Name: Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK u szczurów łożyskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę oceny cytotoksyczności komórek NK z łożyska szczura za pomocą kolorymetrycznego testu na płytce. Ta technika pozwala izolować limfocyty i mierzyć ich aktywność cytolityczną w sposób prosty i ekonomiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Heart Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health w ramach grantu R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu P20GM104357, oraz przez Mississippi INBRE, finansowany przez Institutional Development Award (IDeA) z National Institutes of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103476. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w University of Mississippi Medical Center. Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt.
1. Izolacja limfocytów z łożysk
<ol>
	<li>Wyjąć jedno łożysko z macicy szczura (19. dzień ciąży) i umieścić w 10 mL lodowatego PBS8.</li>
	<li>Położyć jedno łożysko na filtrze 100 µm i umieścić w szalce Petri zawierającej 13,5 mL RPMI oraz 1,5 mL FBS (objętość całkowita wynosi 15 mL). Używając płaskiej strony tłoka strzykawki, przepchnąć łożysko przez filtr do szalki Petri.</li>
	<li>Przygotować trzy stożkowe probówki 15 mL dla każdej tkanki. Do każdej probówki dodać 3 mL medium do gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów), a następnie ostrożnie nanieść 5 mL homogenizowanego łożyska na wierzch w każdej probówce.</li>
	<li>Wirować przez 25 min przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania. zebrać cienką, białą warstwę leukocytarną (buffy coat) za pomocą pipety transferowej. 
	UWAGA: Po wirowaniu widoczne są 3 warstwy: czerwone RPMI na górze, biała warstwa leukocytarna w środku i przejrzysta warstwa medium do gradientu gęstości na dole. Użyć pipety transferowej, aby pobrać białą warstwę leukocytarną z probówki. Połączyć warstwy leukocytarne ze wszystkich probówek pochodzących z tego samego łożyska w jednej probówce.</li>
	<li>Do połączonych warstw leukocytarnych dodać 10 mL RPMI. Wirować przez 10 min, 300 x g, w temperaturze 4 °C i odrzucić nadsącz.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek Natural Killer
<ol>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 50 μL lodowatego PBS</li>
	<li>Do osadu komórkowego należy dodać przeciwciało anty-CD3 znakowane biotyną zgodnie z protokołem producenta i dokładnie wymieszać za pomocą pipety. Probówkę należy umieścić w rotatorze i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml medium RPMI, odwirować przez 10 min przy 400 x g i 4 °Ci odrzucić nadosad.</li>
	<li>Resuspendować osad w 1 ml RPMI i połączyć z 150 μL kulek magnetycznych w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieścić probówkę w rotatorze do probówek i inkubować przez 30 min przy ciągłym obracaniu w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wyjąć w tym momencie bufor uwalniający i pozostawić go w komorze z laminarnym przepływem powietrza do osiągnięcia temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieść probówki w magnesie na 1 min. Zbierz nadsącz i przechowuj populację komórek CD3- w probówce 15 ml w lodzie. 
	UWAGA: To jest CD3- populacja komórek.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml pożywki RPMI. Pomieszać komórki i kulki pięciokrotnie za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5.</li>
	<li>Odwiruj CD3- populację komórek przez 10 min przy 400 x g i 4 °C i odrzucić nadsącz. Osad komórkowy zawiesić ponownie w 50 μL lodowatego PBS</li>
	<li>Dodać przeciwciało anty-CD161a znakowane biotyną do CD3- komórki zgodnie z protokołem producenta i dokładnie wymieszać. Umieścić probówkę w rotatorze do probówek i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml RPMI, odwirować przez 10 min przy 400 x g i 4 °Ci odrzuć nadsącz. Przesuś osad w 1 ml pożywki RPMI i połącz z 150 μL kulek magnetycznych w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę do mikrocentryfugi w rotatorze do probówek i inkubuj przy jednoczesnym obracaniu przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść probówki w magnesie na 1 min. Zbierz nadsącz i odrzuć CD3.-/CD161a- komórki</li>
	<li>Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml pożywki RPMI. Wymieszać komórki i kuleczki pięciokrotnie za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 2.12.</li>
	<li>Wyjąć probówki do mikrocentryfugi z magnesu i dodać 1 ml buforu RT Release. Umieścić probówkę w rotatorze i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej podczas obracania.</li>
	<li>Umieścić probówki w magnesie na 1 minutę. Zebrać nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przechowywać w lodzie. 
	UWAGA: Jest to populacja komórek NK.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml medium RPMI w temperaturze pokojowej. Wymieszać komórki i kulki pięciokrotnie za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 2.16, przenosząc nadsącz do tej samej probówki. Wymieszaj dokładnie i pobierz 20 μL próbka do zliczania komórek 
	UWAGA: Przechowywać probówkę w lodzie.</li>
	<li>Wirowanie CD3-/CD161a+ komórki przez 10 min, 400 x g g w 4 °Cnastępnie usunąć nadsącz. Resuspender komórki w pożywce RPMI (10% FBS, 1% Pen/Strep, 2 ng/ml IL-2) i wysiać w stężeniu 3 x 105 komórek/dołek w płytce 6-dołkowej w 2,5 ml pożywki do aktywacji komórek NK. Inkubować komórki przez 48 h w temperaturze 37 °C, 5% CO22 w inkubatorze z nawilżaczem.</li>
</ol>
3. Test cytotoksyczności: odzyskiwanie komórek NK lub YAC1 z hodowli lub pasażowanie komórek
UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie probówki z komórkami muszą być przez cały czas przechowywane w lodzie.
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej pipety serologicznej zebrać komórki YAC1 wraz z pożywką z kolby, przenieść do probówki 50 mL w lodzie i dobrze wymieszać. Odpiąć 20 µL w celu policzenia komórek.</li>
	<li>Wirować komórki YAC1 przez 10 min przy 300 x g i 4 °C. Policzyć komórki podczas wirowania.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 6-dołkowej z komórkami NK dodać trypsynę/EDTA. Opukać płytkę i umieścić w inkubatorze.</li>
	<li>Po inkubacji komórek z trypsyną/EDTA przez ok. 5 min w 37 °C, zeskrobać zawartość płytki/kolby za pomocą sterylnego skrobaka do płytek. Do każdego dołka dodać 1 mL pożywki do komórek NK.</li>
	<li>Zebrać komórki wraz z pożywką za pomocą pipety serologicznej i przenieść do probówki wirówkowej 15 mL. Odpiąć 20 µL w celu policzenia komórek.</li>
	<li>Wirować komórki NK przez 10 min przy 400 x g w 4 °C. Podczas wirowania policzyć próbkę komórek z kroku 3.5. 
	UWAGA: Przed wyrzuceniem płytek z hodowlą obejrzeć je pod mikroskopem, aby upewnić się, że do dna dołków nie przylgnęły już żadne komórki. Ponieważ w eksperymencie wykorzystuje się komórki NK i komórki YAC1, należy policzyć każdą z nich oddzielnie.</li>
	<li>Policzyć komórki i resuspender do stężeń ustalonych w próbach optymalizacyjnych, aby przetestować odpowiedni stosunek liczby komórek docelowych do efektorowych. Zostanie to osiągnięte poprzez resuspensję osadu w odpowiednich pożywkach w celu uzyskania następujących stężeń komórek: YAC1 w stężeniu 4 x 105 komórek/mL oraz komórki NK w stężeniu 2 x 107 komórek/mL.</li>
</ol>
4. Test cytotoksyczności: Protokół badania
<ol>
	<li>Użyj 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, przeznaczonej do hodowli komórek, aby przygotować układ zgodnie z sugestiami w Tabeli 1. Tabela ta przedstawia kontrole eksperymentalne oraz 3 zestawy kolumn eksperymentalnych dla komórek NK. Układ ten można rozszerzyć do maksymalnie 10 kolumn eksperymentalnych NK na jednej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Wiruj płytkę testową z prędkością 250 x g przez 4 min, aby upewnić się, że komórki efektorowe i komórki docelowe są w kontakcie. Inkubuj płytkę 96-dołkową przez 5 godzin w wilgotnej komorze inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby zapewnić wystarczający kontakt między komórkami docelowymi a efektorowymi oraz lizę komórek docelowych przez komórki efektorowe. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.</li>
	<li>Na 45 min przed pobraniem naddatków dodaj 10 µL 10x Lysis Solution do dołków Maksymalnego Uwolnienia LDH z Komórek Docelowych (dołki 1E, 1F, 1G i 1H) i umieść płytkę z powrotem w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Po zakończeniu czasu inkubacji wiruj płytkę z prędkością 250 x g przez 4 min. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś aliquoty o objętości 50 µL ze wszystkich dołków do nowej 96-dołkowej płytki testowej o płaskim dnie. 
	UWAGA: Nie dotykaj dna dołków, aby uniknąć przeniesienia komórek do nowej płytki testowej. Jako nowej płytki testowej nie używaj płytki przeznaczonej do hodowli komórek.</li>
	<li>Przygotowanie Odczynnika Testowego.
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu przez Assay Buffer temperatury pokojowej dodaj 12 mL Assay Buffer do jednej butelki Substrate Mix. Odwracaj i delikatnie wstrząsaj do całkowitego rozpuszczenia. Jedna butelka wystarcza na dwie płytki 96-dołkowe. 
		UWAGA: Assay Buffer należy chronić przed światłem podczas rozmrażania. Wymieszaj bezpośrednio przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 50 µL Odczynnika Testowego do wszystkich dołków na płytce testowej z kroku 4.6. Przykryj płytkę folią, aby chronić ją przed światłem, i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Świeżo przygotowany Odczynnik Testowy należy przechowywać w zamrażarce. Odczynnik jest stabilny przez około 8 tygodni.</li>
	<li>Dodaj 50 µL Stop Solution do każdego dołka. Odczytaj wyniki z płytki w ciągu 1 godziny po dodaniu Stop Solution i zarejestruj absorbancję przy 490 nm. Reprezentatywne dane przedstawiono w Tabeli 2.</li>
</ol>
5. Obliczanie wyników
<ol>
	<li>Obliczyć średnią wartość absorbancji dla dołków tła pożywki hodowlanej i odjąć ją od wszystkich wartości absorbancji dla dołków eksperymentalnych, dołków spontanicznego uwalniania LDH przez komórki docelowe oraz dołków spontanicznego uwalniania LDH przez komórki efektorowe.</li>
	<li>Obliczyć średnie wartości absorbancji dla dołków kontroli korekcji objętości i odjąć je od wartości absorbancji uzyskanych dla dołków kontroli maksymalnego uwalniania LDH przez komórki docelowe.</li>
	<li>Wykorzystać skorygowane wartości z kroków 5.1 i 5.2 w poniższym wzorze, aby obliczyć procent cytotoksyczności dla każdego dołka z układem efektor:komórka docelowa. 
	<img alt="Wzór na cytotoksyczność służący do obliczania żywotności komórek w testach eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Istnieje kilka ważnych kluczowych uwag, które należy wziąć pod uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki. Bardzo ważna jest sterylność wykorzystywanych komórek. Po pobraniu łożyska ważne jest, aby przygotowanie i izolacja komórek NK zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ponadto, ponieważ wszystkie komórki uwalniają LDH po uszkodzeniu komórki, należy zadbać o uzyskanie wysokiej żywotności komórek NK po izolacji i podczas procesu kohodowli. Zbyt duże spontaniczne uwalnianie LDH z k...

Stan przedrzucawkowy to nadciśnieniowe zaburzenie ciąży charakteryzujące się ograniczeniem wzrostu płodu, uszkodzeniem narządów końcowych i przewlekłą aktywacją immunologiczną. Przewlekła aktywacja immunologiczna u kobiet ze stanem przedrzucawkowym prowadzi do zwiększenia cytokiny zapalnej krążącej i łożyskowej, braku równowagi w populacjach limfocytów T CD4 + i zwiększonej populacji aktywowanych komórek NK (Natural Killer Cells)1. Badania opublikowane niedawno przez nasze laboratorium pokazują rolę komórek NK w powodowaniu niektórych patofizjologii związanych ze stanem przedrzucawkowym w szczurzym modelu stanu przedrzucawkowego ze zmniejszonym ciśnieniem perfuzji macicy (RUPP). Stosując cytometrię przepływową do pomiaru powierzchniowej ekspresji markerów aktywacji na komórkach NK, zaobserwowano zwiększoną populację aktywowanych komórek NK w krążeniu i łożyskach szczurów RUPP w porównaniu z normalnymi ciężarnymi (NP) szczurami2.
Aby potwierdzić obserwacje cytometrii przepływowej, przeprowadzono badania funkcjonalne oceniające aktywność cytotoksyczną komórek NK wyizolowanych z łożysk szczurów NP i RUPP. Dostępnych jest kilka metod oceny funkcji cytotoksycznej cytotoksycznych limfocytów T CD8+ i komórek NK. Złotym standardem funkcjonalnej analizy cytotoksycznej jest test uwalniania chromu3. Inne wykorzystane protokoły to cytometria przepływowa4, cytometria obrazu5, uwalnianie kalceiny6, a ostatnio bioluminescencja7. Ten film zawiera szczegółowy protokół dotyczący stosowania dobrze znanego testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do pomiaru funkcji cytotoksycznej komórek NK przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do badania cytotoksyczności LDH.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka Eppendorfa</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L Filtr</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>Nylon Mesh</td></tr><tr><td>15 ml rurka stożkowa</td><td>Fisher</td><td>0553859A</td> Strzykawka 3 ml Fisher 14823436 50 ml stożkowa rurka <td></td></tr> Fisher <tr><td></td><td></td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej CELLTREAT 229190 Sterylny,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Okrągłodenny</td></tr><tr><td>skrobak do komórek AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Celometr Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe komory liczeniowe</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Celometr Cytometr</td> obrazowy <td>Nexcelom N/</td><td>A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności nieradioaktywnej</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do cytometrii przepływowej</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>Gradient gęstości Średni; 4 x 250 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH3025801</td><td>10 x 500 ml</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>Bez podkładki</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz anty-szczura CD161a</td><td>BD Biosciences</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz anty-szczura CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany szczur IŁ-2</td><td>R& D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 Medium</td></tr><tr><td>T25 kolba</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 komórka</td><td></td><td>ATCC TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek nk u szczurów łożyskowych

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

Powszechnie wiadomo, że komórki NK odgrywają kluczową rolę w ustanowieniu i utrzymaniu prawidłowej ciąży. Ostatnie badania wykazały zmienioną populację krążących i dziesiętnych komórek NK u kobiet, które cierpią z powodu niekorzystnych powikłań ciąży, takich jak nawracające poronienia i stan przedrzucawkowy. Badania naszej grupy wykazały, że nadciśnienie tętnicze w ciąży wiąże się ze zwiększoną populacją aktywowanych komórek NK w łożysku w oparciu o ekspresję markerów aktywacji powierzchniowej. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy protokół oceny cytotoksycznej funkcji komórek NK wyizolowanych z łożysk w zwierzęcym modelu przypominającym stan przedrzucawkowy chirurgicznie wywołanego niedokrwienia łożyska. Szczegółowo opisano następujące etapy: wytwarzanie zawiesiny pojedynczej komórki, izolację komórek NK, stymulację ex vivo, kokulturę efektora-komórki docelowej oraz test cytotoksyczności.

Łożyskowe komórki NK uzyskane od szczurów NP i RUPP były inkubowane przez 5 godzin z komórkami docelowymi w odpowiednich pożywkach w stosunku 50:1 (NK:target). Absorbancję zarejestrowano przy długości fali 490 nm, a surowe dane przedstawiono w tabeli 2. Obliczono średnią absorbancję studzienek kontrolnych tła pożywki hodowlanej i korekcji objętości. Średnie te zostały odjęte od odpowiednich studzienek wskazanych w protokole producenta i są przedstawione w tabeli 3. Skorygowane wartości w...

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania i oceny cytotoksycznej funkcji komórek NK z łożysk za pomocą testu kolorymetrycznego na płytce. Szczurzy model niedokrwienia łożyska o obniżonym ciśnieniu perfuzji macicy został wybrany, aby zademonstrować izolację za pośrednictwem przeciwciał i ocenę cytotoksycznej funkcji komórek NK .

Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK u szczurów łożyskowych

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

Ta metoda pomaga porównać aktywność cytotoksyczną różnych typów komórek za pomocą prostej, niedrogiej metody, która nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga użycia materiałów niebezpiecznych, jest niedroga i nie wymaga użycia specjalistycznego sprzętu. Metoda ta może być stosowana do pomiaru aktywności cytotoksycznej innych typów komórek, takich jak CD8 plus komórki cytolityczne, a nawet do oceny spontanicznej śmierci komórek bez inkubacji, bez cytolitycznych komórek efektorowych.Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, prawdopodobnie będą miały problemy z optymalizacją stosunku komórek docelowych do efektorowych. Radzę dokładnie przeszukać literaturę w celu określenia proporcji, które należy przetestować podczas optymalizacji protokołu. Chociaż metoda ta nie wymaga specjalistycznych umiejętności, poza dokładnym pipetowaniem, izolacja komórek jednojądrzastych i ustawienie płytki testowej to kroki, które można łatwiej zrozumieć i naśladować, jeśli są obserwowane wizualnie.Procedurę zademonstruje Chelsea Jekelley, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 13,5 mililitra RPMI w 1,5 mililitra FBS do sza

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Testy cytotoksyczności służące do pomiaru odpowiedzi litycznej komórek natural killer na komórki zakażone HIV są ograniczone przez czystość komórek docelowych. Prezentujemy tutaj izolację wysoce oczyszczonej populacji zakażonych HIV-1 pierwotnych blastów limfocytów T, wykorzystując zdolność HIV-1 do down-modulacji CD4.

Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK

Ten film demonstruje test do pomiaru cytotoksyczności komórek NK przeciwko komórkom rakowym za pomocą barwienia Calcein AM. Zmniejszona liczba fluorescencyjnych komórek nowotworowych po jednoczesnej hodowli z komórkami NK wskazuje na cytotoksyczność komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych.

Barwienie kalceiną acetoksymetylową w celu oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek rakowych

Ten film demonstruje technikę in vitro do pomiaru cytotoksyczności komórek zabójczych (CIK) indukowanych cytokinami przeciwko komórkom nowotworowym. Po kokulturze docelowych komórek rakowych z komórkami CIK, martwe komórki rakowe są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika żywotności i oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, szacując cytotoksyczne działanie komórek CIK.

Test in vitro do badania zdolności cytotoksycznych komórek zabójczych indukowanych cytokinami

Ten film demonstruje aktywność lityczną komórek NK w stosunku do komórek docelowych barwionych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia pomiar cytotoksyczności indukowanej komórkami NK poprzez barwienie martwych komórek i użycie cytometru przepływowego do ilościowego określenia żywych i martwych komórek docelowych.

Test cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej przepływowej

Ten film demonstruje przeprowadzenie testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu określenia cytotoksyczności komórek NK (natural killer) w stosunku do docelowych komórek nowotworowych. Test określa ilościowo uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej z komórek rakowych, mierząc absorbancję powstałego produktu o czerwonym zabarwieniu.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności komórek NK wobec komórek rakowych

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę oceny cytotoksyczności komórek NK z łożyska szczura za pomocą kolorymetrycznego testu na płytce. Ta technika pozwala izolować limfocyty i mierzyć ich aktywność cytolityczną w sposób prosty i ekonomiczny.

Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK u szczurów łożyskowych

Przeglądaj więcej filmów