Name: Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę ilościowego badania wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu testów ATP i barwienia żywych/martwych. Technika ta pozwala ocenić skuteczność ceftriaksonu w warunkach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z National Institute of Health dla D.C.S. i W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C. i E.N. otrzymali częściowe wsparcie w programie "The First-Year Innovation & Research Experience" finansowanym przez University of Maryland. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Uznajemy rdzeń obrazowania UMD CBMG Imaging Core dla wszystkich eksperymentów mikroskopowych.

1. Ogólna konserwacja szczepów GC
<ol>
	<li>Szczepy N. gonorrhoeae smugi na agarze GCK z 1% suplementami Kellogg 18 (Tabela 1, Tabela 2) z zapasów zamrażarek i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-18 godzin. Użyj MS11 wyrażającego zmienne fazowo Opa (MS11Opa+), bez Opa (MS11ΔOpa) lub skróconego LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Ostrożnie wybierz kolonie ujemne (kolonia bez ciemnej krawędzi) lub dodatnie (kolonia z ciemną krawędzią) z każdego szczepu na podstawie morfologii kolonii19 za pomocą mikroskopu mikroskopowego i smugi na nowej płytce GCK.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-18 godzin przed użyciem.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja żywotności agregacji GC
<ol>
	<li>Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym bulionie (GCP, Tabela 3) uzupełnionym 4,2% roztworami NaHCO3 i 1% roztworami Kellogga18. Użyj spektrofotometrii o długości fali 650 nm (OD650 1 = ~1 x 109 CFU/ml) w celu określenia stężenia zawieszonych bakterii.</li>
	<li>Dostosuj stężenie GC do ~1 x 108 jtk/ml.</li>
	<li>Dodać 99 μl dostosowanej zawiesiny GC do studzienek z 96-dołkową płytką.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić agregację bakterii.</li>
	<li>Dodać 1 μl seryjnie rozcieńczonego ceftriaksonu (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/ml) do każdego dołka. Pozostaw niektóre studzienki niepoddane obróbce, aby służyły jako kontrole.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Sonikować zawiesinę 3 razy w każdej studzience przez 5 s przy 144 W i 20 kHz.</li>
	<li>Dodać 100 μl dostępnego w handlu odczynnika jarzeniowego do wykorzystania ATP do każdej studzienki, pipetować w górę i w dół 3 razy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Ostrożnie przenieść 150 μl mieszaniny z każdej studzienki do nowej studzienki na 96-dołkowej czarnej mikropłytce i unikać wprowadzania pęcherzyków.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Obliczyć współczynnik przeżycia na podstawie stosunku odczytu uzyskanego po seryjnym leczeniu ceftriaksonem do odczytu z nieleczonych studzienek.</li>
</ol>
3. Mikroskopowa analiza fluorescencyjna żywych/martwych agregatów GC
<ol>
	<li>Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym podłożu GCP plus 1% suplementy Kellogga.</li>
	<li>Określić liczbę bakterii za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 650 nm i dostosować stężenie GC do ~1 x 107 CFU/ml.</li>
	<li>Dodać 198 μl zawiesiny GC do 8-dołkowych komór z dnem szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Inkubować komorę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu umożliwienia agregacji.</li>
	<li>Dodać 2 μl ceftriaksonu (100 μg/ml lub różne rozcieńczenia) do każdego dołka w każdym stanie agregacji. Inkubować przez żądany czas w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 0,6 μl mieszaniny żywego/martwego roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Rejestruj obrazy serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego (można użyć równoważnego mikroskopu).</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ do pomiaru wielkości agregatów GC i współczynnika intensywności fluorescencji (FIR) barwienia żywego do martwego w każdym agregacji.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Oszacowanie wielkości agregatów bakteryjnych.
	<ol>
		<li>Otwórz ImageJ i otwórz obraz, przeciągając plik RAW obrazu na pasek menu ImageJ.</li>
		<li>Kliknij opcję Linie odręczne na pasku menu ImageJ i zakreśl obszar każdej agregacji na obrazie.</li>
		<li>Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz na pasku menu ImageJ.</li>
		<li>Uzyskaj numer w nowym oknie w kolumnie Obszar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja stosunku żywych do martwych agregacji
	<ol>
		<li>Otwórz ImageJ i otwórz obraz, przeciągając plik RAW obrazu na pasek menu ImageJ.</li>
		<li>Kliknij pozycję Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) na pasku menu ImageJ.</li>
		<li>Sprawdź zintegrowaną gęstość w wyskakującym okienku i kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij Obraz | Kolor | Kanały na pasku menu i wybierz Kolor.</li>
		<li>Sprawdź kanał 1 jako fluorescencję dla barwienia żywymi bakteriami.</li>
		<li>Kliknij opcję Freehand Lines (Linie odręczne) na pasku menu ImageJ i zakreśl obszar każdej agregacji.</li>
		<li>Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz na pasku menu ImageJ.</li>
		<li>Uzyskaj numer w kolumnie IntDen.</li>
		<li>Sprawdź kanał 2 jako fluorescencję dla martwych bakterii. Powtórz kroki 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Uzyskaj stosunek liczby żywych do martwych, dzieląc liczbę z kroku 4.2.8 przez liczbę z kroku 4.2.9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Otwórz GraphPad Prism i wprowadź liczby uzyskane z ImageJ do żądanej kolumny.</li>
		<li>Kliknij przycisk Analizuj i wybierz t testów w obszarze Analizy kolumnowe.</li>
		<li>Zaznacz żądaną kolumnę do porównania i kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Uzyskaj wartość P w oknie Analiza.</li>
		<li>Wybierz Regresję liniową w analizach XY z kroku 4.3.3</li>
		<li>Uzyskaj wartość R-kwadrat i wartość P w oknie Analiza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+of+urogenital%2C+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li>
<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
<li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonorrhea+in+Indonesia%3A+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta%2C+Yogyakarta%2C+and+Denpasar%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sexually+Transmitted+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li>
<li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+Neisseria+gonorrhoeae%2C+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation%2C+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).</li>
<li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li>
<li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+gonorrhea%3A+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li>
<li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li>
<li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li>
<li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).</li>
<li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Microbiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li>
<li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li>
<li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).</li>
<li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
<li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion%3A+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li>
<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li>
<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li>
<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bakterie mogą tworzyć biofilmy podczas infekcji organizmu ludzkiego. Tradycyjne badania MIC mogą nie odzwierciedlać stężenia potrzebnego do wyeliminowania bakterii w biofilmie. Aby przetestować wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na biofilm, metody oparte na biomasie biofilmu, a także na posiewaniu CFU mogą być błędne ze względu na wpływ struktury biofilmu. Na przykład metoda powlekania działa tylko wtedy, gdy biofilm może zostać przerwany. W związku z tym uzyskana CFU może być niższa niż rzeczywista liczba żywotnych ...

Rzeżączka jest powszechną infekcją przenoszoną drogą płciową (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), Gram-ujemna bakteria diplokokowa, jest czynnikiem wywołującym tę chorobę. Objawy infekcji narządów płciowych mogą powodować ból podczas oddawania moczu, uogólniony ból narządów płciowych i wydzielinę z cewki moczowej. Zakażenie często przebiega bezobjawowo2,3,4,5, co pozwala na przedłużoną kolonizację. Te nieleczone infekcje stanowią poważny problem zdrowotny, ponieważ mogą potencjalnie ułatwiać przenoszenie organizmu, co może prowadzić do powikłań, takich jak zapalenie miednicy mniejszej (PID) i rozsiane zakażenie gonokokami (DGI)6. Rzeżączka oporna na antybiotyki jest poważnym kryzysem zdrowia publicznego i rosnącym obciążeniem społeczno-ekonomicznym7. Zmniejszona wrażliwość na cefalosporyny spowodowała zmianę schematu leczenia z pojedynczego antybiotyku na terapię podwójną, która łączy azytromycynę lub doksycyklinę z ceftriaksonem8. Zwiększona nieskuteczność ceftriaksonu i azytromycyny9,10, w połączeniu z bezobjawowymi infekcjami, podkreśla potrzebę zrozumienia niepowodzeń leczenia rzeżączki.
Test minimalnego stężenia hamującego (MIC), w tym testy rozcieńczenia agaru i dyfuzji krążka, został użyty jako standardowy test medyczny do identyfikacji odporności na antybiotyk. Niemniej jednak nie jest jasne, czy test MIC odzwierciedla oporność bakterii na antybiotyki in vivo. Tworzenie biofilmów bakteryjnych przyczynia się do przetrwania bakterii w obecności bakteriobójczych stężeń antybiotyku: testy MIC nie są w stanie wykryć tego efektu11. Ponieważ GC może tworzyć biofilmy na powierzchniach błon śluzowych12, stawiamy hipotezę, że podatność na antybiotyki w agregatach byłaby inna niż obserwowana w poszczególnych GC. Ponadto badania wykazały, że trójfazowe cząsteczki powierzchniowe o zmiennej powierzchni, Pili, białko związane z nieprzezroczystością (Opa) i lipooligosacharydy (LOS), które regulują interakcje między bakteriami, prowadzą do różnych rozmiarów agregatów13,14,15. Udział tych składników w oporności na antybiotyki nie został zbadany ze względu na brak odpowiednich metod.
Obecnie istnieje kilka metod pomiaru eliminacji biofilmu. Najczęściej stosowaną metodą ilościową jest pomiar zmian biomasy za pomocą barwienia fioletem krystalicznym16. Metoda ta wymaga jednak znacznych manipulacji eksperymentalnych, które mogą potencjalnie generować błędy w powtórzeniach eksperymentu17. Zastosowana tutaj metoda barwienia żywych/martwych pozwala na wizualizację żywych i martwych bakterii oraz ich rozmieszczenie w biofilmie. Jednak struktura biofilmu może stanowić fizyczną barierę, która zmniejsza penetrację barwnika. Dlatego, aby określić ilościowo żywe/martwe bakterie w grupie, barwienie ogranicza się do małych biofilmów lub ich prekursorów - mikrokolonii lub agregacji. Inne metody, w tym testy rozcieńczania agaru i dyfuzji krążkowej, nie są w stanie zmierzyć skutków agregacji. Aby zbadać podatność GC w obrębie agregacji po ekspozycji na antybiotyk, idealna metoda wymagałaby zarówno testu ilościowego, który może mierzyć żywe bakterie, jak i wizualizować ich rozmieszczenie.
Opisana tutaj procedura łączy pomiar wykorzystania ATP i test barwienia żywego/martwego, aby ilościowo i wizualnie zbadać podatność GC w agregatach w obecności antybiotyków.

<table><tbody><tr><td>100x suplement</td><td></td><td></td><td></td>Kellogg's</tr><tr><td>Agar</td><td>Stany Zjednoczone Biologiczny</td> Test BacTiter <td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC średnia baza&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Azotan żelaza, niewodny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina krystaliczna w proszku</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight żywe/martwe barwienie</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria</td><td></td><td></td> gonorrhoeae szczep <td>uprzejmie dostarczony przez Dr. Hermana Schneidera, Walter Reed Army Institute dla Badania</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Proteose&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Skrobia rozpuszczalna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan tiaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy komora z dnem szkiełka nakrywkowego&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (NU-425-600 klasa II, kaptur A2 z przepływem laminarnym)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Mikroskop konfokalny model 3530</td><td></td></tr><tr><td>wyposażony w komorę do obrazowania na żywo</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96-dołkowa płytka polistyrenowa&nbsp;</td>Oświetlacz <td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (0,1-10 &mikro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1000 &mikro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 &mikro; L)</td> <td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki do mikrowirówek (1,7 ml)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z końcówką poliestrową</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>Equivelent to 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania atp i barwienia żywych/martwych

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Pojawienie się opornej na antybiotyki Neisseria gonorrhoeae (GC) stanowi ogólnoświatowe zagrożenie dla zdrowia i podkreśla potrzebę identyfikacji osób, które nie przeszły leczenia. Ta bakteria Gram-ujemna powoduje rzeżączkę wyłącznie u ludzi. Podczas infekcji jest w stanie tworzyć agregaty i/lub biofilmy. Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) służy do określenia wrażliwości na antybiotyki i określenia odpowiedniego leczenia. Jednak mechanizm eradykacji in vivo i jej związek z wynikami laboratoryjnymi nie są znane. Opracowano metodę, która bada, w jaki sposób agregacja GC wpływa na wrażliwość na antybiotyki i pokazuje związek między wielkością agregatu a wrażliwością na antybiotyki. Po agregacji GC są one bardziej odporne na zabijanie antybiotykami, a bakterie w centrum lepiej przeżywają leczenie ceftriaksonem niż te na peryferiach. Dane wskazują, że agregacja N. gonorrhoeae może zmniejszać jego podatność na ceftriakson, co nie jest odzwierciedlone przy użyciu standardowych metod MIC opartych na płytkach agarowych. Metoda zastosowana w tym badaniu pozwoli naukowcom przetestować podatność bakterii w klinicznie istotnych warunkach.

Zastosowano dwie metody: test wykorzystania ATP oraz test barwienia żywe/martwe. Wyniki mogą być łączone lub wykorzystywane indywidualnie do badania przeżywalności bakterii w obrębie agregatów po leczeniu antybiotykiem. Wykazano, że test wykorzystania ATP precyzyjnie mierzy liczbę żywych bakterii w biofilmach S. aureus20,21. W niniejszym badaniu szczep MS11Opa+Pil+ został wykorzystany do zbadania roli agregacji GC w podat...

Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Technika ta pozwala nam zmierzyć wrażliwość na antybiotyki w bardziej istotnych klinicznie warunkach. Technika ta pozwala nam również określić prawdziwe stężenie antybiotyku, które może zabijać bakterie w agregatach. Technikę tę można zastosować do określenia stężenia potrzebnego do eliminacji kruszyw GC.Metodę tę można również zastosować do pomiaru podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe wszelkich bakterii, które są zdolne do tworzenia agregatów. Zwróć szczególną uwagę na etapy lizy, aby upewnić się, że liza została zakończona. W przeciwnym razie test pomiaru ATP zaniży liczbę żywotnych bakterii.Wizualizacja tej metody pozwoli innym badaczom śledzić i powielać ten eksperyment z konsekwencją. Zacznij od smugowania Neisseria gonorrhoeae lub szczepów GC na agarze GCK uzupełnionym 1% Kellogga przez 16 do 18 godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka użyj mikroskopu świetlnego, aby ostrożnie wybrać pili-ujemne kolonie bez ciemnych krawędzi lub pili-dodatnie kolonie z ciemnymi krawędziami z każdej płytki i umieść wybrane kolonie na nowych płytkach GCK w celu 16-18-godzinnej hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego ranka użyj sterylnego aplikatora, aby zebrać kolonie GC z każdej płytki i ponownie zawieś każdy wacik w ciepłym bulionie uzupełnionym 4,2% wodorowęglanem sodu i 1% roztworem Kellogga. Zmierz gęstość optyczną przy 650 nanometrach lub OD650, aby określić stężenie zawieszonych bakterii i dostosować stężenie GC do około jednego razy 10 do ośmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie dodaj 99 mikrolitrów zawiesiny GC do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki i pozwól bakteriom agregować się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin.Pod koniec inkubacji dodać jeden mikrolitr seryjnie rozcieńczonego ceftriaksonu do każdej studzienki, pozostawiając kilka studzienek niepoddanych działaniu substancji, które służą jako kontrole, i zwrócić płytkę do inkubatora na kolejne 24 godziny. Następnego dnia poddaj sonifikację zawiesiny w każdym studzience trzykrotnie z mocą 144 watów i 20 kiloherców przez pięć sekund na sonikację i dodaj 100 mikrolitrów dostępnego na rynku odczynnika jarzeniowego ATP do każdej studzienki. Ostrożnie przenieś 150 mikrolitrów mieszaniny z każdej studzienki do indywidualnych studzienek nowej 96-dołkowej czarnej mikropłytki i zmierz absorbancję każdej studzienki przy 560 nanometrach na czytniku płytek.Następnie należy obliczyć współczynnik przeżycia na podstawie stosunku odczytu uzyskanego po seryjnym leczeniu antybiotykami do odczytu z nieleczonych studzienek. W celu wizualizacji żywych/martwych agregatów GC należy użyć sterylnego aplikatora, aby pobrać GC z nocnych płytek hodowlanych i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym podłożu GCP uzupełnionym 1% Kellogg. Zmierz OD650 za pomocą spektrofotometrii i dostosuj stężenie do około 10 razy 10 do siedmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr.Następnie dodaj 198 mikrolitrów zawiesiny GC do ośmiodołkowych komór z dnem szkiełka nakrywkowego i inkubuj komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Pod koniec inkubacji należy potraktować bakterie dwoma mikrolitrami ceftriaksonu na warunki agregacji i zwrócić komory do inkubatora na odpowiedni okres inkubacji doświadczalnej. Pod koniec inkubacji dodaj 0,6 mikrolitra żywego/martwego roztworu barwiącego do każdej studzienki i włóż komory z powrotem do inkubatora na dodatkowe 20 minut.Następnie użyj mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy z serii z. Aby zmierzyć rozmiar agregacji GC, otwórz pierwszy obraz w ImageJ i wybierz linie odręczne, aby zakreślić obszar każdej agregacji na obrazie. Kliknij przycisk Analizuj i mierz.Rozmiar agregatów zostanie wskazany w kolumnie powierzchni. Aby określić ilościowo stosunek intensywności fluorescencji barwienia żywego do martwego w każdym agregacie, kliknij przycisk analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź zintegrowaną gęstość w wyskakującym okienku. Kliknij przycisk OK, a następnie kliknij narzędzie Obraz, kolor i kanały.Wybierz kolor i kanał pierwszy jako fluorescencję dla barwienia martwych bakterii. Wybierz linie odręczne, aby zakreślić obszar każdej agregacji, a następnie kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby uzyskać współczynnik intensywności fluorescencji dla każdego agregatu w zintegrowanej kolumnie gęstości. Wybierz kanał drugi dla fluorescencji dla barwienia żywych bakterii i zmierz intensywność fluorescencji w każdym agregacji, jak pokazano poniżej.Następnie podziel dane o intensywności fluorescencji na żywo przez dane o intensywności fluorescencji martwej, aby uzyskać stosunek intensywności fluorescencji żywej do martwej. W tym reprezentatywnym eksperymencie niezagregowane bakterie pili dodatnie, zagregowane pili dodatnie lub zagregowane i zakłócone pili dodatnie traktowano seryjnymi rozcieńczeniami ceftriaksonu przed pomiarem ich poziomów ATP. Prezagregowany GC wykazał istotnie dłuższy czas przeżycia niż GC niezagregowany lub zaburzony agregacją, gdy traktowano go równymi lub wyższymi stężeniami ceftriaksonu.Szczepy pili-dodatnie, które tworzą większe agregaty, wykazywały najwyższe poziomy ATP po leczeniu ceftriaksonem w porównaniu ze zmutowanymi szczepami. Niezależnie od testowanego szczepu, barwienie żywych/martwych bakterii przed antybiotykiem ujawniło martwe bakterie zlokalizowane głównie w zewnętrznych warstwach hodowli, podczas gdy żywe GC zidentyfikowano głównie w rdzeniu agregatów traktowanych ceftriaksonem. Zgodnie z oczekiwaniami, bakterie pili-dodatnie tworzyły największe agregaty, podczas gdy kultury pili-ujemne tworzyły najmniejsze.Warto zauważyć, że agregaty pili-dodatnie były nadal żywe w swoich warstwach rdzeniowych po leczeniu antybiotykami, podczas gdy GC w małych, luźnych zmutowanych agregatach były martwe. Na podstawie wielkości i przeżycia GC można wykreślić wykres korelacji, aby zbadać związek między wielkością agregacji a przeżywalnością antybiotyków bakterii. Sonikacja jest ważna, aby upewnić się, że ATP z każdej pojedynczej bakterii jest uwalniane w ściśle związanych agregatach.W przeciwnym razie pomiary nie będą spójne. Ważne jest, aby platerować bakterie po ich agregacji i potraktowaniu antybiotykami, aby zmierzyć zarówno bakterie żywe, jak i zdolne do replikacji. Technika ta mierzy wpływ agregacji bakterii na wrażliwość na antybiotyki, co pozwala naukowcom opracować lepsze leki do leczenia chorób.

quantitative-examination-antibiotic-susceptibility-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Cayron, J. i Lesterlin, C. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę oceny filamentacji E. coli i replikacji DNA w przypadku antybiotykoterapii hamującej podziały komórek przy użyciu posiewu do pomiaru żywotności i cytometrii przepływowej do analizy wielkości komórki i zawartości DNA.

Ocena filamentacji indukowanej antybiotykiem w E. coli za pomocą testu posiewu i cytometrii przepływowej

Źródło: Maurakis, S. i Cornelissen, CN Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia procedurę wykrywania powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae hodowanych w warunkach ograniczonej zawartości metali przy użyciu testu punktowego, obejmującego wiązanie ligandów, wykrywanie przeciwciał i wizualizację kolorymetryczną.

Wykrywanie powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae za pomocą Dot Blot

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania wpływu leczenia przeciwbakteryjnego na agregaty Pseudomonas aeruginosa (Pa). Znakowane fluorescencyjnie komórki Pa są hodowane jako agregaty, naśladując wzorzec wzrostu podczas infekcji. Po poddaniu skupiskom subletalnym stężeniem antybiotyku kolistyny, ocena interakcji bakteria-antybiotyk w czasie rzeczywistym jest przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania leczenia przeciwdrobnoustrojowego na agregatach bakteryjnych

Ten film opisuje prosty test pomiaru ATP przy użyciu odczynnika jarzeniowego lucyferazy. Test ten służy do ilościowego określenia przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem.

Test wykorzystania ATP do określania przeżywalności bakterii w przypadku leczenia antybiotykami

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj metodę ilościowego badania wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu testów ATP i barwienia żywych/martwych. Technika ta pozwala ocenić skuteczność ceftriaksonu w warunkach klinicznych.

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

Przeglądaj więcej filmów