Name: Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania z bardzo długim odczytem DNA przy użyciu platformy nanopore. Technika ta poprawia montaż genomu i analizę wariacji strukturalnych, umożliwiając zastosowania w precyzyjnej medycynie klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Y. Zhu za jej komentarze do manuskryptu. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA034196. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+at+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation%3A+insights+from+and+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li>
<li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+reads%3A+their+purpose+and+place%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li>
<li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326(2017).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li>
<li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li>
<li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+decades+of+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li>
<li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxford+Nanopore+MinION%3A+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239(2016).</li>
<li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+view+on+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287(2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimap2%3A+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li>
<li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPack%3A+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li>
<li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615(2013).</li>
<li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+%28CATCH%29+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+%28CATCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zasadniczo sekwencjonowanie nanoporowe jest w stanie wygenerować odczyty od 100 kb do megabazy o długości 11,12,13. Cztery główne czynniki będą miały wpływ na wydajność sekwencjonowania i jakość danych: 1) liczba aktywnych porów i aktywność porów; 2) białko motoryczne, które kontroluje prędkość DNA przechodzącego przez nanopory; 3) Matryca DNA (długość, czystość, jakość, masa); 4) skuteczność ligacji adaptera sekwencjonowania, która określa użyteczne DNA z próbki wejściowej. Pierwsze dwa czynniki zależą od wersji celi przepływowej i zestawu do sekwencjonowania dostarczonego przez producenta. Pozostałe dwa czynniki są krytycznymi etapami tego protokołu (ekstrakcja DNA HMW, ścinanie i ligacja).
Ten protokół wymaga cierpliwości i praktyki. Jakość DNA HMW jest ważna dla ultradługich bibliotek DNA6. Protokół rozpoczyna się od komórek pobranych z wysoką żywotnością (preferowana >85% żywotna komórka), co ogranicza degradację DNA z martwych komórek. Należy unikać wszelkich trudnych procesów, które mogą spowodować uszkodzenie DNA (np. silne zakłócenia, wstrząsy, wiry, wielokrotne pipetowanie, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie). W projekcie protokołu pomijamy pipetowanie w całym procesie ekstrakcji DNA. Końcówki o szerokim otworze muszą być używane, gdy pipetowanie jest konieczne po mechanicznym ścinaniu podczas budowy biblioteki i sekwencjonowania. Ponieważ nanopory są wrażliwe na substancje chemiczne w buforzekomory 12, w DNA powinno być jak najmniej zanieczyszczeń resztkowych (np. detergentów, środków powierzchniowo czynnych, fenolu, etanolu, białek RNA itp.). Biorąc pod uwagę długość i wydajność, metoda ekstrakcji fenolem daje najlepsze i najbardziej powtarzalne wyniki w porównaniu z wieloma różnymi testowanymi do tej pory metodami ekstrakcji.
Pomimo zdolności tego protokołu do tworzenia długich sekwencji odczytu, nadal pozostaje kilka ograniczeń. Po pierwsze, protokół ten został zoptymalizowany w oparciu o urządzenie do sekwencjonowania nanoporowego dostępne w momencie publikacji; W związku z tym jest ograniczony do selektywnej chemii sekwencjonowania opartej na nanoporach i może być nieoptymalny, gdy jest wykonywany w innych typach urządzeń do sekwencjonowania z długim odczytem. Po drugie, wynik w dużym stopniu zależy od jakości DNA wyekstrahowanego z materiału wyjściowego (tkanek lub komórek). Długość odczytu będzie zagrożona, jeśli początkowe DNA jest już zdegradowane lub uszkodzone. Po trzecie, chociaż w protokole uwzględniono wiele etapów kontroli jakości DNA w celu sprawdzenia jakości DNA, na ostateczną wydajność i długość odczytów może mieć wpływ aktywność komórki przepływowej i porów, która może być zmienna na tym wczesnym etapie rozwoju platformy sekwencjonowania nanoporowego.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje próbki ludzkiej zawiesiny linii komórkowej do ekstrakcji DNA. Zoptymalizowaliśmy czasy przejścia podczas strzyżenia igły, stosunek DNA HMW do transpozazy oraz czas ligacji, aby uzyskać opisane wyniki. Protokół można rozbudować na cztery sposoby. Po pierwsze, użytkownicy mogą zacząć od innych hodowanych komórek ssaków i z różną ilością komórek, tkanek, próbek klinicznych lub innych organizmów. Konieczna będzie dalsza optymalizacja czasu inkubacji lizy, objętości reakcji i wirowania. Po drugie, trudno jest przewidzieć docelowy rozmiar dla bardzo długiego sekwencjonowania odczytu. Jeśli długości odczytu są krótsze niż oczekiwano, użytkownicy mogą dostosować czasy przejścia w metodzie mechanicznego opartej na ścinaniu lub zmienić stosunek DNA HMW do transpozazy w metodzie opartej na fragmentacji transpozy. Dłuższy czas wiązania i elucji podczas etapów oczyszczania jest pomocny, ponieważ DNA HMW jest bardzo lepkie. Po trzecie, za pomocą różnych urządzeń do sekwencjonowania nanoporowego można dostosować ilość i objętość DNA, aby spełnić kryteria sekwencera. Po czwarte, sekwencjonowane będzie tylko to DNA, które zostało zligowane za pomocą adapterów do sekwencjonowania. Aby jeszcze bardziej poprawić skuteczność ligacji, można spróbować miareczkować stężenie adaptera i ligazy. W przyszłości można zastosować zmodyfikowany czas ligacji i molekularne środki tłumiące, takie jak PEG18. Ultradługi protokół sekwencjonowania DNA w połączeniu z CRISPR19,20 może stanowić skuteczne narzędzie do sekwencjonowania wzbogacającego cel.

W ciągu ostatniej dekady, masowo równoległe i bardzo dokładne technologie sekwencjonowania drugiej generacji o wysokiej przepustowości doprowadziły do eksplozji odkryć biomedycznych i innowacji technologicznych1,2,3. Pomimo postępu technicznego, dane o krótkim odczycie generowane przez platformy drugiej generacji są nieskuteczne w rozwiązywaniu złożonych regionów genomu i są ograniczone w wykrywaniu wariantów strukturalnych genomu (SV), które odgrywają ważną rolę w ewolucji człowieka i chorobach4,5. Co więcej, dane o krótkim odczycie nie są w stanie rozpoznać powtarzającej się zmienności i nie nadają się do rozróżniania faz haplotypów wariantów genetycznych6.
Niedawny postęp w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek oferuje znacznie dłuższy czas odczytu, co może ułatwić wykrycie pełnego spektrum SVs7,8,9, i oferuje dokładne i kompletne składanie złożonych genomów mikroorganizmów i ssaków6,10. Platforma nanoporowa przeprowadza sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek poprzez bezpośredni pomiar zmian prądu, w których pośredniczy przejście DNA przez pory11,12,13. W przeciwieństwie do jakiejkolwiek istniejącej chemii sekwencjonowania DNA, sekwencjonowanie nanoporowe może generować długie (dziesiątki do tysięcy kilozasad) odczyty w czasie rzeczywistym bez polegania na kinetyce polimerazy lub sztucznej amplifikacji próbki DNA. W związku z tym sekwencjonowanie nanoporowe z długim odczytem (NLR-seq) jest bardzo obiecujące w generowaniu ultradługich odczytów znacznie przekraczających 100 kb, co znacznie posunęłoby naprzód analizy genomiczne i biomedyczne14, szczególnie w regionach genomów o niskiej złożoności lub bogatych w powtórzenia15.
Unikalną cechą sekwencjonowania nanoporowego jest jego potencjał do generowania długich odczytów bez teoretycznego ograniczenia długości. W związku z tym długość odczytu zależy od fizycznej długości DNA, na którą bezpośredni wpływ ma integralność DNA i jakość matrycy sekwencjonowania. Ponadto, w zależności od zakresu manipulacji i liczby etapów, takich jak siły pipetowania i warunki ekstrakcji, jakość DNA jest bardzo zróżnicowana. W związku z tym trudno jest uzyskać długie odczyty, stosując tylko standardowe protokoły ekstrakcji DNA i metody budowy biblioteki dostarczone przez producenta. W tym celu opracowaliśmy solidną metodę generowania danych sekwencjonowania o bardzo długim odczycie (setki kilozasad), zaczynając od zebranych granulek komórkowych. Przyjęliśmy wiele ulepszeń w procedurach ekstrakcji DNA i przygotowania biblioteki. Uprościliśmy protokół, aby wykluczyć niepotrzebne procedury, które powodują degradację i uszkodzenia DNA. Protokół ten składa się z ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), budowy ultradługiej biblioteki DNA i sekwencjonowania na platformie nanoporowej. Dobrze wyszkolonemu biologowi molekularnemu zajmuje to zazwyczaj 6 godzin od pobrania komórek do zakończenia ekstrakcji DNA HMW, 90 minut lub 8 godzin na budowę biblioteki w zależności od metody ścinania i do kolejnych 48 godzin na sekwencjonowanie DNA. Wykorzystanie protokołu umożliwi społeczności genomicznej lepsze zrozumienie złożoności genomu i uzyskanie nowego wglądu w zmienność genomu w chorobach ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPbeads Kulki</td> magnetyczne <td>Beckman</td><td>A63881</td><td>do czyszczenia</td></tr><tr><td>Konwencjonalne igły BD</td><td>Becton Dickinson</td><td>305136</td><td>27G, do mechanicznego ścinania</td></tr><tr><td>Strzykawka BD Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>do mechanicznego ścinania</td></tr><tr><td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S Szkiełka</td><td></td></tr><tr><td>z komorą do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>pH 8,0, 0,5 m, 500 mL</td></tr><tr><td>Flow Cell</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106</td><td>R9.4.1</td></tr><tr><td>HG00773 ogniwa</td><td>Coriell Instytut</td><td>HG00733</td><td>komórek użytych w tym protokole</td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania ligacji 1D</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK108</td><td>Zestaw do ligacji nanoporowej</td></tr><tr><td>Probówki MaXtract o wysokiej gęstości Probówki</td><td>żelowe Qiagen</td><td>129073</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>NEB</td><td>M6630S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td><td>NEB</td><td>M7546S</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Gibco 70011044</td><td></td><td>10X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:IAA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>20 mg / ml</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA BR</td> Testy fluorometryczne <td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego sekwencjonowania</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RAD004</td> zestaw <td>do transpozazy nanoporowej</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td>10% (wt/vol)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9759</td><td>5,0 M</td></tr><tr><td>bufor TE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td>pH 8,0, 1 M</td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>~10%</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td><td>Wirówka Bio-Rad</td><td>1851196EDU</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22628180</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Technologie żywotności</td><td>AMQAF1000</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Stojak magnetyczny</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>do inkubacji</td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td>LabRepCo</td><td>LHP-5-UFMB</td><td></td></tr><tr><td>GridION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td> Urządzenie nanoporowe <td>GridION X5</td><td>używane w tym protokole</td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek HulaMixer</td><td>Mieszalnik rotatorów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Benchmark Scientific</td> Spektrofotometr <td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>do odczytu UV</td></tr><tr><td>Pippin Pulse</td><td>Sage Science</td><td>PPI0200</td><td>żelowy przyrząd do elektroforezy w polu pulsacyjnym</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 3.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>fluorometr</td></tr><tr><td></td><td>Lodówka LabRepCo</td><td>LABHP-5-URBSS</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>Numer katalogowy: 89501-464</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu dna

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Technologie sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek DNA trzeciej generacji oferują znacznie dłuższy czas odczytu, co może ułatwić składanie złożonych genomów i analizę złożonych wariantów strukturalnych. Platformy nanoporowe wykonują sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek poprzez bezpośredni pomiar zmian prądu, w których pośredniczy przejście DNA przez pory i mogą generować setki odczytów kilozasad (kb) przy minimalnych kosztach kapitałowych. Platforma ta została przyjęta przez wielu badaczy do różnych zastosowań. Osiągnięcie dłuższych długości odczytu sekwencjonowania jest najważniejszym czynnikiem pozwalającym na wykorzystanie wartości platform sekwencjonowania nanoporowego. Aby wygenerować bardzo długie odczyty, należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby uniknąć pęknięć DNA i zwiększyć wydajność generowania produktywnych matryc sekwencjonowania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół sekwencjonowania ultradługiego DNA, w tym ekstrakcję DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) ze świeżych lub zamrożonych komórek, budowę biblioteki poprzez mechaniczne ścinanie lub fragmentację transpozazy oraz sekwencjonowanie na urządzeniu nanoporowym. Od 20-25 μg DNA HMW, metoda może osiągnąć długość odczytu N50 50-70 kb przy mechanicznym ścinaniu i N50 o długości odczytu 90-100 kb z fragmentacją za pośrednictwem transpozazy. Protokół można zastosować do DNA wyekstrahowanego z komórek ssaków w celu przeprowadzenia sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia wariantów strukturalnych i złożenia genomu. Dodatkowe ulepszenia w zakresie ekstrakcji DNA i reakcji enzymatycznych jeszcze bardziej zwiększą długość odczytu i rozszerzą jego użyteczność.

Protokół sekwencjonowania ultra-długiego DNA wykorzystuje HMW DNA do konstrukcji biblioteki. Dlatego w kroku zbierania komórek krytyczne jest wybranie dobrze hodowanych komórek z odsetkiem żywych komórek &gt;85%. Liczba komórek użytych do ekstrakcji DNA wpłynie na jakość i ilość HMW DNA. Liza komórek nie przebiega prawidłowo, jeśli proces rozpocznie się od zbyt dużej liczby komórek. Zastosowanie zbyt małej liczby komórek nie pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości DNA do konstrukcji biblioteki, ponieważ wytrącanie HMW DNA odbywa się poprzez delikatne obracanie ręczne, a nie wirowanie przy wysokich prędkościach. Przykład HMW DNA po dodaniu lodowatego 100% etanolu i obracaniu przedstawiono jako biały, przypominający watę osad na Rysunku 2.
Przed rozpoczęciem konstrukcji biblioteki ważne jest sprawdzenie jakości wejściowego DNA. Degradacja, nieprawidłowe ilościowe oznaczenie, zanieczyszczenia (np. białka, RNA, detergenty, surfaktanty oraz pozostałości fenolu lub etanolu) oraz DNA o niskiej masie cząsteczkowej mogą mieć istotny wpływ na kolejne procedury i końcową długość odczytu. Zalecamy przeprowadzenie analizy kontroli jakości (QC) z wykorzystaniem DNA pobranego z trzech różnych miejsc w probówce zawierającej HMW DNA. Z wyników pomiarów UV dla HMW DNA wynika, że wartość OD260/OD280 wynosi około 1,9, a wartość OD260/OD230 wynosi około 2,3 (Rycina 3A,B). W przypadku dobrej próbki HMW DNA wartości tych stosunków są spójne we wszystkich trzech testach. Różne metody fragmentacji wymagają różnych objętości wejściowego DNA. Stężenie HMW DNA musi być &gt;200 ng/µL w przypadku fragmentacji mechanicznej, natomiast &gt;1 µg/µL w przypadku fragmentacji za pomocą transpozazy. Stężenie wykryte za pomocą fluorometru jest nieco niższe niż w pomiarze UV. Niemniej jednak współczynnik zmienności stężenia tej samej próbki HMW DNA powinien być mniejszy niż 15% zarówno w analizie fluorometrycznej, jak i w pomiarze UV. Fragmentacja mechaniczna wykorzystuje strzykawkę z igłą do rozrywania HMW DNA, zatem liczba przejść przez igłę wpływa na rozmiar pofragmentowanego DNA i końcową długość odczytu. Zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości rozmiaru po fragmentacji igłą, aby upewnić się, że większość HMW DNA ma rozmiar większy niż 50 kb, co zilustrowano na Rycini 4. W metodzie fragmentacji mechanicznej 30 przejść dało najlepsze wyniki sekwencjonowania, biorąc pod uwagę zarówno długość, jak i wydajność.
Wartość N50 biblioteki przygotowanej metodą mechanicznego ścinania wynosi 50-70 kb, natomiast biblioteki przygotowanej metodą fragmentacji za pomocą transpozazy wynosi 90-100 kb. Wyniki czterech przebiegów z wykorzystaniem linii komórkowej HG00733 przedstawiono w Tabeli 1. We wszystkich czterech przebiegach uzyskano ponad 2300 odczytów o długości przekraczającej 100 kb. Maksymalna długość jest większa w bibliotekach przygotowanych metodą fragmentacji za pomocą transpozazy (455 kb i 489 kb) w porównaniu z bibliotekami przygotowanymi metodą mechanicznego ścinania (348 kb i 387 kb), podczas gdy te ostatnie wygenerowały więcej odczytów całkowitych, co wskazuje na wyższą wydajność. Konstrukcja biblioteki metodą fragmentacji za pomocą transpozazy obejmuje mniej etapów i wymaga krótszego czasu przygotowania, dzięki czemu powstaje mniej krótkich fragmentów. Dwa przebiegi z wykorzystaniem transpozazy charakteryzowały się dłuższą średnią długością (&gt;30 kb) i medianą długości (&gt;10 kb). Ponadto dane wykazują spójną, wysoką jakość we wszystkich przebiegach (średni wynik jakości wynosi około 10,0, co odpowiada ok. 90% dokładności zasad). Ponad 97% wszystkich zasad zostało dopasowanych do ludzkiego genomu referencyjnego (hg19) przy użyciu programu Minimap216 z ustawieniami domyślnymi. Oczekiwane rozkłady wielkości surowych odczytów przedstawiono na Rysunku 5. We wszystkich przebiegach duża część danych przekracza 50 kb, natomiast biblioteki przygotowane metodą fragmentacji za pomocą transpozazy mają wyższy stosunek odczytów ultradługich (np. &gt; 100 kb). Niniejszy protokół został z powodzeniem zastosowany w wielu ludzkich liniach komórkowych (Tabela uzupełniająca 1).
<img alt="Schemat procesu sekwencjonowania DNA: ekstrakcja, fragmentacja, ligacja adapterów, etapy sekwencjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd przepływu pracy sekwencjonowania długich odczytów nanoporowych (NLR-seq). Kolor pomarańczowy: kompleks transpozazy. Kolor żółto-zielony: adapter nanoporowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces wirowania, rozdzielanie cieczy, probówka laboratoryjna, gradient gęstości, strzałka wskazująca prążek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wytrącanie DNA w metodzie ekstrakcji fenol-chloroformowej. Biała strzałka wskazuje HMW DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy ilościowego oznaczania DNA; analiza spektroskopowa, dane o stężeniu, piki absorbancji, tabele próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykład wyników kontroli jakości HMW DNA na podstawie pomiarów UV. (A) HMW DNA z etapu 1.21.1 gotowe do konstrukcji biblioteki opartej na mechanicznym ścinaniu. (B) HMW DNA z etapu 1.21.2 do konstrukcji biblioteki opartej na fragmentacji za pomocą transpozazy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział DNA z markerami 15 Kb i 48,5 Kb; analiza molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki kontroli jakości (QC) HMW DNA poddanego ścinaniu igłowym za pomocą elektroforezy w polu pulsującym. L1: drabinka DNA Quick-load 1 kb; L2: rozszerzona drabinka DNA Quick-load 1 kb. 1-8: DNA o różnych czasach przejścia przez igłę podczas ścinania. 1-3, brak ścinania; 4, 10 razy; 5, 20 razy; 6, 30 razy; 7, 40 razy; 8, 50 razy. Ten etap kontroli jakości jest opcjonalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy procentowego udziału zasad DNA, długość (Kb) względem procenta względnego, analiza danych eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Oczekiwane rozkłady rozmiarów bibliotek ultra-długiego DNA do sekwencjonowania nanoporowego. MS, biblioteki otrzymane w drodze mechanicznego ścinania. TF, biblioteki otrzymane poprzez fragmentację za pomocą transpozazy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td >Mechaniczne ścinanie_rep1</td>
			<td >Mechaniczne ścinanie_rep2</td>
			<td >Fragmentacja transpozazą_rep1</td>
			<td >Fragmentacja transpozazą_rep2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Linia komórkowa</td >
			<td >HG00733</td >
			<td >HG00733</td >
			<td >HG00733</td >
			<td >HG00733</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >N50 odczytów</td >
			<td >55,180</td >
			<td >63,007</td >
			<td >98,237</td >
			<td >95,629</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Liczba odczytów dłuższych niż 100 Kb</td >
			<td >2,500</td >
			<td >3,082</td >
			<td >2,386</td >
			<td >2,355</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Całkowita liczba odczytów</td >
			<td >97,859</td >
			<td >80,465</td >
			<td >24,166</td >
			<td >21,032</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Maksymalna długość (bp)</td >
			<td >348,482</td >
			<td >387,113</td >
			<td >454,660</td >
			<td >489,426</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średnia długość (bp)</td >
			<td >17,861</td >
			<td >20,395</td >
			<td >33,528</td >
			<td >38,175</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mediana długości (bp)</td >
			<td >5,335</td >
			<td >5,894</td >
			<td >10,249</td >
			<td >15,656</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średnia jakość odczytów</td >
			<td >10.0</td >
			<td >10.1</td >
			<td >9.9</td >
			<td >10.0</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Całkowita liczba zasad w surowych odczytach</td >
			<td >1,747,849,822</td >
			<td >1,641,058,932</td >
			<td >810,229,733</td >
			<td >802,886,304</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Całkowita liczba zasad w dopasowanych odczytach</td >
			<td >1,693,300,832</td >
			<td >1,607,975,925</td >
			<td >791,422,077</td >
			<td >778,417,627</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Stosunek mapowania całkowitej liczby zasad (hg19, Minimap2)</td >
			<td >96.9%</td >
			<td >98.0%</td >
			<td >97.7%</td >
			<td >97.0%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Liczba aktywnych porów</td >
			<td >1225: 480, 402, 254, 89</td >
			<td >1058: 480, 356, 176, 46</td >
			<td >958: 452, 328, 148, 30</td >
			<td >1092: 487, 367, 195, 43</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Podsumowanie wskaźników wydajności z serii pomiarowych z zastosowaniem różnych protokołów ścinania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Biblioteka 1</td>
			<td>Biblioteka 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linia komórkowa</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Informacje dotyczące zamawiania komórek</td>
			<td>ATCC, nr kat. CCL-243</td>
			<td>Coriell Institute, nr kat. GM19240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protokół</td>
			<td>ścinanie mechaniczne</td>
			<td>ścinanie mechaniczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wartość N50 odczytów</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba odczytów</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość mediana (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia długość (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna długość (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba zasad surowych odczytów</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba zasad zmapowanych odczytów</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zmapowany stosunek całkowitej liczby zasad (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96.6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba aktywnych porów</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie dwóch przebiegów NLR-seq z wykorzystaniem innych linii komórkowych przy zastosowaniu protokołu ścinania mechanicznego.

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Protokół ten wypełnia techniczną lukę w naszej zdolności do generowania ultradługich układów sekwencji. Pozwala nam to badać złożoność genomu, która jest ograniczona przez obecne podejścia oparte na krótkim odczycie w genomice. Metoda ta jest wyjątkowa pod względem wydajności, solidności, wszechstronności i potencjału integracji z obiecującymi nowymi aplikacjami.Ma zastosowanie do różnych materiałów i może być modulowany dla różnych natychmiastowych rozmiarów. Technika ta zaczęła rewolucjonizować krajobraz kliniczny. Jego przydatność diagnostyczna w powtarzających się zaburzeniach ekspansji przezwyciężyła wiele obecnych niedociągnięć.Niektóre rejestry transplantacyjne wykorzystują typowanie HLA o wysokiej rozdzielczości w celu uzyskania lepszych wyników klinicznych. Metody te dostarczają wcześniej niedostępnych informacji dalekiego zasięgu, takich jak fazy i złożona wariancja strukturalna. W połączeniu z odczytem epigenetycznym w jednym teście, umożliwi to medycynę precyzyjną.Jest to długi protokół z wieloma nowymi technikami i trudno jest stwierdzić, czy działa, dopóki nie zostanie zakończone końcowe sekwencjonowanie. Zalecam przećwiczenie ładowania na starych komórkach przepływowych przed uruchomieniem próbek. Współpracownicy stwierdzili, że niektóre techniki są mylące w porównaniu z podejściami opartymi na krótkim odczycie.W szczególności ekstrakcja jest łagodniejsza ze względu na wysokiej jakości DNA o dużej masie cząsteczkowej. Aby rozpocząć ekstrakcję DNA HMW, najpierw dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 10 mililitrów buforu do lizy w 50-mililitrowej probówce. Następnie wiruj z najwyższą prędkością przez trzy sekundy.I inkubować roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Pod koniec inkubacji dodać dwa mikrolitry RNS-A do lizatu. Delikatnie obróć probówkę o pojemności 50 mililitrów, aby wymieszać próbkę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji dodać do lizatu 10 mililitrów warstwy fenolowej mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego. I umieść rurkę na rotatorze przy 20 obr./min na 10 minut pod wyciągiem. Po odwirowaniu za pomocą probówek żelowych ostrożnie wlej supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki.Następnie dodaj 25 mililitrów lodowatego 100% etanolu i delikatnie obracaj rurkę ręcznie, aż DNA się wytrąci. Zegnij końcówkę o pojemności 20 mikrolitrów, aby zrobić haczyk. Za pomocą haczyka ostrożnie wyjmij DNA HMW i pozwól, aby płyn opadł.Następnie umieść DNA w 50-mililitrowej probówce zawierającej 40 mililitrów 70% etanolu i delikatnie odwróć probówkę trzy razy, aby umyć DNA. Aby przygotować bibliotekę opartą na mechanicznym ścinaniu, najpierw użyj 100-mililitrowej strzykawki bezigłowej, aby pobrać całe DNA. Następnie umieść igłę o rozmiarze 27 na strzykawce i delikatnie i powoli wyrzuć całe DNA do naczynia.Powtórz 29 razy. Następnie dodaj 143 mikrolitry ponownie zawieszonych kulek magnetycznych i 143 mikrolitry mieszaniny reakcji naprawy DNA do probówki. Przesuń probówkę sześć razy, aby delikatnie wymieszać, i umieść probówkę na rotatorze z prędkością 20 obr./min na 30 minut.Odwiruj probówkę o sile 1000 G przez dwie sekundy w temperaturze pokojowej, aby odwirować próbkę, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 10 minut. Następnie wyrzuć supernatant, gdy probówka nadal znajduje się na stojaku. Dodaj 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu.Poczekaj 30 sekund. A następnie usuń etanol. Następnie odwiruj probówkę o sile 1000 G przez dwie sekundy w temperaturze pokojowej, aby odwirować próbkę.Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i usuń resztki etanolu. Suszyć pelety na powietrzu przez 30 sekund. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 103 mikrolitry buforu TE.Następnie delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że koraliki są pokryte buforem i umieść rurkę na rotatorze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Na koniec umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym na 10 minut, aby granulować koraliki. Użyj końcówki o szerokim otworze P200, aby przenieść 100 mikrolitrów eluatu do probówki o pojemności 0,2 mililitra i przystąp do reakcji naprawy końcowej dA-tailing i ligacji adaptera.Aby przygotować bibliotekę opartą na fragmentacji transpozazy, najpierw przeprowadź reakcję znakowania DNA, dodając 22 mikrolitry DNA HMW, jeden mikrolitr 10 milimolowych Triss o pH 8 z 0,02% Triton X-100 i 1 mikrolitr mieszanki fragmentacyjnej do probówki o pojemności 0,2 mililitra. Następnie użyj końcówki o szerokim otworze P200, aby wymieszać reakcję sześć razy i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Trzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na koniec użyj końcówki o szerokim otworze P200, aby przenieść reakcję do rurki o pojemności 1,5 mililitra i szybko dodaj 1 mikrolitr mieszanki szybkozłącznej. Użyj końcówki o szerokim otworze P200, aby wymieszać reakcję sześć razy. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez godzinę i przystąpić do sekwencjonowania.Aby rozpocząć sekwencjonowanie, najpierw włóż nową komórkę przepływową do jednego z kanałów urządzenia Nanopore. Następnie, w dołączonym oprogramowaniu do sterowania sekwencjonowaniem, zaznacz pole lokalizacji komory przepływowej. Wybierz odpowiedni typ komórki przepływu i kliknij przepływ pracy komórki przepływu kontrolnego.Kliknij przycisk rozpocznij test, aby rozpocząć analizę jakości w komorze przepływowej. Następnie, za pomocą pipety P1000 ustawionej na 100 mikrolitrów, cofnij mniej niż 30 mikrolitrów buforu, aby usunąć pęcherzyki z komory przepływowej. Dodaj 30 mikrolitrów mieszanki gruntującej, aby przykryć górną część portu zalewowego, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.Następnie odpipetować 800 mikrolitrów mieszanki zalewającej do portu zasysającego, aby załadować komórkę przepływową. Wyjmij końcówkę, gdy pozostało około 50 mikrolitrów mieszanki gruntującej i dodaj resztę mieszanki gruntującej na górze portu zalewowego. Następnie za pomocą pipety P1000 dodaj 200 mikrolitrów mieszanki gruntującej do komory przepływowej.Następnie, tuż przed załadowaniem, użyj pipety P200 ustawionej na 80 mikrolitrów, aby sześciokrotnie pipetować w górę iw dół biblioteki DNA. Na koniec załaduj miks biblioteczny kroplami do komórki przepływowej przez port próbki i przystąp do sekwencjonowania i analizy danych. Analiza QC DNA gotowego do mechanicznej budowy biblioteki opartej na ścinaniu wykazała, że stosunek czystości 260 do 280 wynosi około 1,9, a stosunek 260 do 230 wynosi około 2,3, co pokazuje dobrą próbkę DNA.Ten sam wynik zaobserwowano przy użyciu konstrukcji biblioteki opartej na fragmentacji DNA gotowej do transpozy. Kontrola jakości DNA HMW ścinanego igłą za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym wykazała, że większość DNA HMW była większa niż 50 kilozasad. Wyniki czterech prób z wykorzystaniem komórki HG00733 wykazały, że N50 biblioteki opartej na mechanicznym ścinaniu była krótsza niż biblioteka oparta na fragmentacji transporazy.Ponadto wszystkie cztery serie miały ponad 2300 odczytów o długości dłuższej niż 100 kilobaz. Maksymalna długość była dłuższa w bibliotekach opartych na fragmentacji transpozazy ze względu na krótszy czas przygotowania w porównaniu z bibliotekami opartymi na mechanicznym ścinaniu. Biblioteki oparte na mechanicznym ścinaniu wygenerowały więcej całkowitych odczytów w porównaniu z bibliotekami opartymi na fragmentacji transpozazy, co wskazuje na wyższą wydajność.Obie biblioteki wykazały się niezmiennie wysoką jakością, a ponad 97% ich całkowitych zasad było zgodnych z ludzkim genomem referencyjnym. Oczekiwane rozkłady rozmiarów pokazały, że wszystkie cztery serie miały duży odsetek danych powyżej 50 kilobaz, podczas gdy biblioteki oparte na fragmentacji transpozazy miały wyższy współczynnik ultradługich odczytów. Ogólnym celem jest utrzymanie DNA w stanie nienaruszonym, dlatego ważne jest, aby unikać ostrego obchodzenia się z DNA.Kluczowym czynnikiem, który może zmaksymalizować wartość metody, jest analiza obliczeniowa. Nasz zespół opracował potok analizy o nazwie PICKY, który może wykrywać pełen zakres SV z wysoką czułością. Otworzy to nowe możliwości w ekscytujących obszarach, takich jak wykrywanie złożonych SV oraz fazowanie rearanżacji i modyfikacji na poziomie pojedynczej cząsteczki.To znacznie poprawi naszą wiedzę na temat architektury genomu. Fenol jest bardzo. Musisz pracować z nim w dygestorium z wyposażeniem ochrony osobistej, w tym rękawicami, okularami ochronnymi, fartuchem laboratoryjnym, długimi spodniami i butami.

ultra-long-read-sequencing-for-whole-genomic-dna-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.

Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

Poznaj metodę sekwencjonowania z bardzo długim odczytem DNA przy użyciu platformy nanopore. Technika ta poprawia montaż genomu i analizę wariacji strukturalnych, umożliwiając zastosowania w precyzyjnej medycynie klinicznej.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Przeglądaj więcej filmów