Name: Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę pościgu impulsów radioaktywnych do analizy fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie kinetyki biosyntezy białek z wykorzystaniem 35S-metyoniny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratorium Braakmana, byłym i obecnym, za owocne dyskusje i pomoc w rozwijaniu metod przedstawionych w tym artykule. Projekt ten otrzymał dofinansowanie zarówno od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) nr 235649, jak i od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) w ramach programu ECHO nr 711.012.008.

Wszystkie radioaktywne odczynniki i procedury były traktowane zgodnie z lokalnymi zasadami i przepisami dotyczącymi promieniowania Uniwersytetu w Utrechcie.
1. Pościg za pulsem
<ol>
	<li>Pościg impulsowy dla komórek przylegających 
	UWAGA: Podane tutaj objętości są oparte na 60 mm szalkach do hodowli komórkowych. W przypadku naczyń 35 mm lub 100 mm pomnóż objętości odpowiednio przez 1/2 lub 2. Protokół ten wykorzystuje czas impulsu wynoszący 10 minut i czasy pościgu wynoszące 0, 15, 30, 60, 120 i 240 minut. Mogą się one różnić w zależności od konkretnych badanych białek (omówionych poniżej).
	<ol>
		<li>Umieść komórki przylegające do nasion (np. HEK 293, HeLa, CHO) w sześciu 60-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych, tak aby w dniu pościgu za impulsem były one subkonfluentne (80% - 90%). Użyj co najmniej jednego naczynia na punkt czasowy i/lub warunek.</li>
		<li>Jeśli jest to wymagane, należy przetransfekować komórki dostępnymi w handlu odczynnikami do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta; lub, wirusowo transduce8 komórek na 1 dzień przed eksperymentem z pościgiem za impulsem z odpowiednim konstrukcją do ekspresji.</li>
		<li>Umyć naczynia 2 ml buforu do przemywania (zrównoważony roztwór soli Hanka [HBSS]), dodać 2 ml pożywki głodowej (normalna pożywka hodowlana bez metioniny i cysteiny oraz płodowej surowicy bydlęcej [FBS], takiej jak minimalna pożywka egzogenna [MEM] bez metioniny i cysteiny, ale z 10 mM HEPES, pH 7,4) i umieścić naczynia w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 15 minut.</li>
		<li>Przenieść naczynia na ruszty w łaźni wodnej podgrzanej o temperaturze 37 °C, tak aby miały kontakt z wodą, ale nie unosiły się na wodzie. Uruchom minutnik.</li>
		<li>Po 40 s zassać pożywkę głodową, pobrać 600 μl roztworu impulsowego (pożywka głodowa + etykieta na naczyniu 55 μCi/35 mm, patrz uwaga poprzedzająca krok 1.1.1) do pipety i delikatnie dodać ją do środka naczynia dokładnie po 1 minutach. Powtórz ten krok w odstępach 1-minutowych dla pozostałych naczyń. Zacznij od najdłuższej próbki pościgowej, aby zaoszczędzić czas podczas eksperymentu. 
UWAGA: Podczas obchodzenia się z materiałem radioaktywnym należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności oraz lokalnych zasad i przepisów, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i/lub skażeniu.</li>
		<li>Dokładnie po 11 minutach i dla wszystkich następnych potraw, z wyjątkiem 0-minutowej próbki pościgowej, dodaj 2 ml pożywki chase bezpośrednio do naczynia, odessaj ją i ponownie dodaj 2 ml pożywki chase. Powtarzaj ten krok w odstępach 1-minutowych dla pozostałych potraw. Przenieść wszystkie naczynia do inkubatora o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dokładnie po 16 minutach dodać 2 ml pożywki (normalna pożywka hodowlana + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cysteiny i 5 mM metioniny) bezpośrednio do naczynia na próbkę 0 min na pożywce pulsacyjnej, aby zatrzymać etykietowanie; następnie natychmiast odessać, przenieść naczynie na schłodzoną aluminiową płytkę i dodać 2 ml lodowatego buforu zatrzymującego (HBSS + 20 mM N-etylomaleimidu [NEM]). 
		UWAGA: To jest próbka pościgu 0 min. W przypadku tego przykładu przejdź bezpośrednio do kroku 1.1.9.</li>
		<li>Przenieść każdą pożywkę z powrotem do łaźni wodnej na 2 minuty przed każdym pościgiem (np. 24 minuty w przypadku 15-minutowego pościgu) i dokładnie w tym samym czasie pościgu (np. 26 minut w przypadku 15-minutowego pościgu) zassać pożywkę chase (lub przenieść ją do probówki mikrowirówkowej, jeśli następuje wydzielanie białka) i przenieść naczynie na schłodzoną płytkę aluminiową. Dodać 2 ml lodowatego buforu zatrzymującego.</li>
		<li>Inkubować wszystkie szalki na lodzie w buforze zatrzymującym przez ≥5 minuty, następnie odessać roztwór zatrzymujący i przemyć go 2 ml lodowatego roztworu zatrzymującego. Naczynia do mycia i lizy odessać 600 μl buforu do lizy (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] + detergent niedenaturujący [patrz tabela materiałów] + inhibitory proteazy + 20 mM NEM). Użyj skrobaka do komórek, aby upewnić się, że naczynia są poddawane lizie ilościowej.</li>
		<li>Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 - 20 000 x g i 4 °C w celu osadzenia jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pościg impulsowy do ogniw zawiesinowych 
	UWAGA: Aby zapewnić wydajne etykietowanie, komórki powinny być pulsowane w stężeniu od 3 x 106 do 5 x 106 komórek/ml, a objętości chase powinny być 4 razy większe niż objętość impulsu. W poniższym przykładzie pulsowaliśmy 5 x 106 komórek w objętości 1 ml przez 10 minut, aby uzyskać pięć punktów czasowych pościgu (0, 15, 30, 60 i 120 minut) o pojemności 1 ml, zawierających 1 x 106 komórek na punkt czasowy. Wszystkie rozwiązania są takie same jak w sekcji 1.1.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki zawiesiny (np. 3T3, Jurkat) zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem9 tak, aby w czasie eksperymentu była wystarczająca liczba komórek, co najmniej 1 x 106 komórek na punkt czasowy i/lub warunek.</li>
		<li>W razie potrzeby przetransfekuj komórki dostępnymi na rynku odczynnikami do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta lub przetransdukuj wirusowo8 komórek na 1 dzień przed eksperymentem z pościgiem za impulsem z odpowiednim konstruktem do ekspresji.</li>
		<li>Granulki 5 x 106 komórek na stan w probówce o pojemności 50 ml przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej, umyj je 1x 5 ml pożywki głodowej, ponownie zagnieźdź i ponownie zawieś w 1 ml pożywki głodowej.</li>
		<li>Przenieść komórki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować je przez 10 - 25 minut. Mieszać probówki co 10 - 15 minut, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie.</li>
		<li>Uruchom minutnik. Dokładnie po 1 minucie dodać 275 μCi (55 μCi/1 x 106 komórek) nierozcieńczonej etykiety bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i mieszać do wymieszania. 
		UWAGA: Podczas obchodzenia się z materiałem radioaktywnym należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności oraz lokalnych zasad i przepisów, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i/lub skażeniu.</li>
		<li>Dokładnie po 11 minutach przerwij etykietowanie, dodając 4 ml pożywki chase. Wymieszać próbkę i natychmiast przenieść 1 ml do 15 ml probówki z lodem, zawierającej 9 ml lodowatego roztworu zatrzymującego. 
		UWAGA: To jest próbka pościgu 0 min.</li>
		<li>Powtórz te kroki dla każdego kolejnego punktu czasowego. Po zebraniu wszystkich punktów czasowych osadzać komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę (lub przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 ml, jeśli następuje wydzielanie białka). Przemyć komórki 5 ml roztworu zatrzymującego i granulować komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać roztwór zatrzymujący, całkowicie zlizować komórki za pomocą 300 μl lodowatego buforu do lizy i inkubować je przez 20 minut na lodzie, aby zapewnić pełną lizę. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 - 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Połączyć przeciwciała (patrz dyskusja) i 50 μl kulek immunoprecypitacyjnych (np. białko A-Sepharose) (10% zawiesiny [v/v] w buforze do lizy + 0,25% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]) w probówce do mikrowirówki i inkubować je w temperaturze 4 °C przez ~30 minut w shakerze.</li>
	Granulki osadzać <li>przez 1 minutę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Dodać 200 μl lizatu do mieszaniny przeciwciało i kulki i inkubować w temperaturze 4 °C w wytrząsarce przez 1 godzinę lub głowę nad głową, jeśli immunoprecypitacja wymaga >1 godziny.</li>
	<li>Granuluj kulki przez 1 minutę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać 1 ml buforu do przemywania immunoprecypitacyjnego. Umieścić próbkę w wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Granuluj kulki zgodnie z opisem w kroku 2.3 i powtórz pranie 1x. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl buforu TE o pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Odwirować próbkę.</li>
	<li>Dodać 20 μl 2x buforu próbki bez środka redukującego, wirować go, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i ponownie wirować. 
	UWAGA: W przypadku przygotowywania tylko próbek redukcyjnych należy w tym momencie dodać 2 μL 500 mM DTT. Następnie przejdź do kroku 2.7.</li>
	<li>Ułóż kulki zgodnie z opisem w kroku 2.3. Przenieść 19 μl niezredukowanego supernatantu do świeżej probówki do mikrowirówki zawierającej 1 μl 500 mM DTT, odwirować próbkę i ponownie ją przetrząsnąć przed ponownym ogrzewaniem przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Wirować próbkę przez 1 minutę przy 12 000 x g; jest to próbka zredukowana. Schłodzić do temperatury pokojowej i dodać 1,1 μl 1 M NEM zarówno do zredukowanej, jak i niezredukowanej próbki. Odwirować i odwirować próbki.</li>
</ol>
3. STRONA SDS
<ol>
	<li>Najpierw określ odpowiednią zawartość procentową żelu rozdzielczego SDS-PAGE dla interesującego Cię białka. Na przykład HIV-1 gp120, po deglikozylacji, działa w temperaturze ~60 kDa i jest analizowany w 7,5% żelu.</li>
	<li>Mieszaninę żelu rozdzielczego należy przygotować bez TEMED zgodnie z zaleceniami producenta (x% akrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v] i 0,05% nadsiarczanu amonu [APS] [w/v]) i odgazować pod próżnią przez >15 min. Podczas odgazowywania mieszaniny żelu należy dokładnie oczyścić szklane płytki żelowe z 70% etanolem i niestrzępiącymi się chusteczkami i umieścić je w aparacie odlewniczym.</li>
	<li>Dodać TEMED do mieszaniny żelu rozdzielczego (o końcowym stężeniu 0,005% [v/v]), dokładnie wymieszać i pipetować między szklanymi płytkami, pozostawiając ~1,5 cm miejsca na żel do układania. Ostrożnie pokryj żel dejonizowanymH2Olub izopropanolem i pozostaw do polimeryzacji.</li>
	<li>Po polimeryzacji żelu rozdzielczego należy przygotować mieszaninę żelu do układania w stos (4% akrylamidu, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v] i 0,025% APS [w/v]).</li>
	<li>Przepłukać górną część żelu rozdzielczego dejonizowanymH2O, a następnie usunąć całą wodę. 
	UWAGA: Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć ostatnie krople.</li>
	<li>Dodaj TEMED do mieszaniny żelu do układania w stosy (0,005% [v/v]), dokładnie wymieszaj i pokryj żel rozdzielczy żelem do układania w stos i włóż 15-dołkowy grzebień. Po polimeryzacji żelu do układania w stosy przenieś go do komory bieżącej i napełnij górną i dolną komorę buforem do pracy (25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyny [pH 8,3] i 0,1% SDS [w/v]).</li>
	<li>Załadować 10 μl próbki na linię do 15-pasmowego miniżelu. Należy unikać ładowania próbek na pierwszym i ostatnim pasie żelu i ładować nieredukcyjny bufor próbki we wszystkie puste paski, aby zapobiec uśmiechaniu się pasm. Uruchom żele ze stałym ciśnieniem 25 mA/żel, aż przód barwnika znajdzie się na dole żelu.</li>
	<li>Usunąć żele z płytek szklanych, zabarwić je roztworem barwiącym białko (10% kwas octowy i 30% metanol wH2O+ 0,25% błękit brylantowy R250 [w/v]) przez 5 minut z mieszaniem, a następnie odbarwić przez 30 minut roztworem odbarwiającym (roztwór barwiący bez błękitu brylantowego R250).</li>
	<li>Ułóż żele stroną zadrukowaną do dołu na folii plastikowej, a następnie połóż na nich bibułę chromatograficzną o grubości 0,4 mm. Umieść żelową chromatografię warstwową papierową stroną do dołu na suszarce żelowej. Postępując zgodnie z zaleceniami producenta, suszyć żele przez 2 godziny w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Wysuszone żele przenieść do kasety i pokryć folią autoradiograficzną lub ekranem luminoforowym. W przypadku korzystania z filmu autoradiograficznego ten krok należy wykonać w ciemnym pomieszczeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody pościgu impulsowego były niezbędne do pogłębienia wiedzy naukowców na temat fałdowania białek w nienaruszonych komórkach. Chociaż staraliśmy się zapewnić metodę, która jest tak ogólna, jak to tylko możliwe, podejście to ma potencjał dla prawie nieograniczonych wariacji do badania różnych procesów zachodzących podczas fałdowania, transportu i życia białek wewnątrz komórki.
Podczas wykonywania pościgu impulsowego przy użyciu przylegających komórek w naczyniach, ważne jest, aby traktować k...

Składanie nawet stosunkowo prostych białek obejmuje wiele różnych enzymów fałdujących, molekularnych białek opiekuńczych i modyfikacji kowalencyjnych1. Całkowite odtworzenie tych procesów in vitro jest praktycznie niemożliwe, biorąc pod uwagę ogromną liczbę różnych składników. Dlatego bardzo pożądane jest badanie fałdowania białek in vivo, w żywych komórkach. Techniki pogoni za impulsami radioaktywnymi okazują się potężnym narzędziem do badania syntezy, fałdowania, transportu i degradacji białek w ich naturalnym środowisku.
Metaboliczne znakowanie białek podczas krótkiego impulsu za pomocą 35znakowanej S metioniny/cysteiny, a następnie pościg w przypadku braku radioaktywnego znacznika, pozwala na specyficzne śledzenie populacji nowo zsyntetyzowanych białek w szerszym środowisku komórkowym. Następnie białka docelowe można wyizolować za pomocą immunoprecypitacji i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE lub innych technik. W przypadku wielu białek ich wędrówka przez komórkę jest zaznaczona modyfikacjami, które są widoczne na żelu SDS-PAGE. Na przykład transportowi glikozylowanych białek z retikulum endoplazmatycznego (ER) do kompleksu Golgiego często towarzyszą modyfikacje glikanów sprzężonych z N lub dodanie glikanów sprzężonych z O2,3. Modyfikacje te powodują duży wzrost pozornej masy cząsteczkowej, co można zaobserwować poprzez zmiany ruchliwości w SDS-PAGE. Dojrzewanie może być również zaznaczone przez rozszczepienia proteolityczne, takie jak rozszczepienie peptydu sygnałowego lub usunięcie pro-peptydów, co skutkuje zmianami w pozornej masie cząsteczkowej, które można łatwo śledzić na SDS-PAGE gel4. Radioaktywność ma znaczną przewagę nad porównywalnymi technikami, takimi jak pościgi cykloheksymidowe, w których zapobiega się syntezie nowych białek, ponieważ dłuższe leczenie jest toksyczne dla komórek i nie wyklucza z analizy większości starszych białek w stanie stacjonarnym, ponieważ niektóre białka mają okres półtrwania wynoszący kilka dni. Porównanie białek zarówno w warunkach nieredukujących, jak i redukujących pozwala na analizę tworzenia wiązań dwusiarczkowych, ważnego kroku w fałdowaniu wielu białek wydzielniczych4,5,6,7.
Tutaj opisujemy ogólną metodę analizy fałdowania i transportu białek w nienaruszonych komórkach, stosując podejście radioaktywnego impulsu pościgowego. Chociaż naszym celem było zapewnienie metody tak szczegółowej, jak to tylko możliwe, protokół ma prawie nieograniczony potencjał adaptacyjny i pozwoli na optymalizację w celu zbadania specyficznych białek każdego czytelnika.
Dostępne są dwa alternatywne protokoły pościgu impulsowego, jeden dla komórek przylegających (krok 1.1 protokołu przedstawionego tutaj) i jeden dla komórek zawiesinowych (krok 1.2 protokołu przedstawionego tutaj). Podane tutaj warunki są wystarczające do wizualizacji białka wyrażającego się o średnich lub wysokich poziomach ekspresji. Jeśli czytelnik pracuje ze słabo eksprymowanymi białkami lub różnymi stanami po leczeniu, takimi jak wielokrotne immunoprecypitacje, konieczne jest odpowiednie zwiększenie rozmiaru naczynia lub liczby komórek.
Dla pościgu za impulsem zawieszenia, próbki chase pobrane w każdym punkcie czasowym są pobierane z pojedynczej probówki komórek. Etapy mycia po impulsie są pomijane; zamiast tego dalszemu włączaniu 35S zapobiega się przez rozcieńczanie z dużym nadmiarem nieznakowanej metioniny i cysteiny.
Przedstawione protokoły wykorzystują radioaktywną cysteinę i metioninę znakowaną 35S do śledzenia procesów zwijania białek komórkowych. Wszystkie operacje z odczynnikami promieniotwórczymi powinny być wykonywane przy użyciu odpowiednich środków ochronnych w celu zminimalizowania narażenia operatora i środowiska na promieniowanie promieniotwórcze i powinny być wykonywane w wyznaczonym laboratorium. Ponieważ technika znakowania impulsowego jest stosunkowo mało efektywna przy krótkich czasach impulsów (<15 min), mniej niż 1% początkowej ilości radioaktywności jest włączane do nowo zsyntetyzowanych białek. Po wzbogaceniu białka docelowego poprzez immunoprecypitację, próbka dla SDS-PAGE zawiera mniej niż 0,05% wyjściowej ilości radioaktywności.
Chociaż mieszanina znakowania metioniny i cysteiny 35S jest ustabilizowana, nastąpi pewien rozkład, w wyniku którego powstaną lotne związki radioaktywne. W celu ochrony badacza i aparatury należy podjąć pewne środki ostrożności. Badacz powinien zawsze przestrzegać lokalnych zasad bezpieczeństwa radiacyjnego i może nosić maskę pielęgniarską z węgla drzewnego, oprócz fartucha laboratoryjnego i (podwójnych) rękawiczek. Fiolki z metioniną 35S i cysteiną należy zawsze otwierać w dygestoriach lub pod miejscowym punktem aspiracji. Znanymi miejscami skażenia laboratoryjnego są wirówki, pipety, łaźnie wodne, inkubatory i wytrząsarki. Zanieczyszczenie tych obszarów jest redukowane poprzez stosowanie końcówek pipet z filtrem węglowym, probówek mikrowirówek z wymuszonym uszczelnieniem (patrz tabela materiałów), gąbek węglowych akwariowych w kąpielach wodnych, bibuły filtracyjnej z węgla drzewnego wklejonej w naczyniach impulsowych, osłony na węgiel drzewny w systemie aspiracji oraz umieszczania naczyń zawierających ziarna węgla drzewnego w inkubatorach i pojemnikach magazynowych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml safeseal</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>lodowaty kwas octowy</td></tr><tr><td>BAS Przechowywanie ekranu fosforowego 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR</td><td>films Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Normalne podłoża do hodowli komórkowych dla określonych linii komórkowych Podłoża</td></tr> do <tr><td>hodowli komórkowych, bez metioniny/cysteiny</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Taki sam skład pożywki, jak w przypadku normalnych pożywek hodowlanych, np. DMEM/MEM/RPMI, bez metioniny i cysteiny</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z węglem drzewnym</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem węglowym</td><td>Molekularne bioprodukty</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Osłona próżniowa z węglem drzewnym</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>do elektroforezy</td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Klasa biologii molekularnej, Zrób 500 mM zapasu, przechowuj w temperaturze -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Mieszanka do etykietowania białek</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Inne partie etykiet są dostępne w zależności od użytkowania:</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Sprzęt do suszenia żelu</td><td>Różne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła chromatograficzna klasy 3</td> do biologii molekularnej <td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Chusteczki Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delikatne chusteczki do zadań</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Klasa biologii molekularnej, Zrób 250 mM zapasów, przechowuj w -20</td></tr><tr><td>Sprzęt do odlewania/biegania miniżeli</td><td>Różne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>Klasa biologii molekularnej, Zrób 1M zapasów w 100% etanolu, przechowuj w -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Białko-A Sefaroza kulki szybkiego przepływu</td><td>GE opieka zdrowotna</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Zasada Trizma (Tris)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Tajfun IP Obrazowanie biomolekularne</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na probówki bez drutu 20 mm do kąpieli wodnej</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioaktywne znakowanie impulsami jest potężnym narzędziem do badania dojrzewania konformacyjnego, transportu do ich funkcjonalnej lokalizacji komórkowej oraz degradacji docelowych białek w żywych komórkach. Dzięki zastosowaniu krótkich (impulsowych) czasów znakowania radioaktywnego (<30 min) i ściśle kontrolowanych czasów pościgu, możliwe jest znakowanie tylko niewielkiej części całkowitej puli białka i śledzenie jej fałdowania. W połączeniu z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) i immunoprecypitacją przeciwciałami (specyficznymi dla konformacji), procesy fałdowania można badać bardzo szczegółowo. System ten został wykorzystany do analizy fałdowania białek o ogromnej zmienności właściwości, takich jak białka rozpuszczalne, jedno- i wieloprzebiegowe białka transbłonowe, silnie N- i O-glikozylowane białka oraz białka z rozległymi wiązaniami dwusiarczkowymi i bez nich. Metody pościgu impulsowego są podstawą badań kinetycznych nad szeregiem dodatkowych cech, w tym modyfikacjami ko- i potranslacyjnymi, oligomeryzacją i polimeryzacją, zasadniczo umożliwiając analizę białka od narodzin do śmierci. Badania pulsacyjne nad fałdowaniem białek są komplementarne z innymi biochemicznymi i biofizycznymi metodami badania białek in vitro, zapewniając zwiększoną rozdzielczość czasową i informacje fizjologiczne. Metody opisane w tym artykule można łatwo dostosować do badania fałdowania prawie każdego białka, które może ulegać ekspresji w systemach komórkowych ssaków lub owadów.

Fałdowanie i sekrecja gp120 HIV-1 w układzie adhezyjnym metodą pulse-chase przedstawiono na Rysunku 2. Żel nieredukujący (Cells NR na rysunku) obrazuje oksydacyjne fałdowanie gp120. Bezpośrednio po 5-minutowym znakowaniu impulsowym (0 min chase) gp120 występuje jako rozmyty prążek położony wyżej w żelu, a w miarę postępu okresu pogoni prążek ten przemieszcza się w dół żelu poprzez jeszcze bardziej rozmyte formy pośrednie fałdowania (IT), aż do momentu jego ku...

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Pościg za impulsem radioaktywnym przy użyciu metioniny i cysteiny znakowanej 35 S jest nadal jedyną metodą biochemiczną do badania biosyntezy białek w czasie w żywych komórkach. Biosynteza białek obejmuje zarówno translację, fałdowanie i składanie, jak i transport i degradację. Połączenie pościgu impulsów radioaktywnych z analizą modyfikacji białek ko- i potranslacyjnych, takich jak tworzenie wiązań dwusiarczkowych i acetylacja, zapewnia czuły i ilościowy test do badania wiary białka w czasie.Do tej procedury wymagane jest dobre skupienie i eksperymentalne obchodzenie się. Kluczowe znaczenie ma dobre przygotowanie, takie jak, radioaktywne miejsce pracy i jasny harmonogram. Ten film zapewnia wyraźny widok przez ramię protokołu pościgu za impulsami radioaktywnymi.Procedurę zademonstruje Hui Ying Yeoh, kandydatka na pHd z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wysiać transfekcję i wyhodować komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed pościgiem pulsacyjnym sprawdź swoje komórki pod mikroskopem.Następnie umyj naczynia dwoma mililitrami buforu do mycia. I dwa mililitry pożywki głodowej do komórek i umieść naczynia w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 15 minut. Upewnij się, że konfiguracja pościgu za pulsem jest prawidłowa.Przenieś naczynia na ruszty w łaźni wodnej, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że naczynia mają kontakt z wodą, ale nie unoszą się na wodzie. Następnie uruchom minutnik.Po 40 sekundach odessaj pożywkę głodową. Za pomocą mikropipety pobrać 600 mikrolitrów roztworu impulsowego. Dokładnie po minucie delikatnie dodaj roztwór impulsowy do środka naczynia.Powtórz ten proces usuwania pożywki głodowej i dodawania roztworu impulsowego do pozostałych naczyń w odstępach jednominutowych. Dokładnie po 11 minutach i dla wszystkich następnych potraw, zgodnie ze schematem pościgu impulsowego, z wyjątkiem próbki pościgu po minucie zerowej, dodaj dwa mililitry pożywki chase bezpośrednio do naczynia. Zassać pożywkę chase i zastąpić ją dwoma mililitrami świeżej pożywki.Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych potraw w odstępach jednominutowych. Gdy zegar wskaże dokładnie 16 minut, dodaj dwa mililitry pożywki chase bezpośrednio do naczynia chase zero minute, na wierzchu pożywki pulsacyjnej, aby zatrzymać etykietowanie. Natychmiast zassać pożywkę.Przełóż naczynie na schłodzoną aluminiową płytę i dodaj dwa mililitry lodowatego buforu zatrzymującego. Przenieś wszystkie inne szalki do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieść każdą szalkę pościgową z powrotem z inkubatora do łaźni wodnej na dwie minuty przed końcem każdego czasu pościgu.Dokładnie w czasie wycierania dla każdej potrawy odessać pożywkę i przenieść naczynie na schłodzoną aluminiową płytę. Dodaj dwa mililitry lodowatego buforu zatrzymującego. Pozostaw wszystkie naczynia na lodzie i zatrzymaj bufor, aż będzie czas na lizę komórek.Następnie odessać roztwór zatrzymujący i umyć wszystkie naczynia. Trzy w tym samym czasie z dwoma mililitrami lodowatego roztworu zatrzymującego. Całkowicie odessać roztwór zatrzymujący i dodać 600 mikrolitrów buforu do lizy do dwóch naczyń na raz.Za pomocą skrobaka do komórek dokładnie zeskrob powierzchnię naczynia, ale delikatnie, aby wymieszać lizat. Przenieś lizat z każdego naczynia do świeżej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Wirować w temperaturze od 15 000 do 20 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby uzyskać granulki jąder.Do pościgu impulsowego na komórkach zawiesinowych zbieraj pięć milionów komórek na punkt czasowy w jednej 50-mililitrowej probówce. Wykonaj procedurę głodzenia zgodnie z opisem w tekście. Po procedurze głodzenia w łaźni wodnej przez 15 minut uruchom minutnik.Dokładnie po jednej minucie dodać 275 mikrokiurów nierozcieńczonej etykiety bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i zamieszać do wymieszania. Dokładnie po 11 minutach dodaj cztery mililitry pożywki chase, aby zatrzymać etykietowanie. I natychmiast przenieś jeden mililitr do 15-mililitrowej probówki na lodzie, która zawiera dziewięć mililitrów lodowatego roztworu zatrzymującego, aby zatrzymać etykietowanie.Powtórz ten proces przenoszenia jednego mililitra pościgu do probówki na lodzie zawierającej dziewięć mililitrów roztworu zatrzymującego dla każdego kolejnego punktu czasowego pościgu. Po immunoprecypitacji całkowicie odessać ostatnie pranie. Ponownie zawiesić kulki w 20 mikrolitrach buforu TE i wiru.Dodać 20 mikrolitrów dwóch X buforu do próbek bez środka redukującego. Zwiruj próbki, a następnie podgrzej je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zwirować próbki.Wirować w temperaturze pokojowej 12 000 razy G przez jedną minutę. Przenieść 19 mikrolitrów niezredukowanego supernatantu do świeżej probówki do mikrowirówki, która zawiera jeden mikrolitr 500 milimolowych DDT. W razie potrzeby szybko odwirować próbkę, tak aby wszystkie płyny znalazły się na dnie.I podgrzewać w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pozwól, aby zredukowana próbka ostygła, a następnie wiruj. Odwirować zarówno zredukowane, jak i niezredukowane próbki w temperaturze 12 000 razy G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, a następnie dodać 1,1 mikrolitra jednego molowego NEM do wszystkich próbek.W tym badaniu zastosowano podejście goniące impuls radioaktywny do analizy fałdowania i transportu białek w nienaruszonych komórkach. Zwijanie i wydzielanie się wirusa HIV jednym GP120 z przylegającego pościgu pulsacyjnego pokazane zostało tutaj. Żel nieredukujący wykazuje oksydacyjne fałdowanie GP120.Natychmiast po znakowaniu impulsu pojawia się jako pasmo dyfuzyjne wyżej w żelu. W miarę postępu pościgu opaska migruje w dół żelu przez jeszcze bardziej rozproszone pośrednie fałdy, aż zgromadzi się w ciasnym paśmie, który reprezentuje natywnie pofałdowany w GP120. Dzieje się tak, ponieważ tworzenie wiązań dwusiarczkowych zwiększa zwartość białka, powodując jego szybszą migrację niż w pełni zredukowane białko.Na żelu redukującym wiązania dwusiarczkowe i wszystkie cząsteczki zostały zredukowane i nie wpływają na ruchliwość. W związku z tym różnice w ruchliwości są jedynie wynikiem zmian masy cząsteczkowej. Przesunięcie w czasie od zredukowanej formy rozszczepionego peptydu sygnałowego do postaci rozszczepionej peptydu o zredukowanym sygnale reprezentuje potranslacyjne rozszczepienie peptydu sygnałowego GP120.Ruchliwość wzrasta z powodu utraty peptydu sygnałowego, który zwiększa się podczas pościgu, gdy więcej białek osiąga natywne fałd i traci peptyd sygnałowy. Zarówno w przypadku żelu nieredukującego, jak i redukującego, sygnał zaczyna słabnąć od około jednej godziny z powodu wydzielania GP120. Można to monitorować, analizując media.Metoda ta ma zastosowanie do każdej linii komórkowej, w tym modeli komórek organoidowych. Ale sukces w dużej mierze zależy od poziomu ekspresji białka, które nas interesuje. Przed rozpoczęciem tej procedury zaznacz swoje potrawy i utrzymuj tę kolejność przez cały eksperyment.Upewnij się, że wszystko jest przygotowane przed dodaniem pożywki głodowej. To jest początek eksperymentu. A czas spędzony w laboratorium jest twoim przyjacielem, ale może być twoim największym wrogiem, gdy nie jesteś przygotowany.Pogoń Billa może być połączona z ograniczoną proteolizą, aby zbadać pełny stan białek w czasie. Również różne metody wyboru zamrażarek pozwolą na analizę różnic w płukaniu lub rygormoryzacji lub wsadach. Aby chronić badacza i aparaturę, muszą być przestrzegane wszystkie lokalne zasady bezpieczeństwa radiacyjnego.A środki ochronne należy podjąć zgodnie z protokołem. Zauważ, że twój akrylamid, używany na twojej stronie STH, jest neurotoksyczny.

analysis-protein-folding-transport-degradation-living-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Ten film opisuje test mikropłytek in vitro oparty na fluorescencji w celu zbadania kinetyki degradacji znakowanego fluorescencyjnie, nieprawidłowo sfałdowanego zmutowanego białka lucyferazy, ulegającego ekspresji w jądrach transfekowanych komórek ssaków. Test polega na traktowaniu komórek eksprymujących zmutowane białko fluorescencyjne za pomocą inhibitora translacji i inhibitora proteasomu w celu oceny degradacji nieprawidłowo sfałdowanego białka za pośrednictwem proteasomu.

Test pościgowy cykloheksymidu oparty na mikropłytkach fluorescencyjnych: technika monitorowania kinetyki degradacji fluorescencyjnych nieprawidłowo sfałdowanych białek jądrowych

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Poznaj metodę pościgu impulsów radioaktywnych do analizy fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie kinetyki biosyntezy białek z wykorzystaniem 35S-metyoniny.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Przeglądaj więcej filmów