Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca
December 28th, 2018
W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.
Tutaj pokazujemy, jak rozmnażać meksykańską Tetra Astyanax Mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię całego wierzchowca na rybach po larwalach, aby porównać fenotypy ryb przystosowanych do rzek i jaskiń. Hodujemy ryby o tej samej gęstości na bogatej w składniki odżywcze diecie wrotków. Technika ta zapewnia stały wzrost i zapewnia korzyści w zakresie kosztów, bezpieczeństwa biologicznego i jakości wody.
Aby rozpocząć, umieść plastikową siatkę na dnie zbiornika o pojemności pięciu galonów. Następnie napełnij zbiornik wodą gotową do ryb. Zamocuj podgrzewacz wody z boku zbiornika.
Dodaj do zbiornika jedną samicę i dwa samce ryb Astyanax Mexicanus, które mają więcej niż jeden rok. Ustaw temperaturę podgrzewacza wody na 24 stopnie Celsjusza. Po 24 godzinach zwiększ temperaturę o jeden stopień Celsjusza.
Codziennie świec latarką na dno zbiornika, aby sprawdzić, czy nie ma jaj. Po zidentyfikowaniu jaj w zbiorniku hodowlanym usuń dorosłe ryby i plastikową siatkę. Użyj zlewki, aby zmniejszyć głębokość wody do 10 cm.
Aby oszacować czas zapłodnienia, użyj pipety transferowej, aby umieścić kilka jaj na szalce Petriego i obejrzyj je pod mikroskopem stereoskopowym, aby określić ich etap. Usuń nieprzezroczyste jaja lub kał. Następnie napełnij zbiornik gotową wodą dla ryb i dodaj do wody siedem kropli błękitu metylenowego.
Następnie dodaj grzałkę i bełkotkę akwariową do zbiornika. Ustaw grzałkę na 24 stopnie Celsjusza i wyreguluj regulator strumienia powietrza, aby wytworzyć delikatny strumień bąbelków. Następnie przykryj zbiornik, aby utrzymać temperaturę wody.
Dodaj 20 gramów soli do ośmiu litrów wody z gotową rybą i mieszaj, aż się rozpuści. Następnie dodaj jeden litr przygotowanej wody do każdego pojemnika szkółkarskiego. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś 20 wyklutych larw do każdego pojemnika przedszkolnego.
Zamieszaj wodę w większym zbiorniku, aby upewnić się, że wszystkie larwy zostały usunięte. Aby przygotować pokarm dla ryb, dodaj trzy ml mieszanki glonów do jednego litra zebranych wrotków. Pięć dni po zapłodnieniu dodaj trzy ml pokarmu dla ryb do każdego pojemnika w odchowalni.
Wrotki powinny być widoczne w gęstych grupach w rogu pojemników, chyba że są widoczne w pobliżu środka. Codziennie sprawdzaj pojemnik pod kątem wrotków i dodawaj więcej jedzenia, jeśli stężenie się wyczerpie. Usuń wszelkie martwe larwy.
Najpierw, aby oczyścić przewód pokarmowy z zawartości pokarmu, wlej pojemnik przedszkolny z rybami w pożądanym wieku przez sitko z nylonowej siatki. Umieść sitko w pojemniku z czystą wodą gotową do spożycia ryb i wstrzymaj jedzenie na 24 godziny. Po eutanazji ryby, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, użyj pipety transferowej, aby przenieść rybę do stożkowej rurki.
Zastąp roztwór do eutanazji utrwalaczem. I inkubuj rurkę z kołysaniem przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz i zastąp go PBST.
Inkubuj rurkę przez kolejne 15 minut z kołysaniem. I powtórz proces prania jeszcze raz. Następnie użyj pipety transferowej, aby przenieść rybę do szklanej fiolki o pojemności czterech ml z zakręcaną nakrętką.
Wyjąć PBST z fiolki i dodać trzy ml roztworu blokującego. Inkubować fiolkę w temperaturze pokojowej przez godzinę z kołysaniem. Następnie należy użyć pipety transferowej, aby usunąć roztwór blokujący i zastąpić go przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym.
Fiolkę należy inkubować przez noc w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Następnie umyj rybę trzykrotnie PBST, jak opisano wcześniej. Zastąp PBST przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym.
I inkubować fiolkę przez noc w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Na koniec umyj rybę trzy razy przez 15 minut za pomocą PBST. Korzystając z tego protokołu, ryby jaskiniowe Tinaja, Molino i Pachon zostały wyhodowane w statycznych zbiornikach hodowlanych.
Na powierzchni i tarle Pachoń, z zapłodnionymi zarodkami, zawsze wytwarzały wyklute larwy. Podczas gdy Molino i Tinaja czasami nie odnosiły sukcesów. Ogólnie rzecz biorąc, ryby powierzchniowe produkowały największą liczbę larw na tarło, a następnie odpowiednio Pachon, Tinaja i Molino.
Technika barwienia immunologicznego typu "całe mocowanie" została z powodzeniem wykorzystana do znakowania neuronów i komórek trzustki na etapach do 12,5 dnia po zapłodnieniu. Ważne jest, aby usunąć wszelkie martwe ryby podczas wychowywania larw i rejestrowania liczby ryb, które przeżyły. Jeśli wiele ryb umrze, może to być spowodowane zanieczyszczeniem bakteryjnym lub grzybiczym.
Zbiorniki należy przed użyciem wysterylizować 70% etanolem. Opisana przez nas technika barwienia immunologicznego została z powodzeniem zastosowana do przeciwciał wymienionych w tabeli materiałów. Po barwieniu immunologicznym ryby można zmontować w całości lub podzielić na sekcje, aby zobaczyć dowolną tkankę, która jest przedmiotem zainteresowania.
W połączeniu, procedura hodowli, wylęgu i barwienia immunologicznego zapewnia solidną metodę oceny aktywności genu NC2 w sposób porównywalny między laboratoriami.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje rozmnażanie dorosłych osobników Astyanax mexicanus, hodowlę larw oraz wykonywanie immunohistochemii całego montażu na rybach post-larwalnych. Badanie porównuje fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.
Kluczowe elementy badania
Dział nauki
- Neurobiologia
- Biologia rozwojowa
- Morfologia porównawcza
Tło
- Astyanax mexicanus wykazuje odrębne morfotypy powierzchniowe i jaskiniowe.
- Zrozumienie różnic fenotypowych może dostarczyć wglądu w mechanizmy adaptacyjne.
- Immunohistochemia całego montażu jest cenną techniką do wizualizacji struktur komórkowych.
- Spójne warunki wzrostu są niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
Cel badania
- Ustanowienie protokołu rozmnażania dla Astyanax mexicanus.
- Porównanie fenotypów ryb przystosowanych do rzeki i jaskini.
- Wykorzystanie immunohistochemii do analizy komórkowej.
Zastosowane metody
- Rozmnażanie dorosłych osobników w kontrolowanym środowisku.
- Hodowla larw na bogatej w składniki odżywcze diecie z roztoczy.
- Wykonanie immunohistochemii całego montażu na rybach post-larwalnych.
- Dokumentowanie wskaźników przeżywalności i wyników fenotypowych.
Główne wyniki
- Udało się rozmnożyć morfotypy powierzchniowe i jaskiniowe.
- Ryby powierzchniowe produkowały więcej larw na tarło w porównaniu z rybami jaskiniowymi.
- Barwienie immunologiczne skutecznie oznaczało neurony i komórki trzustki.
- Wskaźniki przeżywalności były monitorowane w celu oceny stanu zdrowia i ryzyka zakażenia.
Wnioski
- Ustanowiony protokół stanowi wiarygodną metodę rozmnażania i analizy Astyanax mexicanus.
- Badania porównawcze mogą wzbogacić zrozumienie adaptacji ewolucyjnych.
- Immunohistochemia jest potężnym narzędziem do badania biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing standardized post-larval culture and immunostaining protocols for Astyanax mexicanus enables comparative phenotypic analysis of surface and cave morphotypes. This approach supports target validation by providing a disease-relevant system to study adaptive traits and developmental gene function. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing mechanistic de-risking of conserved pathways through cross-population comparison.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing phenotypic divergence in post-larval stages between surface and cave populations.
- Operational Value: Provides a standardized aquaculture system for generating density-matched larval cohorts, reducing biological variability in target validation assays.
- Scientific Value: Supports functional target validation through whole-mount immunostaining to assess gene expression patterns in neurons and pancreatic cells without transgenic reporters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible post-larval phenotypes suitable for high-content screening of compounds affecting developmental pathways.
- Operational Value: Standardizes larval rearing on rotifer diets in static systems, ensuring consistent growth and minimizing confounding variables in assay readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative phenotypic measurements via immunostaining, supporting assay standardization and cross-laboratory data comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by linking post-larval phenotypic differences to adult survival traits in cavefish environments.
- Operational Value: Supports preclinical model development by establishing nursery protocols that can scale to adult rearing for long-term phenotypic studies.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing comparison of conserved developmental pathways implicated in adaptation and disease resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized platform for phenotypic screening and target validation prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of developmental genes by comparing immunostaining patterns between surface and cave-derived post-larval fish.
- Screening: Delivers assay-ready larval populations with consistent growth and survival metrics, supporting reproducible compound screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative immunohistochemical readouts that allow teams to compare protein expression levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to adult adaptive traits, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nursery and immunostaining platform applicable across multiple studies investigating developmental gene function in vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through direct phenotypic comparison of adaptive variants.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined larval rearing and immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early de-risking of targets based on conserved phenotypic responses in disease-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing empirical data on target modulation effects in a genetically tractable comparative system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry and live food culture (rotifers) for successful larval rearing.
- Dependent on access to fluorescent microscopy and standardized immunostaining reagents for neuronal and pancreatic cell detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, blocking, and antibody incubation procedures to ensure reproducible staining outcomes.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to other fish species or developmental stages beyond 12.5 days post fertilization.
- Includes practical limitations such as variable spawning success in certain cave populations (e.g., Molino, Tinaja), requiring adjusted breeding ratios or increased replicate numbers.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Breeding
1:20
Hatching Fertilized Eggs
2:16
Transfer of Hatched Larvae to Nursery Containers
2:45
Preparation of Rotifer-based Fish Food and Feeding of Post-Larval Fish
3:19
Whole-Mount Immunohistochemistry of Post-Larval Fish
5:11
Results: Surface Fish Produce Greatest Number of Larvae per Spawn
5:56
Conclusion
