnie lub zarówno LT, jak i VP1 dodatnie, są uważane za dodatnie pod względem infekcji MCPyV.

Ponad 30% komórek jest LT dodatnich, a ponad 10% jest dodatnich VP1. Genomy MCPyV replikowane w zakażonych komórkach są wykrywane zarówno przy użyciu HCR-DNA FISH, jak i immunofluorescencyjnego HCR-DNA FISH. Podczas gdy HCR-DNA FISH ujawnia lokalizację DNA MCPyV obecnego w fabryce replikacji, metody immunofluorescencyjne-HCR-DNA FISH pozwalają na jednoczesne wykrywanie kolokalizacji zarówno DNA MCPyV, jak i białka LT w centrach replikacji.

Aby osiągnąć najlepszą skuteczność infekcji wirusowej, bardzo ważne jest, aby MCPyV był skoncentrowany do co najmniej 2 x 10 do 8 genomu wirusa na mikrolitr, ponieważ jodoksanol jest toksyczny dla komórek. Po zakażeniu fibroblastów skóry MCPyV można przeprowadzić wiele molekularnych analiz biologicznych, w tym immunofluorescencję, immunoblokowanie, immunopozytyfikację i test oparty na qPCR. Opisany przez nas system infekcji umożliwia naukowcom badanie etapów infekcji MCPyV, takich jak handel jądrowy i pakowanie wirusów.

MCPyV jest wirusem BSL-2, ale niewiele wiadomo na temat jego potencjału patologicznego w ilościach osiąganych w warunkach laboratoryjnych. Dlatego badacze powinni podjąć środki ostrożności, aby uniknąć narażenia na wirusa.