Name: Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę chirurgiczną indukcji niedokrwienia kończyn u królików z cukrzycą i hiperlipidemią. Model ten pozwala testować nowe terapie choroby tętnic obwodowych z wykorzystaniem angiografii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za finansowanie przez Departament Obrony Kongresowo Kierowany Program Badawczy (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) do ABB i RS. Autorzy potwierdzają również finansowanie przez American Heart Association (17IRG33410888), DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) i National Institutes of Health (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) dla ABB.

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą University of Texas w Austin i UTHealth Science Center przy Houston Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Animal Care and Use Review Office (ACURO) Biura Badań Medycznych i Dowódcy Badań Armii Stanów Zjednoczonych oraz zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Indukcja cukrzycy i hiperlipidemii
<ol>
	<li>Przemień króliki nowozelandzkie (w wieku 4-6 miesięcy) z jednej filiżanki standardowej karmy z lucerny na 0,1% cholesterolu w ciągu czterech dni. W dniach 1-5 stosuj standardowe proporcje karmy do cholesterolu, wynoszące odpowiednio 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 i 0:1. Po dwóch tygodniach przyjmowania 0,1% cholesterolu należy wywołać cukrzycę u królików za pomocą wstrzyknięcia alloksanu, jak opisano w następujących krokach</li>
	<li>Uspokoić króliki za pomocą 35-75 mg / ml ketaminy i 1-2 mg / ml acepromazyny we wstrzyknięciu podskórnym i przygotować się do wstrzyknięcia dożylnego, wprowadzając cewnik do żyły brzeżnej lewego ucha za pomocą cewnika 22 g.</li>
	<li>Zbierz kroplę krwi od królików za pomocą cewnika do żył usznych w celu pomiaru wyjściowego poziomu glukozy we krwi (BGL). Można użyć dowolnego standardowego glukometru. Normalny poziom glukozy u królika wynosi zwykle od 80 do 150 mg/dl.</li>
	<li>Wstrzyknąć alloksan w dawce 100 mg/kg mc., rozpuszczony w roztworze soli fizjologicznej do objętości 8 ml, powoli przez 8 minut za pomocą pompy strzykawkowej.</li>
	<li>Sprawdzaj BGL co godzinę przez następne 12 godzin za pomocą standardowego glukometru w celu monitorowania hipoglikemii.
	<ol>
		<li>Umieść królika w ograniczniku.</li>
		<li>Znieczulij ucho kremem 2,5% lidokaina/2,5% prylokaina.</li>
		<li>Pobrać krew z żyły ucha bocznego za pomocą igły 27 G i zmierzyć BGL za pomocą standardowego glukometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mierz BGL dwa razy dziennie przez pierwsze 7 dni. Podać królikom zastrzyk insuliny, jeśli BGL osiąga lub przekracza 350 mg/dl.</li>
	<li>Przygotuj kulkę ze stali nierdzewnej o średnicy 3 mm do implantacji jako znacznik rozmiaru podczas angiogramu przed dniem operacji.
	<ol>
		<li>Wytnij 10-milimetrowy okrągły kawałek folii silastycznej z większego arkusza za pomocą stempla do biopsji.</li>
		<li>Zamontuj kulę na środku arkusza za pomocą przezroczystego uszczelniacza silikonowego.</li>
		<li>Całkowicie przykryj kulę szczeliwem. Pozostaw szczeliwo do utwardzenia przez co najmniej 24 godziny.</li>
		<li>Umieść piłkę w otwartej torbie z polietylenu o niskiej gęstości o wymiarach 2 cale x 3 cale i umieść ją w torbie sterylizacyjnej, która ma być sterylizowana gazowym tlenkiem etylenu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie królika do operacji
<ol>
	<li>Znieczulić królika za pomocą 20–40 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg midazolamu we wstrzyknięciu podskórnym. Umieść królika na 1,5%-3% izofluranu (zwykle 2%) podczas początkowej sedacji za pomocą maski. Należy wykonać wstrzyknięcie alfaksonu w celu podtrzymania znieczulenia poprzez wstrzyknięcie domięśniowe w dawce 3 mg/kg mc.</li>
	<li>Po znieczuleniu zdejmij maskę i włóż rurkę dotchawiczą z mankietem do dróg oddechowych i podłącz do respiratora. Kontynuuj podawanie izofluranu w dawce 1,5%-3%.</li>
	<li>Zbierz krew z tętnicy centralnej z dowolnego ucha w celu uzyskania podstawowego panelu biochemicznego.</li>
	<li>Umieść cewnik do żył usznych 22 G w bocznej żyle usznej, aby kroplówka z roztworem Lactated Ringer's Solution była podawana przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego. Alternatywnie można użyć soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu).</li>
	<li>Używając żyły bocznej w uchu przeciwległym, umieścić cewnik w żyle i podać alfaksalone w dawce 6 mg/kg/h. Stopniowo zwiększaj dawkę alfaksonu do 8 mg/kg mc./godz., jednocześnie zmniejszając izofluran do 0,6% w okresie przygotowawczym.</li>
	<li>W celu ograniczenia bólu i ryzyka infekcji należy podawać buprenorfinę (0,01 mg/kg) i enrofloksacynę (5 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym za pomocą igły 25 G.</li>
	<li>Przytnij włosy na szyi, prawej i lewej wewnętrznej stronie ud oraz z tyłu za pomocą maszynki do strzyżenia (ostrze #40). Włosy są usuwane z tyłu, aby utrzymać kontakt z podkładką uziemiającą.</li>
	<li>Umieść mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na każdej z tylnych kończyn i zmierz początkowe ciśnienie krwi. Umieść mankiet tuż pod kolanem z sondą tuż nad stawem skokowym na bocznej powierzchni.</li>
	<li>Ułóż królika na stole operacyjnym na grzbiecie i wyszoruj oraz udrapuj miejsca operacji. Obejmuje to szyję w przypadku dostępu do tętnicy szyjnej i wewnętrzną stronę prawego uda w przypadku dostępu do tętnicy udowej. Wykonaj peeling sterylizacyjny za pomocą naprzemiennych peelingów z 2% chlorheksydyny i 70% alkoholu etylowego. Powtórz to trzy razy, a następnie nałóż ostatni spray z 2% roztworem chlorheksydyny.</li>
	<li>Umieść 3-milimetrową kulkę ze stali nierdzewnej, która została wysterylizowana, w torbie z polietylenu o niskiej gęstości, na prawej (szorowanej) nodze w pobliżu górnej części uda, aby służyła jako odniesienie rozmiaru podczas pomiarów angiogramu. Umieść sterylną serwetkę na nodze do czasu zabiegu. Pozostaw piłkę w sterylnej plastikowej torbie podczas pierwszego angiogramu.</li>
</ol>
3. Angiografia
<ol>
	<li>Odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie o długości 4–5 cm tuż obok tchawicy za pomocą skalpela z ostrzem #15.</li>
		<li>Użyj rozwarstwienia, aby odsłonić tętnicę szyjną i otwórz nacięcie za pomocą małych zwijaczy Weitlanera. Ostrożnie odizoluj tętnicę szyjną od żyły szyjnej i nerwu błędnego. Zazwyczaj do rozwarstwienia używa się zakrzywionych nożyczek Metzenbauma i zakrzywionego hemostatu komara. Upewnij się, że tętnica szyjna jest całkowicie oddzielona od nerwu i żyły szyjnej, aby ligatury tylko podwiązywały tętnicę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść ligaturę za pomocą jedwabnego szwu 4-0 na bliższych i dalszych końcach odsłoniętej tętnicy. Zawiąż dystalny koniec tętnicy szyjnej węzłem chirurgicznym, a następnie czterema kwadratowymi węzłami. Na bliższym końcu użyj ligaloopa, aby umożliwić jego dokręcenie lub poluzowanie w razie potrzeby. Użycie ligaloopa umieszczonego na bliższym końcu odsłoniętej tętnicy może pomóc w zabezpieczeniu wprowadzacza i cewnika.</li>
	<li>Podawać 500 j.m. heparyny przez dożylny. Użyj około 0,5 ml 1% lidokainy nałożonej wzdłuż odsłoniętej tętnicy szyjnej, aby rozszerzyć naczynie. Zazwyczaj wystarcza jeden zabieg, ale w razie potrzeby można go powtórzyć. Przetnij mniej więcej połowę tętnicy szyjnej za pomocą skalpela lub nożyczek do tęczówki, a następnie umieść 4-calowe narzędzie do wprowadzania drutu w tętnicy.</li>
	<li>Przeprowadź prowadnik o wymiarach 0,014 cala x 185 cm przez narzędzie do wprowadzania do rozwidlenia aorty w grzebieniu biodrowym w aorcie zstępującej. Wyjmij narzędzie do wprowadzania i włóż cewnik angioograficzny 3F z warkoczem przez przewód.</li>
	<li>Przesuń cewnik warkocza tak, aby znajdował się 2 cm proksymalnie do rozwidlenia aorty w grzebieniu biodrowym w aorcie zstępującej.</li>
	<li>Umieść końcówkę cewnika między siódmym kręgiem lędźwiowym a pierwszym kręgiem krzyżowym. Sprawdź położenie cewnika, ręcznie wstrzykując 2–4 ml środka kontrastowego.</li>
	<li>Podać dotętnicze wstrzyknięcie 100 μg nitrogliceryny przez cewnik w celu zwiększenia rozszerzenia naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Podaj 0,8 ml 1% lidokainy królikowi przez cewnik, aby pomóc w rozszerzeniu naczyń krwionośnych podczas angiogramu. Podłącz rurkę wtryskiwacza do cewnika i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodu. Wstrzyknąć 8-9 ml środka kontrastowego za pomocą automatycznego iniektora angiograficznego przez cewnik.</li>
	<li>Rejestruj seryjne obrazy kończyn tylnych za pomocą angiografii.
	<ol>
		<li>Ustaw wtryskiwacz mocy tak, aby wstrzykiwał kontrast na poziomie 3 ml/s, co daje łącznie 8-9 ml. Wykonaj cyfrową angiografię subtrakcyjną z prędkością 6 klatek na sekundę.</li>
		<li>Wybierz utworzone obrazy seryjne i zmień zdjęcie każdego angiogramu, używając ustawienia około -40%, aby zminimalizować wygląd kości i uchwycić pełny obraz perfuzji naczynia z kontrastem. Przykładowy angiogram przepływu naczyniowego po podwiązaniu/wycięciu tętnicy udowej jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja tętnicy udowej
<ol>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie w skórze nad prawą tętnicą udową za pomocą skalpela (ostrze #15). Upewnij się, że nacięcie rozciąga się niżej od więzadła pachwinowego, kończąc się w obszarze tuż proksymalnym do rzepki (około 6 cm).</li>
	<li>Użyj rozwarstwienia zakrzywionymi nożyczkami Metzenbauma lub zakrzywionym hemostatem komara, aby odsłonić tętnicę udową.</li>
	<li>Użyj zwijaczy Weitlanera, aby utrzymać nacięcie otwarte.</li>
	<li>Dodaj miejscowo 0,5 ml 1% lidokainy, aby zmniejszyć podrażnienie nerwów i przyspieszyć rozszerzenie naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Kontynuuj rozwarstwianie tkanek, aby uwolnić całą długość tętnicy udowej wraz ze wszystkimi gałęziami tętnicy udowej, w tym dolną tętnicą nadbrzuszną, głęboką udową, boczną obwodową i powierzchowną tętnicą nadbrzusza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Przeprowadź sekcję dalej wzdłuż tętnic podkolanowych i odpiszczelowych, a także tętnicy biodrowej zewnętrznej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Okresowo nawilżaj obszar solą fizjologiczną, aby chronić przed uszkodzeniem tkanek. Jeśli rozwarstwienie jest wykonywane wzdłuż rowka udowego (między mięśniami), nie ma potrzeby przecinania mięśnia.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel tętnicę od żyły i nerwu, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C. Podwiązać tętnice wskazane na schemacie za pomocą jedwabnych szwów 4.0, umieszczając dwie opaski z wystarczającą ilością miejsca między nimi, aby przeciąć tętnicę. Wiązania te są wykonywane za pomocą węzła chirurgicznego, po którym następują cztery węzły kwadratowe.</li>
	<li>Przeciąć między dwoma wiązaniami na podwiązanych tętnicach za pomocą małych nożyczek Metzenbaum. Wyciąć tętnicę udową od jej bliższego początku jako odgałęzienia tętnicy biodrowej zewnętrznej do punktu, w którym rozdziela się, tworząc tętnice odpiszczelowe i podkolanowe.</li>
</ol>
5. Powtórz angiografię
<ol>
	<li>Użyj jedwabnego szwu 4-0, aby przymocować arkusz silastyczny z 3-milimetrową kulką ze stali nierdzewnej do górnej części mięśnia czworogłowego. Przeciągnij skórę po tym, jak jest na swoim miejscu.</li>
	<li>Podać dotętnicze wstrzyknięcie 100 μg nitrogliceryny przez cewnik w celu zwiększenia rozszerzenia naczyń krwionośnych.</li>
	<li>W razie potrzeby podaj królikowi kolejne 0,8 ml 1% lidokainy przez cewnik, aby pomóc w rozszerzeniu naczyń krwionośnych podczas angiogramu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 8-9 ml środka kontrastowego za pomocą automatycznego wstrzykiwacza angiograficznego.</li>
	<li>Wykonać angiografię zgodnie z opisem w kroku 3.9.</li>
</ol>
6. Zamykanie ran i rekonwalescencja
<ol>
	<li>Usuń cewnik z prawej tętnicy. Zawiąż tętnicę za pomocą jedwabnego szwu 4-0, który jest już na miejscu wokół tętnicy.</li>
	<li>Zszyj obie rany zamknięte. Zamknąć warstwy mięśniowe i podskórne za pomocą 4-0 polidioksanonu lub 3-0 poliglaktyny 910 na stożkowej igle (patrz Tabela materiałów) w ciągłym wzorze szwów. Zamknąć skórę za pomocą 4-0 polidioksanonu lub 4-0 poliglaktyny 910 na odwrotnej igle tnącej (patrz Tabela materiałów) w zakopanym ciągłym wzorze szwów podskórnych. 
	UWAGA: Jeśli jest dostępny, polidioksanon jest preferowany dla obu.</li>
	<li>Należy wykonać śródskórne wstrzyknięcia 0,25% bupiwakainy w pobliżu nacięć za pomocą strzykawki z igłą 25 G. Wprowadzić igłę i wstrzyknąć 0,5 ml, podczas gdy igła jest odciągana do tyłu. Wykonać jedno wstrzyknięcie z każdej strony rany w celu nacięcia szyi (dwa wstrzyknięcia w szyję) i dwa wstrzyknięcia z każdej strony rany w celu nacięcia na nodze (cztery wstrzyknięcia w nogę; łącznie sześć wstrzyknięć). Całkowita objętość wstrzykniętego leku wynosi 3 ml (0,5 ml x 6 wstrzyknięć).</li>
	<li>Podawać podskórnie zastrzyki 0,5 mg/kg meloksykamu i buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu w dawce 0,12 mg/kg mc.</li>
	<li>Monitoruj królika, gdy wraca do zdrowia po znieczuleniu. Królik automatycznie zacznie połykać, gdy obudzi się ze znieczulenia. Gdy wystąpi reakcja połykania, wyjmij rurkę dotchawiczą. Zapewnij ścisłe monitorowanie i wsparcie termiczne do momentu, gdy królik będzie w stanie utrzymać funkcje sercowo-naczyniowe i temperaturę ciała. Przywróć królika do jego wybiegu, gdy będzie w stanie się poruszać.</li>
	<li>Stosuj świeże warzywa i/lub karmienie strzykawką w diecie intensywnej terapii wraz z podskórnymi zastrzykami soli fizjologicznej, jeśli królik nie toleruje karmy po operacji. Można użyć kapusty, brokułów, kalafiora, marchwi lub innych warzyw sezonowych. Rozdrobnij warzywa i wymieszaj je ze sobą, aby królik wrócił do jedzenia.</li>
</ol>
7. Monitorowanie
<ol>
	<li>Znieczulaj króliki co dwa tygodnie, aby uzyskać ciśnienie krwi na obu nogach, jak opisano w kroku 2.8. Zbierz krew z centralnej tętnicy ucha do wykorzystania w testach biochemicznych krwi. Alternatywnie pobierz krew z żyły odpiszczelowej lub żyły głowowej. Weź około 2 ml w każdym punkcie czasowym. Do analizy należy użyć standardowego panelu biochemicznego krwi. W razie potrzeby dodaj testy na lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) lub hemoglobinę A1c (HbA1c).</li>
	<li>Weź bardzo małą ilość krwi do pomiarów BGL.</li>
</ol>
8. Leczenie
<ol>
	<li>Przygotuj dziesięć strzykawek z lekiem, nośnikiem i środkiem sieciującym. Napełnij każdą strzykawkę tuż przed użyciem 100 μl zawiesiny siarczanu wapnia, a następnie 100 μl 2% alginianu sodu czynnikami wzrostu lub innymi zabiegami tak, aby alginian znajdował się najbliżej końcówki strzykawki.</li>
	<li>Podać jedno przygotowane wstrzyknięcie do mięśnia przed przygotowaniem następnego. Skraca to czas, w którym alginian wchodzi w interakcję z siarczanem wapnia w strzykawce. Wstrzyknięcia należy rozmieścić równomiernie po obu stronach tętnicy udowej na udzie. Aby uzyskać jednolite wstrzyknięcia, należy utworzyć silikonowy arkusz z otworami do prowadzenia iniekcji, zgodnie z opisem w innych badaniach19. Można to łatwo przygotować, używając stempla do biopsji, aby utworzyć otwory w dostępnym na rynku arkuszu silikonowym.</li>
</ol>
9. Angiografia punktu końcowego, eutanazja, fiksacja perfuzji i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>W dniu punktu końcowego wykonaj angiografię zgodnie z opisem w kroku 3, ale w celu uzyskania dostępu należy użyć lewej tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Po angiografii przenieś zwierzę na stół do sekcji zwłok i wykonaj utrwalenie perfuzyjne, aby zachować tkanki kończyn tylnych:
	<ol>
		<li>Zwiększ poziom izofluranu do 3%-4% i wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że znieczulenie jest wystarczająco głębokie.</li>
		<li>Podawać dożylnie 1000-2000 j.m. heparyny.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej i rozciągające się na całej długości przepony za pomocą skalpela z ostrzem #20.</li>
		<li>Gdy klatka piersiowa jest odsłonięta, odetnij żebra tuż po lewej stronie linii środkowej za pomocą noży do żeber. Użyj zwijaczy Weitlanera, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Ustaw pompę z rurką wyjściową o średnicy wewnętrznej 1/8 cala i igłą 18G na końcu. Wstępnie napełnij linię solą fizjologiczną i przygotuj co najmniej 600 ml soli fizjologicznej i formaliny w oddzielnych pojemnikach do perfuzji.</li>
		<li>Wprowadzić igłę 18 G podłączoną do pompy do lewej komory przez wierzchołek serca. Włóż kolejną igłę 18 G (nieprzymocowaną do niczego) do prawego przedsionka i pozwól, aby krew wypłynęła do prądu zstępującego stołu do sekcji zwłok.</li>
		<li>Użyj pompy perfuzyjnej, aby kontrolować przepływ około 500 ml soli fizjologicznej do serca. Użyj ustawienia pompy, aby przepływać 110 ml/min.</li>
		<li>Gdy płyn wychodzący z serca będzie czysty, przenieś rurkę ze zbiornika soli fizjologicznej do zbiornika wypełnionego 10% roztworem formaliny. Drganie wystąpi we wszystkich czterech kończynach, jeśli perfuzja działa prawidłowo. Przepompować około 500 ml roztworu formaliny do lewej komory.</li>
		<li>Wyłącz pompę i wyjmij igły z serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń obie tylne kończyny w biodrze, przecinając wokół stawu biodrowego skalpelem z ostrzem #20. Użyj małego noża do żeber, aby usunąć kończyny. Użyj kończyny nieniedokrwiennej jako kontroli.</li>
	<li>Kończyny przechowywać w formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W celu analizy histologicznej należy pobrać wiele biopsji kończyn. Użyliśmy ośmiu biopsji 6 mm pobranych w okolicach uda i łydki w obu kończynach. 
	UWAGA: Podczas gdy pomiar ciśnienia krwi w kostce i angiografia są najczęściej stosowanymi metodami pomiaru odzyskiwania przepływu krwi, inne metody mogą być używane do śledzenia powrotu do zdrowia zwierząt, w tym ultrasonografia dopplerowska, laserowe obrazowanie dopplerowskie, termografia w podczerwieni62, perfuzja określana przez mikrosferę63,64, obrazowanie tomografii komputerowej (CT) i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)65.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono przedkliniczny model indukowania niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą i hiperlipidemią. W wielu badaniach istnieje niejasność co do techniki stosowanej do tworzenia niedokrwienia kończyn tylnych u królików. U myszy nasilenie i powrót do zdrowia po niedokrwieniu kończyn tylnych jest w dużym stopniu zależny od miejsca podwiązania i techniki zastosowanej do wywołania niedokrwienia. Znaczenie techniki przedstawionej w tej pracy polega na tym, że pozwala ona na konsekwentną indukcję niedokrwienia,...

Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest częstym zaburzeniem krążenia, w którym postęp tworzenia się blaszek miażdżycowych prowadzi do zwężenia naczyń krwionośnych w kończynach ciała. Niedawny wzrost czynników ryzyka miażdżycy, w tym cukrzycy, otyłości i braku aktywności, doprowadził do wzrostu częstości występowania chorób naczyniowych1. Obecnie szacuje się, że 12%–20% ogólnej populacji w wieku powyżej 60 lat cierpi na chorobę tętnic obwodowych2. Główną konsekwencją choroby tętnic obwodowych jest rozwój niedokrwienia obwodowego, najczęściej występującego w kończynach dolnych. W ciężkich przypadkach u pacjentów może rozwinąć się krytyczne niedokrwienie kończyn, stan, w którym występuje ciągły ból z powodu braku przepływu krwi. Pacjenci z krytycznym niedokrwieniem kończyn mają 50% prawdopodobieństwo amputacji jednej kończyny w ciągu jednego roku od diagnozy. Ponadto pacjenci z cukrzycą częściej zapadają na choroby tętnic obwodowych i gorzej wynikają po interwencjach rewaskularyzacyjnych3,4. Obecne terapie niedokrwienia obwodowego obejmują interwencje przezskórne, takie jak aterektomia i stentowanie lub pomostowanie chirurgiczne. Jednak dla wielu pacjentów zabiegi te przynoszą tylko krótkoterminowe korzyści, a wielu z nich nie jest wystarczająco zdrowych, aby przeprowadzić poważne zabiegi chirurgiczne. W niniejszej pracy opisano przedkliniczny model zwierzęcy do testowania nowych terapii ukierunkowanych na chorobę naczyń obwodowych, która obejmuje wytwarzanie niedokrwienia obwodowego u królików poprzez podwiązanie chirurgiczne w kontekście stanu choroby cukrzycowej.
Model niedokrwienia kończyn tylnych u królików był używany jako fizjologiczny model obturacyjnej choroby naczyniowej i przedkliniczny prekursor badań na ludziach przez ponad pół wieku5,6. Króliki są często preferowanym gatunkiem do badań nad niedokrwieniem obwodowym ze względu na rozwiniętą muskulaturę mięśni kostki i łydki, w przeciwieństwie do powszechnych dużych modeli zwierzęcych, które są kopytnymi (zwierzętami z kopytami). Kilka ostatnich przeglądów dotyczyło zastosowania tego i innych modeli w modelowaniu chorób naczyń obwodowych u ludzi7,8. Podobne modele wykorzystujące niedokrwienie kończyn tylnych u królików wykorzystano w badaniach przedklinicznych czynników wzrostu9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, terapia genowa21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44, and stem cells45,46,47,48,49,50,51do terapeutycznej neowaskularyzacji kończyn. Niestety, badania kliniczne, które nastąpiły po tych udanych badaniach na zwierzętach, nie wykazały znaczących korzyści dla pacjentów52.
Jednym z sugerowanych wyjaśnień przyczyny tego niepowodzenia translacyjnego jest to, że stan niedokrwienia obwodowego u pacjentów obejmuje odporność na sygnały angiogenne53,54,55,56,57,58,59. Kilka badań wykazało defekty angiogennych szlaków sygnałowych w cukrzycy i hiperglikemii. Cukrzyca i hiperlipidemia prowadzą do utraty proteoglikanów siarczanu heparanu i wzrostu enzymów tnących siarczan heparanu, co stanowi potencjalny mechanizm oporności na terapeutyczną angiogenezę/arteriogenezę z czynnikami wzrostu60,61. W związku z tym kluczowa cecha modelu niedokrwienia obwodowego powinna obejmować aspekt oporności terapeutycznej, tak aby terapie mogły być oceniane w kontekście stanu chorobowego występującego u ludzi.
W tej pracy opisujemy króliczy model niedokrwienia obwodowego poprzez chirurgiczne podwiązanie tętnic udowych. Do modelu włączono okres wstępny z indukcją cukrzycy i hiperlipidemii. Porównaliśmy ten model z innym modelem, który obejmuje dietę o wyższej zawartości tłuszczu bez cukrzycy i stwierdziliśmy, że model z cukrzycą i niższym poziomem hiperlipidemii był bardziej skuteczny w zmniejszaniu wzrostu naczyń krwionośnych. Nasz model łączy postępy, które zostały wykorzystane przez oddzielne grupy, w celu zapewnienia praktycznej i ustandaryzowanej metody osiągania spójnych wyników w badaniach nad chorobami naczyń obwodowych.

<table><tbody><tr><td>0,9% Chlorek sodu</td><td>Henry Schein 1537468 medyczny</td><td>/ 1531434</td><td>250 ml worek / 1000 ml irygacja btl</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>VWR</td><td>BD309695 10</td><td></td></tr>% <tr><td>formalina</td><td>Fisher-Scientific</td><td>23-245684</td><td></td></tr><tr><td>18G Igła</td><td>VWR</td><td>89219-294</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20G</td><td>VWR</td><td>89219-340</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>VWR</td><td>89219-290</td><td></td></tr><tr><td>Igła 27G VWR</td><td></td><td>89219-288</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>5% dekstroza</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-800-9689</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazyna</td><td>Patterson Weterynaryjna</td><td>VEDC207</td><td></td></tr><tr><td>Alfaxalone</td><td>Patterson Weterynaryjny</td><td>07-891-6051</td><td></td></tr><tr><td>Alginian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1471-1G</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat alloksanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7413</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do angiografii Wtryskiwacz do angiografii</td><td>Toshiba</td><td>Infinix-i</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Medrad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ab Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla IHC</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Ab Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Przeciwciało wtórne dla przeciwciała</td></tr><tr><td>IHC a-SMA</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>Przeciwciało pierwotne dla IHC</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer Animal Health</td><td>724089904201</td><td>Enrofloksacyna</td></tr><tr><td>Panel biochemiczny</td><td>krwi IDEXX</td><td>2616</td> Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi z <td>panelem królika</td></tr><tr><td></td><td>WelchAllyn</td><td></td><td>Flexiport Jednorazowy mankiet BP dla niemowląt rozmiar 7</td></tr><tr><td>Ciśnieniomierz</td><td>Vmed Technology</td><td></td><td>Vmed Vet-Dop2</td></tr><tr><td>Bupiwakaina</td><td>Henry Schein 6023287</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medyczna Buprenorfina</td><td>Patterson 42023017905</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weterynaryjna Buprenorfina SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan wapnia</td><td>CB Minerały</td><td></td><td>Spożywczy i farmaceutyczny USP i FCC</td></tr><tr><td>Peeling chlorheksydynowy</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-4598</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher-Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik do żył usznych</td><td>Patterson Veterinary</td><td>SR-OX165</td><td>Surflo Cewniki dożylne</td></tr><tr><td>Rurka dotchawicza</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td>Sheridan Marka, zależy od wielkości królika</td></tr><tr><td>Glukometr</td><td>Amazon</td><td>B001A67WH2</td><td>Paski testowe glukometru Accu-Chek Aviva</td></tr><tr><td></td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>788222</td><td>Accu-Chek Guidewire Aviva Plus</td></tr> Boston <tr><td></td><td>Scientific</td><td>39122-01</td><td></td></tr><tr><td>Maszynki do strzyżenia włosów</td><td>Amazon</td><td>B000CQZI3Q</td><td>Oster # 40</td></tr><tr><td>ostrze Poduszka grzewcza</td><td>Cincinnati Subzero</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Pompa poduszki grzewczej</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Gaymar T / Pump</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Zakrzywiony komar Hemostat</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Patterson Weterynaryjne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>narzędzie do wstawiania</td><td>Merit Medical Systems</td><td>MAP550</td><td>drut metalowy narzędzie do wprowadzania</td></tr><tr><td>insuliny</td><td>HPB Apteka</td><td></td><td>Novalin R & </td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td> Novalin N <td>McKesson Medyczno-chirurgiczny</td><td>942674</td><td></td></tr><tr><td>Wprowadzający</td><td>Cook Medical</td><td>G28954</td><td>3F Check Flo Performer Wprowadzający</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Henry Schein Medyczny</td><td>1100734</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Weterynaryjne</td><td>856440301</td><td></td></tr><tr><td>Mleczanowe Ringers</td><td>McKesson Medyczno-Chirurgiczny</td><td>186662</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>McKesson Medyczno-Chirurgiczny</td><td>239936</td><td></td></tr><tr><td>Krem z lidokainą/prylokainą</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>761240</td><td></td></tr><tr><td>Ligaloop</td><td>V. Mueller</td><td>CH117 / CH116</td><td>Biały Mini / Żółty</td></tr><tr><td>Mini Olej Kukurydziany</td><td>Mazola Amazon</td><td>B0049IIVCI</td><td></td></tr><tr><td>Medrad Strzykawka</td><td>McKesson Medyczno-Chirurgiczna</td><td>346920</td><td>150 ml</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Weterynaryjne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metalowe szwy kulkowe</td><td>Ethicon-Johnson & Johnson</td><td>K891H</td><td>4-0 jedwab C-1 30-calowe</td></tr> <tr><td>nożyczki Metzenbaum</td><td>Fine Science Tools</td><td>14019-13</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1215470</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogliceryna</td><td>McKesson Medyczno-chirurgiczne</td><td>927528</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-562</td><td>Przeciwciało pierwotne do</td></tr><tr><td>pompy</td> <td>perfuzyjnej IHCCewnik warkoczowy Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merit Medical Systems</td><td>1310-21-0053</td><td>3F pigtail</td></tr><tr><td>Szew polidioksanonowy (PDS II)</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>129271</td><td>stożek 4-0 RB-1 (igła przychodzi na szew)</td></tr><tr><td>Szew polidioksanonowy (PDS II)</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>129031</td><td>4-0 odwrotne cięcie FS-2</td></tr><tr><td>Polyglactin 910 (Vicryl) szew</td><td>Butler</td><td>7233-41</td><td>Stożek 3-0 RB-1</td></tr><tr><td>Poliglaktyna 910 (Vicryl) szew</td><td>McKesson</td><td>104373</td><td>4-0 Odwrotne cięcie FS-2</td></tr><tr><td>Rabbit Chow (lucerna)</td><td>LabDiet</td><td>5321</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik królika</td><td>VWR</td><td>10718-000</td><td></td></tr><tr><td>Obcinaki do żeber</td><td>V. Mueller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>#15 ostrze</td></tr><tr><td>Jedwabne szwy</td><td>Ethicon-Johnson & Johnson</td><td>A183H</td><td>4-0 jedwabne krawaty 18-calowa</td></tr> <tr><td>kulka ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster-Carr</td><td>1598K23</td><td></td></tr><tr><td>Serwety chirurgiczne</td> o średnicy 3 mm <td>Gepco</td><td>8204S</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>DRE Veterinary</td><td></td><td>Versaflow VF-300</td></tr><tr><td>Visipaque środki kontrastowe</td><td>McKesson Medyczno-Chirurgiczny</td><td>509055</td><td></td></tr><tr><td>Weitlaner Retraktor</td><td>Fine Science Narzędzia</td><td>17012-13</td><td></td></tr></tbody></table>

przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Choroba naczyń obwodowych jest powszechnym problemem klinicznym, który dotyka miliony pacjentów na całym świecie. Główną konsekwencją choroby naczyń obwodowych jest rozwój niedokrwienia. W ciężkich przypadkach u pacjentów może rozwinąć się krytyczne niedokrwienie kończyn, w którym odczuwają ciągły ból i zwiększone ryzyko amputacji kończyny. Obecne terapie niedokrwienia obwodowego obejmują operację pomostowania lub interwencje przezskórne, takie jak angioplastyka ze stentowaniem lub aterektomia w celu przywrócenia przepływu krwi. Jednak zabiegi te często nie prowadzą do dalszego postępu choroby naczyniowej lub restenozy lub są przeciwwskazane ze względu na ogólny zły stan zdrowia pacjenta. Obiecujące potencjalne podejście do leczenia niedokrwienia obwodowego polega na indukcji terapeutycznej neowaskularyzacji, aby umożliwić pacjentowi rozwinięcie unaczynienia pobocznego. Ta nowo utworzona sieć łagodzi niedokrwienie obwodowe, przywracając perfuzję w dotkniętym obszarze. Najczęściej stosowany model przedkliniczny niedokrwienia obwodowego wykorzystuje tworzenie niedokrwienia kończyn tylnych u zdrowych królików poprzez podwiązanie tętnicy udowej. W przeszłości istniał jednak silny rozdźwięk między sukcesem badań przedklinicznych a porażką badań klinicznych dotyczących leczenia niedokrwienia obwodowego. Zdrowe zwierzęta zazwyczaj mają silną regenerację naczyń krwionośnych w odpowiedzi na chirurgicznie wywołane niedokrwienie, w przeciwieństwie do zmniejszonego unaczynienia i regeneracji u pacjentów z przewlekłym niedokrwieniem obwodowym. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany model zwierzęcy dla niedokrwienia obwodowego u królików, który obejmuje hiperlipidemię i cukrzycę. Model ten zmniejszył powstawanie oboczne i powrót ciśnienia krwi w porównaniu z modelem z dietą o wyższej zawartości cholesterolu. W związku z tym model może zapewnić lepszą korelację z pacjentami z upośledzoną angiogenezą spowodowaną powszechnymi chorobami współistniejącymi, które towarzyszą chorobie naczyń obwodowych.

Po indukcji cukrzycy i wprowadzeniu diety z 0,1% cholesterolu, całkowity poziom cholesterolu u królików z cukrzycą i dietą cholesterolową wynosił średnio 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 samców królików), uwzględniając wszystkie punkty czasowe oraz osobniki. Poziom BGL dla tych królików wynosił 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 samców królików). Przebieg czasowy parametrów biochemicznych krwi i stosunków ciśnienia krwi w kończynach u typowego królika przedstawiono na Rysunku 3 w porówna...

Opisujemy zabieg chirurgiczny stosowany do wywołania niedokrwienia obwodowego u królików z hiperlipidemią i cukrzycą. Operacja ta działa jako model przedkliniczny dla stanów doświadczanych w chorobie tętnic obwodowych u pacjentów. Angiografia jest również opisywana jako sposób pomiaru stopnia wprowadzonego niedokrwienia i odzyskania perfuzji.

Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Leczenie regeneracyjne choroby tętnic obwodowych byłoby niezwykle korzystne, a ten model zwierzęcy może być w stanie lepiej przetestować, czy eksperymentalne terapie mogą działać u ludzi. Nasza procedura ma na celu przedstawienie ulepszonego modelu. Taki, który dokładniej odwzorowuje oporność terapeutyczną spotykaną u pacjentów z cukrzycą lub hiperlipidemią.Ten model zwierzęcy może być wykorzystany do testowania nowych terapii niedokrwienia obwodowego i zapewnia model przedkliniczny, który zagroził neowaskularyzacji do niedokrwienia. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie tylnej łapy u znieczulonego cztero- do sześciomiesięcznego królika z cukrzycą i hiperlipidemią, użyj skalpela z ostrzem numer 15, aby wykonać nacięcie o długości od czterech do pięciu centymetrów tuż obok prawej strony tchawicy i użyj rozwarstwienia, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną. Użyj małych retraktorów Weitlanera, aby otworzyć nacięcie i ostrożnie odizolować tętnicę szyjną od żyły szyjnej i nerwu błędnego.Gdy tętnica szyjna zostanie całkowicie oddzielona od nerwu i żyły szyjnej, umieść jedwabny szew 4-O na bliższych i dalszych końcach odsłoniętej tętnicy i zawiąż dystalny koniec tętnicy szyj

preclinical-model-of-hind-limb-ischemia-in-diabetic-rabbits

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Ten film opisuje technikę wykonywania angiografii poprzez wstrzykiwanie środka kontrastowego do aorty zstępującej, aby uwidocznić perfuzję naczyń krwionośnych w modelu królika. Ta technika pomaga zrozumieć perfuzję w naczyniach krwionośnych z blokadami i po leczeniu podczas rekonwalescencji.

Ocena perfuzji naczyń za pomocą angiografii: technika wprowadzania środka kontrastowego w aorcie zstępującej w celu wizualizacji perfuzji naczyń krwionośnych w modelu królika

W tym filmie pokazujemy zabieg chirurgiczny mający na celu wywołanie niedokrwienia obwodowego poprzez podwiązanie tętnicy udowej u królika. Metoda ta stanowi skuteczny model eksperymentalny do badań nad chorobami naczyń obwodowych.

Eksperymentalny model niedokrwienia obwodowego: procedura generowania niedokrwienia obwodowego poprzez podwiązanie tętnicy udowej u królika

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Zwierzęce modele miażdżycy są niezbędne do zrozumienia mechanizmu i zbadania nowszych metod zapobiegania rozwojowi lub pękaniu płytki nazębnej, głównej przyczynie zgonów w uprzemysłowionym świecie. Protokół ten wykorzystuje połączenie uszkodzenia balonu i diety bogatej w cholesterol w celu wywołania blaszek miażdżycowych w tętnicy biodrowej królika.

Króliczy model przyspieszonej miażdżycy: perspektywa metodologiczna uszkodzenia balonika tętnicy biodrowej

Obecny protokół ma na celu eksperymentalne stworzenie przerostu żył wewnętrznych poprzez poddanie żył działaniu ciśnienia krwi tętniczej w celu opracowania strategii osłabienia przerostu żył wewnętrznych po operacji rewaskularyzacji za pomocą przeszczepów żyłowych.

Model wstawiania żył królika naśladujący operację rewaskularyzacji przy użyciu przeszczepów żył do oceny przerostu błony wewnętrznej pod ciśnieniem tętniczym krwi

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Ciągły zapis ciśnienia tętniczego krwi pozwala na badanie wpływu różnych parametrów hemodynamicznych. W niniejszym raporcie przedstawiono zastosowanie ciągłego monitorowania ciśnienia tętniczego krwi w dużym zwierzęcym modelu udaru niedokrwiennego w celu określenia patofizjologii udaru, wpływu różnych czynników hemodynamicznych oraz oceny nowych podejść do leczenia.

Monitorowanie i modulacja ciśnienia krwi w czasie rzeczywistym w króliczym modelu udaru niedokrwiennego

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

Poznaj metodę chirurgiczną indukcji niedokrwienia kończyn u królików z cukrzycą i hiperlipidemią. Model ten pozwala testować nowe terapie choroby tętnic obwodowych z wykorzystaniem angiografii.

Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Przeglądaj więcej filmów