Name: Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę projektowania porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów. Technika ta umożliwia bezpieczne i przedłużone uwalnianie NGF w badaniach nad różnicowaniem komórek PC12.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MS i ES dziękują za podstawowe usługi i wsparcie ze strony Centrum Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Lorry I. Lokey oraz wsparcie finansowe Instytutu Nanotechnologii Russell Berrie w Technion.

Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Bar Ilan.
1. Wytwarzanie utlenionych nośników z PSi (PSiO2)
<ol>
	<li>Za pomocą rylca diamentowego potnij płytek krzemowych (Si) (polerowanych jednostronnie na płaszczyźnie &lt;100&gt;, silnie domieszkowanych borem, typu p, 0,95 mΩ·cm) na próbki o wymiarach 1,5 cm × 1,5 cm.</li>
	<li>Utlenij próbki Si w piecu rurkowym w temperaturze 400 °C przez 2 h w powietrzu otoczenia (szybkość nagrzewania: 25 °C/min, chłodzenie naturalne).</li>
	<li>Zanurz próbki Si w roztworze wodnego kwasu fluorowodorowego (HF) (48%), ddH2O i etanolu (99,9%) (1:1:3 v/v/v) na 5 min; następnie trzy razy opłucz próbki etanolem i osusz strumieniem azotu. 
	UWAGA: Roztwór HF przygotowuj i przechowuj wyłącznie w naczyniach plastikowych, ponieważ HF rozpuszcza szkło. 
	OSTRZEŻENIE: HF jest cieczą silnie żrącą i należy z nią obchodzić się z najwyższą ostrożnością. W przypadku kontaktu dokładnie przemyć wodą i zastosować żel przeciwzatrujący do HF; niezwłocznie zasięgnąć pomocy medycznej.</li>
	<li>Zamocuj próbkę Si w politetrafluoroetylenowej celi trawiącej, używając paska folii aluminiowej jako kontaktu tylnego i cewki platynowej jako przeciwelektrody.</li>
	<li>Wytraw warstwę poświęcalną w roztworze wodnego HF i etanolu (99,9%) w stosunku 3:1 (v/v) przez 30 s przy stałej gęstości prądu 250 mA/cm2; następnie trzy razy opłucz powierzchnię powstałej warstwy PSi etanolem i osusz strumieniem azotu.</li>
	<li>Rozpuść świeżo wytrawioną warstwę porowatą w wodnym roztworze NaOH (0,1 M) przez 2 min. Następnie trzy razy opłucz etanolem i osusz strumieniem azotu.</li>
	<li>Zanurz próbkę w roztworze wodnego HF (48%), ddH2O i etanolu (99,9%) (1:1:3 v/v) na 2 min. Następnie trzy razy opłucz etanolem i osusz strumieniem azotu.</li>
	<li>Wytraw elektrochemicznie próbkę Si w roztworze wodnego HF i etanolu (99,9%) w stosunku 3:1 (v/v) przez 20 s przy stałej gęstości prądu 250 mA/cm2; następnie trzy razy opłucz powierzchnię powstałej warstwy PSi etanolem i osusz strumieniem azotu.</li>
	<li>Utlenij termicznie świeżo wytrawione próbki PSi w piecu rurkowym w temperaturze 800 °C przez 1 h w powietrzu otoczenia (szybkość nagrzewania: 25 °C/min, chłodzenie naturalne), aby utworzyć porowaty szkielet SiO2 (PSiO2).</li>
	<li>Nanieś na próbki PSiO2 metodą spin-coatingu grubą pozytywną fotorezystę przy 4000 obr./min przez 1 min; następnie wypal powlekane próbki w temperaturze 90 °C przez 2 min (szybkość nagrzewania: 5 °C/min, chłodzenie naturalne).</li>
	<li>Potnij próbki PSiO2 na kawałki o wymiarach 8 mm × 8 mm za pomocą przecinarki do wafli.</li>
	<li>Aby usunąć fotorezistę, namocz potnij próbki w acetonie przez 3 h; następnie dokładnie opłucz etanolem i osusz strumieniem azotu.</li>
</ol>
2. Ładowanie PSiO2 za pomocą NGF
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór ładunkowy NGF, rozpuścić 20 µg mysiego β-NGF w 400 µL roztworze 1:1 (v/v) 0,01 M soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i ddH2O.</li>
	<li>Nanieść 52 µL roztworu ładunkowego na próbkę PSiO2 i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w zamkniętym naczyniu. 
	UWAGA: Należy utrzymać wysoką wilgotność w naczyniu, aby zapobiec odparowaniu roztworu podczas inkubacji.</li>
	<li>Zebrać roztwór znajdujący się na powierzchni próbki w celu późniejszego oznaczania ilości zawartości NGF w nośniku PSiO2 . 
	UWAGA: Ładowanie NGF do PSiO2 powinno być wykonane bezpośrednio przed planowanym użyciem; protokołu nie można w tym miejscu przerwać ze względu na ryzyko wyschnięcia i denaturacji białka.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie załadowania NGF za pomocą testu ELISA dla NGF
<ol>
	<li>Aby przygotować płytkę ELISA, nanieś 100 µL przeciwciała wychwytującego o stężeniu 0,5 µg/mL (królicze anty-hβ-NGF) do każdego dołka, szczelnie zamknij płytkę i inkubuj przez noc w RT.</li>
	<li>Odsącz zawartość dołków w celu usunięcia cieczy i przemyj płytkę czterokrotnie, używając 300 µL buforu do mycia (0,05% Tween-20 w PBS) na dołek; po ostatnim myciu odwróć płytkę, aby usunąć pozostałości buforu, i osusz ją na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Dodaj 300 µL buforu blokującego (1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) do każdego dołka i inkubuj przez co najmniej 1 h w RT. Następnie odsącz ciecz i przemyj płytkę czterokrotnie zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Aby przygotować krzywą kalibracyjną, rozcieńcz roztwór ładunkowy NGF (patrz krok 2.1) w rozcieńczalniku (0,05% Tween-20, 0,1% BSA w PBS) do stężenia 1 ng/mL. Następnie wykonaj dwukrotne rozcieńczenia seryjne od 1 ng/mL do zera, aby uzyskać próbki do krzywej kalibracyjnej.</li>
	<li>Aby przygotować próbki, rozcieńcz roztwór ładunkowy NGF (z kroku 2.1) oraz zebrany roztwór po ładowaniu (z kroku 2.3) w rozcieńczalniku odpowiednio w stosunkach 1:100 000 i 1:10 000, aby osiągnąć zakres stężeń zestawu ELISA (16-1 000 pg/mL).</li>
	<li>Nanieś 100 µL rozcieńczonych próbek oraz próbek do krzywej kalibracyjnej do każdego dołka w trzech powtórzeniach i inkubuj w RT przez 2 h; następnie odsącz ciecz i przemyj płytkę czterokrotnie zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Dodaj 100 µL przeciwciała detekcyjnego o stężeniu 1 µg/mL (biotynilowane królicze anty-hβ-NGF) do każdego dołka i inkubuj w RT przez 2 h. Następnie odsącz ciecz i przemyj płytkę czterokrotnie zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Rozcieńcz awidynę znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczalniku w stosunku 1:2 000, nanieś 100 µL na dołek i inkubuj przez 30 min w RT. Następnie odsącz ciecz i przemyj płytkę czterokrotnie zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Dodaj 100 µL roztworu substratu do każdego dołka i inkubuj przez 25 min w RT w celu wywołania zabarwienia. Zmierz absorbancję przy 405 nm z korekcją długości fali ustawioną na 650 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Wyznacz stężenie NGF zarówno w roztworze ładunkowym, jak i w zebranym roztworze po ładowaniu na podstawie krzywej kalibracyjnej.</li>
	<li>Aby obliczyć masę NGF załadowaną do nośnika PSiO2, odejmij masę NGF w zebranym roztworze po ładowaniu od masy NGF w roztworze ładunkowym. Wydajność ładowania NGF oblicza się według następującego równania: 
	<img alt="Wzór na wydajność ładowania NGF, schemat, ładowanie białka do nośnika PSiO2, obliczanie wydajności." src="/files/ftp_upload/58982/58982eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
</ol>
4. Uwalnianie NGF z PSiO2 in vitro
<ol>
	<li>Inkubować nośniki PSiO2 obciążone NGF w 2 mL 0,01 M PBS zawierającego 1% (w/v) BSA i 0,02% (w/v) azotku sodu w temperaturze 37 °C przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 100 rpm.</li>
	<li>Co 2 dni pobierać roztwór i zastępować go 2 mL świeżego PBS. Pobrane próbki uwalniania zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.</li>
	<li>Do ilościowego oznaczenia zawartości NGF w próbkach uwalniania należy wykorzystać dostępny komercyjnie test ELISA dla NGF, zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.9. 
	UWAGA: Podczas przygotowywania próbek uwalniania do analizy ELISA należy zastosować różne rozcieńczenia dla poszczególnych punktów czasowych okresu uwalniania (tj. próbki z wcześniejszych punktów czasowych powinny być rozcieńczone znacznie silniej niż próbki z późniejszych punktów). Ponadto dla każdej próbki uwalniania należy wykonać i oznaczyć co najmniej dwa różne rozcieńczenia, aby upewnić się, że stężenia mieszczą się w zakresie pomiarowym zestawu ELISA.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie NGF w próbkach uwalniania na podstawie krzywej kalibracyjnej i sporządzić wykres skumulowanego uwalniania NGF w funkcji czasu.</li>
</ol>
5. Ilościowe oznaczenie erozji Si in vitro za pomocą spektroskopii emisyjnej z indukcyjnie sprzężoną plazmą (ICP-AES)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 mL próbek uwalniania w stosunku 1:10 w buforze do uwalniania (0,01 M PBS zawierający 1% (w/v) BSA i 0,02% (w/v) azotku sodu) do całkowitej objętości 10 mL.</li>
	<li>Monitorować piki emisji atomowej Si przy 212,4, 251,6 i 288,2 nm dla rozcieńczonych próbek.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie Si w próbkach na podstawie krzywej kalibracyjnej.</li>
	<li>Aby ustalić profil degradacji Si, wyrazić zawartość Si w każdym punkcie czasowym jako procent całkowitej zawartości Si w nośnikach (t.j. skumulowaną zawartość Si w całym okresie uwalniania). 
	UWAGA: Aby zapewnić dokładne ilościowe oznaczenie całkowitej zawartości Si w nośnikach, próbki uwalniania pobiera się 1 miesiąc po zakończeniu badania uwalniania i analizuje pod kątem stężenia Si za pomocą ICP-AES. Suma skumulowanej zawartości Si w okresie uwalniania oraz zawartości Si w próbkach pobranych po uwalnianiu stanowi 100% zawartości Si.</li>
</ol>
6. Żywotność i wzrost komórek w obecności nośników Psio2 obciążonych NGF
<ol>
	<li>Kultura komórek feochromocytoma szczura (PC12)
	<ol>
		<li>Przygotować podstawową pożywkę wzrostową, dodając 10% surowicy koni (HS), 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 0,2% amfoterycyny do pożywki Roselle Park Medical Institute (RPMI).</li>
		<li>Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 1% HS, 1% L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 0,2% amfoterycyny do pożywki RPMI.</li>
		<li>Hodować zawiesinę komórkową (106 komórek) w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 cm2 w 10 mL podstawowej pożywki wzrostowej przez 8 dni; co 2 dni dodawać do kolby 10 mL podstawowej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Aby uzyskać kulturę zróżnicowanych komórek PC12, przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania; wirować komórki przez 8 min przy 200 x g w RT. Odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 5 mL świeżej podstawowej pożywki wzrostowej i ponownie wirować komórki przez 5 min przy 200 x g w RT; odrzucić nadsącz i resuspender osad komórkowy w 3 mL podstawowej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Aby rozbić skupiska komórkowe, aspirować komórki dziesięciokrotnie za pomocą strzykawki 23 G.</li>
		<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i wysiać 104 komórek/cm2 powierzchni roboczej na płytkach powlekanych kolagenem typu I w obecności pożywki różnicującej.</li>
		<li>Po 24 h dodać na każdą płytkę świeży mysi β-NGF (50 ng/mL) lub nośnik PSiO2 obciążony NGF. 
		UWAGA: Wyższe stężenia NGF (&gt;50 ng/mL) wykazują taki sam efekt jak stężenie określone w procedurze.</li>
		<li>Wymieniać pożywkę różnicującą co 2 dni.</li>
		<li>Aby ocenić żywotność komórek, dodać 10% (v/v) roztworu wskaźnika żywotności (na bazie rezazuryny) w reprezentatywnych punktach czasowych i inkubować przez 5 h w 37 °C; zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura komórek z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy
	<ol>
		<li>Aby wyizolować DRG z dwóch 7-tygodniowych myszy C57bl, najpierw obmyć myszy 70% etanolem i wykonać nacięcie w celu usunięcia skóry.</li>
		<li>Przeciąć podstawę czaszki oraz mięśnie ściany brzusznej aż do odsłonięcia rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Usunąć kolumnę kręgosłupa, wykonując cięcie na poziomie ud, i oczyścić tkanki otaczające.</li>
		<li>Przeciąć kolumnę na trzy części; następnie przeciąć każdą część w linii środkowej, aby uzyskać dwie połowy, i wydobyć rdzeń kręgowy.</li>
		<li>Pod binokularem wyekstrahować wszystkie zwoje DRG i zanurzyć je w zimnym zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS).</li>
		<li>Oczyścić otaczające tkanki łączną, przypinając DRG do szalki Petriego, i delikatnie usunąć resztki opon pod binokularem.</li>
		<li>Zdysocjować komórki DRG, inkubując je przez 20 min w 1 000 U papainy.</li>
		<li>Wirować komórki przez 4 min przy 400 x g. Odrzucić nadsącz i zachować osad komórkowy.</li>
		<li>Resuspender osad w roztworze zawierającym 10 mg/mL kolagenazy i 12 mg/mL dispazy-II i inkubować przez 20 min w 37 °C.</li>
		<li>Wirować komórki przez 2 min przy 400 x g; odrzucić nadsącz i zachować osad komórkowy.</li>
		<li>Rozbić osad komórkowy w 1 mL HBSS, 10 mM glukozy i 5 mM HEPES (pH 7,35) poprzez wielokrotne przepuszczanie przez zwężoną pipetę Pasteura.</li>
		<li>Delikatnie dodać zdysocjowane komórki do pożywki L-15 zawierającej 20% koloidalnej pożywki na bazie krzemionki w celu separacji komórek metodą wirowania w gradiencie gęstości; wirować przez 8 min przy 1 000 x g. Aspirować nadsącz i zachować osad komórkowy. 
		UWAGA: Celem tego etapu jest oddzielenie i oczyszczenie komórek neuronalnych z resztek aksonalnych, komórek Schwanna i fibroblastów.</li>
		<li>Resuspender osad komórkowy w 2 mL pożywki F-12; wirować przez 2 min przy 1 000 x g; odrzucić nadsącz i resuspender osad w 1 mL pożywki F-12.</li>
		<li>Policzyć komórki i wysiać 2 × 104 komórek na szalkach hodowlanych 35 mm z dnem szklanym, powlekanych poli-L-lizyną i lamininą, w pożywce F-12 bez antybiotyków, uzupełnionej o 10% FBS. 
		UWAGA: Początkowo wysiać komórki w małej objętości pożywki (150-200 µL); po 2 h inkubacji w 37 °C dodać pożywkę do końcowej objętości 2 mL.</li>
		<li>Delikatnie dodać na każdą płytkę nośnik PSiO2 obciążony NGF lub świeży mysi β-NGF (50 ng/mL).</li>
		<li>Po 2 dniach utrwalić kulturę komórkową, inkubując ją z 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) przez 15 min w RT; przeprowadzić immunobarwienie kultury komórek zgodnie z powszechną procedurą barwienia immunofluorescencyjnego31.</li>
		<li>Wykonać obrazowanie kultury komórek neuronalnych za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza różnicowania komórek
<ol>
	<li>Procent różnicowania komórek PC12 w obecności nośników PSiO2 załadowanych NGF
	<ol>
		<li>Inkubować nośniki PSiO2 załadowane NGF w 2 mL pożywki do różnicowania, w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i zawartością 5% CO2.</li>
		<li>Co 2 dni pobierać roztwór i zastępować go 2 mL świeżej pożywki. Pobrane próbki uwalniania zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.</li>
		<li> Wysiewać komórki PC12 na płytki 12-dołkowe powlekane kolagenem zgodnie z instrukcjami w sekcji 4.1 (4.1.3-4.1.6).</li>
		<li>Po 24 h wprowadzić próbki uwalniania z reprezentatywnych punktów czasowych (z sekcji 5.1.2) do poszczególnych dołków; do dołków kontrolnych dodać świeży mysi β-NGF (50 ng/mL).</li>
		<li>Po 24 h obrazować komórki za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
		<li>Aby określić procent komórek z neurytami, ręcznie policzyć komórki, które wykształciły neuryty, w stosunku do całkowitej liczby komórek na obrazach (n = 5 klatek dla każdego dołka); wykreślić wykres procenta komórek PC12 z wypustkami neurytami w czasie. 
		UWAGA: Niedoróżnicowane komórki PC12 mają strukturę zaokrągloną, bez neurytów, podczas gdy komórki różnicujące się można zidentyfikować po obecności neurytów (co najmniej jednego o minimalnej długości równej średnicy somy komórki) lub zmianach morfologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza morfometryczna zróżnicowanych komórek PC12
	<ol>
		<li>W celu przeprowadzenia analizy przetwarzania obrazu pozyskać obrazy fazokontrastowe hodowanych komórek do 3 dni po traktowaniu NGF (jako wolnego odczynnika lub jako produktu uwalniania z nośników PSiO2 załadowanych NGF). 
		UWAGA: W późniejszych punktach czasowych (po 5. dniu) komórki tworzą bardzo złożone sieci, co uniemożliwia pomiary morfometryczne w rozdzielczości pojedynczej komórki.</li>
		<li>Pobrać program do przetwarzania obrazów NeuronJ, wtyczkę do ImageJ, która umożliwia półautomatyczne śledzenie neurytów i pomiar ich długości.</li>
		<li>Konwertować plik obrazu do formatu 8-bitowego i zmierzyć stosunek piksela do mikrometra, korzystając ze skali obrazu.</li>
		<li>Ustawić skalę za pomocą polecenia Analyze | Set Scale i zmierzyć długość każdego neurytu.</li>
		<li>Ręcznie policzyć liczbę punktów rozgałęzień oraz liczbę neurytów wychodzących z każdej somy komórkowej. 
		UWAGA: Średnia długość neurytu 1 dzień po traktowaniu NGF wynosi około 30 µm. Zmierzone długości neurytów mogą wykazywać szeroki rozkład.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Degradowalne nanostrukturalne folie PSiO2 są wytwarzane i wykorzystywane jako nośniki NGF, co pozwala na jego ciągłe i przedłużone uwalnianie, przy jednoczesnym zachowaniu jego aktywności biologicznej. Potencjał PSiO2 do służenia jako system dostarczania NGF wykazano in vitro , wykazując ich zdolność do uwalniania wystarczającej dawki NGF w celu wywołania różnicowania neuronów i promowania wzrostu komórek PC12 i neuronów DRG. Opracowane folie mogą być wykorzystywane jako długoterminowe rezerwuary NGF do przyszłego leczenia in vivo.
Właściwości strukturalne wytworzonych folii PSi zostały dostosowane specjalnie do ładunku NGF; gęstość prądu w procesie trawienia elektrochemicznego dostosowano tak, aby uzyskać wielkość porów około 40 nm, która z łatwością pomieściłaby NGF, białko o masie cząsteczkowej 26,5 kDa32 i charakterystycznej średnicy ~4 nm33, w porowatej matrycy. Ponadto przeprowadzono termiczne utlenianie porowatego rusztowania, aby umożliwić fizyczną adsorpcję NGF poprzez elektrostatyczne przyciąganie dodatnio naładowanego białka do ujemnie naładowanej utlenionej powierzchni PSi. Chemia powierzchni PSi wywiera duży wpływ na skuteczność obciążenia i może być łatwo dostrojona w celu lepszej kontroli interakcji między ładunkiem a porowatą matrycą. Oddziaływania te następnie dyktują strukturę zaadsorbowanych cząsteczek białka i ich bioaktywność 34,35,36. Podsumowując, system został dostosowany w celu uzyskania optymalnego obciążenia NGF poprzez staranny dobór odpowiedniej wielkości porów, charakterystyki powierzchni i idealnego rozpuszczalnika obciążającego, a wynikający z tego efekt wymienionych parametrów decyduje o skuteczności ładowania białka. W związku z tym wszelkie zmiany w parametrach wytwarzania (np. gęstość prądu, czas trawienia, rodzaj i stężenie domieszki lub elektrolitu), chemii powierzchni lub składzie roztworu ładującego mogą wpływać na skuteczność ładowania i bioaktywność załadowanego białka.
Szybkość uwalniania ładunku z hosta PSi lub PSiO2jest na ogół podyktowana kombinacją dwóch jednoczesnych mechanizmów, dyfuzji cząsteczek ładunku i degradacji rusztowania Si37. Na szybkość erozji i późniejszego rozpuszczania ma wpływ miejsce implantacji, jego patologia i stan chorobowy 28,38,39. We wcześniejszych pracach ustalono, że jeśli dla danego zastosowania terapeutycznego wymagana jest inna szybkość uwalniania, profil uwalniania może być modyfikowany i wydłużany poprzez zmianę składu chemicznego powierzchni PSi 38,40,41. Wykazano, że różne modyfikacje chemiczne, takie jak utlenianie termiczne, karbonizacja termiczna i techniki hydrosililacji, stabilizują powierzchnię PSi i wpływają na jej degradację, a w konsekwencji na uwolnienie ładunku 35,42,43,44,45. Co więcej, ładowanie NGF do nośników poprzez kowalencyjne przyłączanie cząsteczek białka do rusztowania Si za pośrednictwem różnych dróg chemii powierzchni powinno skutkować dłuższym uwalnianiem, ponieważ ładunek jest uwalniany tylko wtedy, gdy wiązania kowalencyjne są zerwane lub nośna matryca Si ulega degradacji21.
Ponadto, po procesie wytwarzania, PSi może być renderowany w różnych konfiguracjach oprócz cienkich warstw, takich jak mikrocząstki46, nanocząstki47 lub wolnostojące membrany26, które mogą być również stosowane jako nośniki NGF i spełniać określone potrzeby aplikacji.
Aby zawartość NGF w nośnikach PSiO2 była istotna klinicznie, powinna osiągać zakres dawek terapeutycznych. W metodzie opisanej w protokole nośniki PSiO2 obciążone NGF wprowadza się do stałej objętości 2 ml pożywki komórkowej lub buforu PBS, a zatem stężenie roztworu ładującego i odpowiednią masę załadowaną NGF dostosowano w celu uzyskania uwolnionego stężenia NGF, które jest istotne dla badanego systemu in vitro . W przypadku stosowania tej metody w różnych systemach, takich jak środowiska ex vivo lub in vivo , stężenie roztworu ładującego NGF powinno być zwiększone i dostosowane zgodnie z wymaganą dawką. Alternatywnie, wyższą zawartość NGF można uzyskać, wprowadzając wiele nośników na badany obszar lub stosując większe obszary próbek PSiO2 .
Ponadto należy zauważyć, że w późniejszych punktach czasowych wzdłuż okresu uwalniania uwolnione stężenia NGF są znacznie niższe niż we wcześniejszych punktach czasowych. Fakt, że strumień NGF nie jest stały w czasie, musi być brany pod uwagę podczas projektowania systemu zgodnie z potrzebami aplikacji.
Opracowano i opisano w literaturze liczne systemy dostarczania NGF, większość z nich to systemy oparte na polimerach, składające się z syntetycznych lub naturalnych koniugatów polimerowych 10,11,12,15,16,17. Systemy te wykazały skuteczne profile przedłużonego uwalniania, jednak okres uwalniania trwał kilka dni ze znacznym efektem burst. Niektóre z tych platform dostarczania cierpią z powodu krytycznych ograniczeń, takich jak utrata bioaktywności w procesie enkapsulacji, wymagająca użycia różnych środków stabilizujących18,48, a także wyrafinowanych i złożonych technik wytwarzania16. Jednym z największych wyzwań w projektowaniu systemów dostarczania białek jest zdolność do zachowania bioaktywności cząsteczek po uwięzieniu w układzie nośnikowym. Białka lub peptydy mogą być ładowane do PSi/PSiO2 w temperaturze pokojowej lub nawet w niższych temperaturach bez użycia silnych rozpuszczalników organicznych, które są ważnymi czynnikami podczas ładowania tych wrażliwych biomolekuł. Wcześniejsze badania wykazały, że chemia powierzchni PSi/PSiO2 odgrywa kluczową rolę w minimalizowaniu możliwej denaturacji załadowanych białek35,36. W związku z tym PSi/PSiO2 jest korzystnym nanomateriałem do opracowywania systemów dostarczania czynników wzrostu w ogóle, a NGF w szczególności.
Obecne prace koncentrują się na wykorzystaniu tej metody jako nowego podejścia terapeutycznego do bezpośredniego podawania NGF do OUN w celu potencjalnego leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Nośniki PSiO2 ładowane NGF mogą być wszczepiane do mózgów myszy, a skuteczność platformy jako implantów długoterminowych jest badana in vivo. Co więcej, połączenie tych obiecujących nośników z nieinwazyjnymi biolistami49,50 może umożliwić podawanie naładowanych NGF cząstek PSiO2 w wysoce przestrzennej rozdzielczości do zlokalizowanego obszaru przy użyciu nowatorskiego pneumatycznego pistoletu kapilarnego do leczenia zaburzeń neurodegeneracyjnych, gdzie wymagane jest czasoprzestrzenne podawanie leków. Co więcej, NGF może kierować wzrostem neuronów w sposób gradientu chemicznego51, podobnie jak cząsteczki prowadzące aksony. W ten sposób załadowane nośniki PSiO2 mogą służyć jako atraktujące gorące punkty dla NGF, do kierowania wzrostem, uzupełniając inne sygnały kierujące52,53. Ponadto, nośniki PSiO2mogą być specjalnie dostosowane do podtrzymania dostarczania NGF przez znacznie dłuższy okres czasu, nawet do kilku miesięcy, poprzez dalsze dostrajanie nanostruktury PSiO2 i chemii jej powierzchni.

NGF jest niezbędny do rozwoju i utrzymania neuronów w obwodowym układzie nerwowym (PNS)1 i odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu i funkcjonowaniu neuronów cholinergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)2. Jego wysoki potencjał farmakologiczny w leczeniu ośrodkowych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, został szeroko wykazany, a badania kliniczne są obecnie w toku3,4,5,6. Największym wyzwaniem w dostarczaniu NGF do OUN jest jego niezdolność do przekroczenia bariery krew-mózg (BBB), gdy jest podawany ogólnoustrojowo7. Co więcej, podatność NGF na szybką degradację enzymatyczną sprawia, że jego okres półtrwania jest krótki i znacznie ogranicza jego zastosowanie terapeutyczne8,9. W związku z tym niesproszonym wyzwaniem jest zaprojektowanie systemów dostarczania, które pozwolą na przedłużone i kontrolowane uwalnianie NGF w bezpieczny sposób. Zbadano różne systemy dostarczania NGF, w tym systemy oparte na polimerach10,11,12,13,14,15,16,17. Profile uwalniania tych systemów często charakteryzowały się wyraźnym początkowym wybuchem, po którym następowało powolne ciągłe uwalnianie, gdzie w ostatnim etapie szybkość uwalniania była znacznie niska w porównaniu z początkową serią11,18,19. Ponadto zaobserwowano inaktywację białka przez kwaśne produkty degradacji polimerów (np. kwas poli(mlekowo-ko-glikolowy)) lub utratę bioaktywności NGF podczas procesu enkapsulacji w tym systemie20.
Nanostrukturalna PSi charakteryzuje się kilkoma atrakcyjnymi właściwościami, w tym dużą powierzchnią, dużą porowatą objętością, biokompatybilnością i możliwością adaptacji płynów ustrojowych, co predestynuje ją do obiecującej platformy dostarczania leków21,22,23,24,25,26,27,28. Odpowiedni dobór warunków anodowania pozwala w łatwy sposób dostosować właściwości strukturalne PSi (np. porowatość i wielkość porów) w celu dostosowania kinetyki ładowania i uwalniania leku21,27. Co więcej, różne dogodne drogi chemiczne pozwalają modyfikować powierzchnię PSi, a tym samym dalej dostroić szybkość rozpuszczania rusztowania Si w warunkach fizjologicznych oraz szybkość uwalniania leku22,24,29,30.
Ta praca skupia się na projektowaniu systemu dostarczania opartego na PSi do długotrwałego kontrolowanego uwalniania NGF. Wpływ nośników NGF-PSi na różnicowanie i wzrost neuronów bada się przy użyciu komórek PC12 i zdysocjowanych neuronów DRG. Wykazaliśmy, że obciążony NGF zachował swoją bioaktywność poprzez indukcję wzrostu neurytów i głębokiego różnicowania przez 1-miesięczny okres uwalniania w ciągu jednego podania.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Gadot</td><td>830101375</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-028-1B</td><td></td></tr><tr><td>Wodny HF (48%)</td><td>Merck</td><td>101513</td><td></td></tr><tr><td>AZ4533 fotorezystuł</td><td>Metal Chem, Inc.</td><td>AZ4533</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja BSA v</td><td>MP biomedicals</td><td>0216006950</td><td></td></tr><tr><td>roztwór BSA (10%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-010-1B</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu l</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>Collagenase</td><td>Enco</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego powlekane kolagenem</td><td>NUNC Thermanox</td><td>1059846</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G8170</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-II</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty myszy IgG H& L sprzężony Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol (99,9%)</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1A</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd/aldehyd glutarowy (2,5%) w 0,1 M kakodylan sodu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15949</td><td></td></tr><tr><td>Freon</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>613894</td><td></td></tr><tr><td>Guanidyna-HCl</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G7294</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza Ham's F-12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185-045</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Biological Industries</td><td>04-124-1A Zestaw rozwojowy</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Human &beta;-NGF</td><td>Peprotech</td><td>900-K60</td><td></td></tr><tr><td>Immumount roztwór</td><td>Thermo Scientific 9990402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>L5520</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty neurofilamentowe H (NF-H) (przeciwciało fosforylowane)</td><td>BiolLegend</td><td>SMI31P</td><td></td></tr><tr><td>Mysi &beta;-NGF</td><td>Peprotech</td><td>450-34-20</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>p-4762</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa BN15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>otrzymany przez rozpuszczenie 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O, 18 M&Omega;).</td></tr><tr><td>PBS X10</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa PC12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>p1644</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik PrestoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Wafel Si</td><td>Siltronix Corp. </td><td></td><td>Wysoce domieszkowany B, typ p, rezystywność 0,00095 &Omega;-cm, < 100> zorientowany</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chem-Impex International Inc.</td><td>Rok 1279</td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Pomimo ogromnego potencjału NGF w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, jego terapeutyczne podawanie stanowi poważne wyzwanie, ponieważ białko nie przekracza bariery krew-mózg, ze względu na swoje właściwości chemiczne, a zatem wymaga długotrwałego dostarczania do mózgu, aby uzyskać efekt biologiczny. Praca ta opisuje wytwarzanie nanostrukturalnych folii PSi jako degradowalnych nośników NGF w celu trwałego dostarczania tego wrażliwego białka. Nośniki PSi są specjalnie dostosowane do uzyskania wysokiej skuteczności ładowania i ciągłego uwalniania NGF przez okres czterech tygodni, przy jednoczesnym zachowaniu jego aktywności biologicznej. Zachowanie nosicieli NGF-PSi jako systemu dostarczania NGF jest badane in vitro, badając ich zdolność do indukowania różnicowania neuronów i wzrostu komórek PC12 i zdysocjowanych neuronów DRG. Oceniana jest żywotność komórek w obecności schludnych i obciążonych NGF nośników PSi. Bioaktywność NGF uwalnianego z nośników PSi jest porównywana z konwencjonalnym leczeniem powtarzających się wolnych dawek NGF. Różnicowanie komórek PC12 jest analizowane i charakteryzowane przez pomiar trzech różnych parametrów morfologicznych zróżnicowanych komórek; (i) liczbę neurytów ekstrahujących z somy, (ii) całkowitą długość neurytów oraz (iii) liczbę punktów rozgałęzień. Komórki PC12 poddane działaniu nośników NGF-PSi wykazują głębokie zróżnicowanie w całym okresie uwalniania. Co więcej, komórki neuronalne DRG hodowane za pomocą nośników NGF-PSi wykazują rozległą inicjację neurytów, podobnie jak neurony traktowane powtarzającymi się wolnymi dawkami NGF. Badane przestrajalne nosiciele demonstrują długoterminowe implanty do uwalniania NGF o potencjale terapeutycznym w chorobach neurodegeneracyjnych.

Utlenione filmy PSi są wytwarzane zgodnie z opisem w protokole. Wafer Si poddawany jest trawieniu elektrochemicznemu przez 20 s przy natężeniu 250 mA/cm2 (Rycina 1ai), a następnie utlenianiu termicznemu w temperaturze 800 °C (Rycina 1aii>) w celu otrzymania rusztowania PSiO2. Obrazy z wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej (HR-SEM) otrzymanego filmu PSiO2 przedstawiono na Rycini 1b, c. Mikrografia filmu z widoku z góry (Rycina 1b>) obrazuje jego wysoce porowatą strukturę z porami o średnicy około 40 nm. Mikrografia przekroju przełamanego filmu (Rycina 1c>) wykazuje grubość warstwy porowatej wynoszącą 2,9 µm, charakteryzującą się obecnością połączonych ze sobą porów cylindrycznych.
Filmy PSiO2 są nasycane roztworem ładującym NGF, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1aiii. Ilość załadowanego NGF jest określana za pomocą testu ELISA dla NGF poprzez pomiar stężeń NGF w roztworze ładującym przed i po inkubacji z filmami PSiO2. Średnia masa załadowanego NGF na jeden film PSiO2 została określona na 2,8 ± 0,2 µg, co odpowiada wysokiej wydajności ładowania na poziomie 90% (w/w) (dane nie przedstawiono31). W celu ustalenia profilu uwalniania NGF z nośników PSiO2, nasycone filmy inkubuje się w PBS w temperaturze 37 °C, a co 2 dni pobiera się aliquoty do ilościowego oznaczenia stężenia uwolnionego białka za pomocą testu ELISA dla NGF. Dodatkowo, zawartość Si w próbkach uwalniania jest oznaczana metodą ICP-AES, co pozwala na ustalenie kinetyki erozji Si nośników PSiO2. Rysunek 2 przedstawia profile uwalniania NGF oraz odpowiadającą im degradację Si w porowatych nośnikach. Uzyskano przedłużone uwalnianie NGF, bez efektu gwałtownego wyrzutu (burst effect), przez okres 1 miesiąca. Uwalnianie NGF w pierwszym tygodniu jest szybsze (nachylenie = 0,442) w porównaniu do znacznie wolniejszego uwalniania w późniejszych dniach okresu uwalniania (nachylenie 0,043). Należy zauważyć, że przez cały miesięczny okres uwalniania ilość uwolnionego NGF jest wystarczająca do indukcji głębokiego różnicowania komórek PC12, co zostanie omówione w dalszej części. Stwierdzono, że skumulowana ilość uwolnionego NGF wykazuje dobrą korelację (R2 = 0,971) z pozostałą zawartością Si, co pokazano na wstawce na Rysunku 2.
Następnie charakteryzuje się in vitro bioaktywność nośników PSiO2 obciążonych NGF, wykorzystując komórki PC12 oraz neurony DRG jako modele różnicowania i wzrostu neuronalnego. Komórki PC12 oraz dysocjowane neurony DRG wysiewa się zgodnie z opisem w protokole. Najpierw badano żywotność komórek w obecności nośników PSiO2, inkubując je z czystym (nieobciążonym) lub obciążonym NGF PSiO2; płytki kontrolne oraz komórki traktowane czystym PSiO2 uzupełniano wolnym NGF co 2 dni. Nie zaobserwowano cytotoksyczności po wystawieniu komórek na działanie czystych lub obciążonych NGF nośników PSiO2 (Rycina 3a), co dowodzi biokompatybilności PSiO2 z tą linią komórkową. Rycina 3b przedstawia reprezentatywne mikrofotografie HR-SEM komórek PC12 traktowanych nośnikami PSiO2 obciążonymi NGF. Obserwowane komórki emitują neuryty i tworzą charakterystyczne, rozgałęzione sieci neuronalne. Podobne wyniki uzyskano podczas wysiewu dysocjowanych komórek neuronalnych DRG w obecności nośników PSiO2 obciążonych NGF. Obrazy konfokalne immunobarwionych komórek DRG hodowanych z nośnikami PSiO2 obciążonymi NGF (Rycina 3e) wykazują intensywną inicjację i elongację neurytów, podobnie jak w kontroli pozytywnej (t.j. neurony uzupełnione wolnym NGF, patrz Rycina 3d), podczas gdy kontrola negatywna (t.j. neurony nieleczone, patrz Rycina 3c) wykazuje słaby stopień wzrostu neurytów.
Aby ocenić procent różnicowania komórek PC12 w obecności NGF uwalnianego z nośników PSiO2, stopień różnicowania określa się poprzez zliczenie komórek z wypustkami neurytowymi w stosunku do całkowitej populacji komórek. Rysunek 4 podsumowuje wyniki w formie procentowego udziału komórek różnicujących się w różnych punktach czasowych w okresie 26 dni. Znaczące wartości procentowe różnicowania osiągnięto przez cały badany czas. Warto zauważyć, że po 26 dniach uwolniony NGF indukował różnicowanie powyżej 50%, co jest wartością znacznie wyższą w porównaniu do poprzednich badań z zastosowaniem nośników polimerowych16. Wyniki te wskazują, że uwięzienie NGF w porowatym gospodarzu pozwoliło zachować aktywność biologiczną białka w zakresie indukowania głębokiego różnicowania przez okres około 1 miesiąca.
Aby dokładniej zbadać wpływ nośników NGF-PSiO2 na różnicowanie neuronalne, w pojedynczych zróżnicowanych komórkach PC12 mierzy się trzy charakterystyczne parametry morfologiczne: (i) liczbę neurytów wyrastających z somy, (ii) całkowitą długość neurytów oraz (iii) liczbę punktów rozgałęzień. Komórki poddaje się działaniu nośników PSiO2 obciążonych NGF lub, w ramach kontroli, powtarzanemu podawaniu wolnego NGF (co 2 dni). Rysunek 5a-c przedstawia analizę morfometryczną populacji komórek w 1. i 3. dniu. Komórki PC12 traktowane nośnikami PSiO2 obciążonymi NGF wykazują wartości morfometryczne podobne do grupy kontrolnej dla wszystkich trzech badanych parametrów. Po 3 dniach obserwuje się wzrost wartości wszystkich parametrów morfologicznych w tym samym tempie zarówno dla nośników PSiO2 obciążonych NGF, jak i w grupie kontrolnej z powtarzanym podawaniem wolnego NGF.
<img alt="Trawienie wafla krzemowego do porowatego SiO2-NGF, obrazy SEM pokazują strukturę filmu dla analizy materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wytwarzanie filmów PSiO2. (a) Schemat wytwarzania nośników PSiO2: (i) wafel krzemowy poddawany jest trawieniu elektrochemicznemu przez 20 s przy 250 mA/cm2, następnie (ii) utlenianiu termicznemu w 800 °C w celu wytworzenia rusztowania PSiO2 oraz (iii) obciążaniu NGF poprzez adsorpcję fizyczną (schematy nie są zachowane w skali).(b-c) Mikrografie elektronowe z widokiem z góry oraz w przekroju charakterystycznego filmu PSiO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zawartości krzemu w funkcji czasu; uwalnianie NGF; analiza danych; pokazana korelacja statystyczna (R²=0,971)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Profile uwalniania NGF i erozji Si w nośnikach PSiO2 obciążonych NGF. Stopień degradacji nośników PSiO2 przedstawiono jako ułamek pozostałej zawartości Si w każdym punkcie czasowym w stosunku do całkowitej zawartości Si w porowatej warstwie. Wstawka pokazuje korelację między skumulowanym uwalnianiem NGF a pozostałą zawartością Si. Słupki błędów reprezentują SD, n=3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy żywotności komórek wraz z obrazami z mikroskopii przedstawiającymi wzrost neuronów pod wpływem działania NGF-PSiO₂." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Żywotność i wzrost komórek w obecności nośników PSiO2 obciążonych NGF. (a) In vitro charakterystyka cytotoksyczności. Żywotność komórek PC12 mierzono w 1., 3. i 7. dniu po ekspozycji na czyste (nieobciążone) nośniki PSiO2, nośniki PSiO2 obciążone NGF lub wolny NGF (50 ng/mL co 2 dni, płytki kontrolne). (b) Mikrografie elektronowe komórek PC12 hodowanych z nośnikami PSiO2 obciążonymi NGF przez 9 dni. Panel lewy: powiększenie, przedstawiające wyrastanie neurytów z somy komórki; panel prawy: widok ogólny, wskazujący na utworzoną, wysoce złożoną sieć neuronalną. (c-e) Obrazy z mikroskopii konfokalnej immunobarwionej hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) (2 dni po wysianiu): (c) komórki nieleczone; (d) komórki uzupełnione wolnym NGF (50 ng/mL); (e) nośniki NGF-PSiO2. Immunofluorescencyjne barwienie neurofilamentu H umożliwia obrazowanie somy komórkowej i wyrastających neurytów. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wzrostu neurytów komórek PC12; obrazy z mikroskopii; porównanie wpływu traktowania NGF-PSiO₂ w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wartości procentowe różnicowania komórek PC12 po ekspozycji na NGF uwalniany z nośników PSiO2 obciążonych NGF w reprezentatywnych punktach czasowych. Procent różnicowania wyrażono jako liczbę komórek z wypustkami neurytowymi w stosunku do całkowitej populacji komórek. Traktowanie kontrolne odnosi się do komórek suplementowanych wolnym NGF (50 ng/mL). Wzdłuż osi x przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek z mikroskopii świetlnej w różnych punktach czasowych; pasek skali = 25 µm dla mikrografii z dni 2, 8, 14, 26 oraz 50 µm dla mikrografii kontrolnej. Słupki błędów reprezentują SD, n=3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzrostu neurytów; wykresy słupkowe długości, liczby i rozgałęzień neurytów, dzień 1 vs dzień 3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza morfometryczna zróżnicowanych komórek PC12. Pomiar trzech parametrów morfologicznych zróżnicowanych komórek PC12 na poziomie pojedynczej komórki, w 1. i 3. dniu po ekspozycji na nośniki PSiO2 obciążone NGF lub powtarzalnej administracji wolnego NGF co 2 dni (kontrola); (a) całkowita długość neurytów, (b) liczba neurytów wyrastających z somy komórkowej oraz (c) liczba punktów rozgałęzień. Słupki błędów reprezentują SD, n=3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i wytwarzania nanostrukturalnych porowatych folii krzemowych (PSi) jako degradowalnych nośników dla czynnika wzrostu nerwów (NGF). Różnicowanie neuronalne i wzrost komórek PC12 i neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) myszy są charakteryzowane po leczeniu nośnikami PSi załadowanymi NGF.

Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Dostarczenie NGF do mózgu jest trudne. Przedstawiamy tutaj nowy typ nośnika, który umożliwia bezpieczne i przedłużone uwalnianie bioaktywnego białka. Technika ta pozwala na proste i wydajne ładowanie NGF do porowatych krzemowych nośników.Proces ten jest przeprowadzany w temperaturze pokojowej, bez użycia silnych rozpuszczalników organicznych. Ponieważ konstrukcja porowatego nośnika krzemowego jest regulowana, nośniki te mogą służyć jako implanty będące rezerwuarem NGF do długotrwałego uwalniania, ale mogą być również modyfikowane w celu transportu innych czynników i leków. Dla inżynierów i chemików proces wytwarzania może być łatwiejszy do przeprowadzenia.W przypadku biologów i klinicystów procedury hodowli komórek powinny być stosunkowo łatwe do odtworzenia. Należy rozpocząć od zamontowania płytki krzemowej o wymiarach 1,5 na 1,5 cm o dobrze określonej rezystywności w komorze trawnej wykonanej z politetrafluoroetylenu, używając paska folii aluminiowej jako kontaktu tylnego oraz o-ringu do uszczelnienia komory. Metoda ta jest powtarzalna przy każdym użyciu płytek krzemowych o podobnych wartościach rezystywności.Poddaj próbkę krzemu trawieniu elektrochemicznemu w roztworze bezwodnego kwasu fluorowodorowego i etanolu w stosunku trzy do jednego przez 20 sekund przy stałej gęstości prądu 250 mA/cm². Następnie przemyj powierzchnię powstałej porowatej warstwy krzemu trzykrotnie etanolem przed osuszeniem strumieniem azotu. Po wyschnięciu próbki poddaj świeżo wytrawiony porowaty krzem utlenianiu termicznemu w piecu rurowym w temperaturze 800 °C przez jedną godzinę w powietrzu otoczenia, aby utworzyć utleniony szkielet porowatego krzemu.Po ostygnięciu próbki należy użyć piły precyzyjnej, aby wyciąć z niej fragment o wymiarach 8 × 8 mm. W celu załadowania próbek NGF, należy nanieść 52 µL świeżo przygotowanego roztworu ładującego NGF na wierzch każdej próbki i inkubować je przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w przykrytej szalce, w warunkach wysokiej wilgotności. Po dwóch godzinach należy zebrać roztwór znajdujący się na wierzchu próbek, a następnie rozcieńczyć roztwór ładujący NGF oraz zebrane próbki roztworu poladowania do odpowiedniego zakresu stężeń przewidzianego dla zestawu ELISA.Po rozcieńczeniu wszystkich próbek, nanieś 100 µL rozcieńczonych próbek oraz próbek krzywej kalibracyjnej do każdego dołka płytki 96-dołkowej do testu ELISA pokrytej przeciwciałem wychwytującym NGF i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przemyj płytkę cztery razy, a następnie dodaj do każdego dołka 100 µL biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego o stężeniu 1 µg/mL i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po czterokrotnym przemyciu, zgodnie z instrukcją, dodaj do każdego dołka 100 µL awidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj płytkę cztery razy buforem do mycia, zgodnie z instrukcją.Po ostatnim płukaniu do każdego dołka należy dodać 100 µL roztworu substratu i inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej w celu wywołania reakcji barwnej. Następnie, przy użyciu czytnika mikropłytek, należy zmierzyć absorbancję przy 405 nm z korekcją długości fali ustawioną na 650 nm i wyznaczyć stężenie NGF w roztworze ładującym oraz w zebranym roztworze po ładowaniu na podstawie krzywej kalibracyjnej. W przypadku badania uwalniania NGF in vitro, utlenione porowate nośniki krzemowe załadowane NGF należy inkubować w 2 mL 0,01 M PBS uzupełnionego o 1% albuminy surowicy bydlęcej w 0,02% azotku sodu w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min agitacji orbitalnej.Zbieraj roztwór co dwa dni, zastępując go po każdej aspiracji dwoma mililitrami świeżego PBS. Następnie zamroź zebrane próbki uwalniania w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy NGF metodą ELISA, zgodnie z wcześniejszą prezentacją. Aby uzyskać kulturę zróżnicowanych komórek feochromocytoma 12 lub PC 12, zbierz zawiesinę komórkową poprzez wirowanie i resuspenduj komórki w pięciu mililitrach świeżej podstawowej pożywki wzrostowej.Po drugim wirowaniu zawiesić ponownie podniebienie w trzech mililitrach podstawowej pożywki wzrostowej i użyć strzykawki o rozmiarze 23 G, aby 10 razy zassać komórki w celu rozbicia skupisk komórkowych. Po policzeniu wysiać 1 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy powierzchni roboczej na płytkach powlekanych kolagenem typu I w obecności pożywki różnicującej. Umieścić płytki w inkubatorze.Po 24 godzinach w temperaturze 37°C do każdej płytki dodaj świeży mysi beta NGF lub porowaty nośnik krzemowy z załadowanym NGF, a następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze. Aby ocenić żywotność komórek, inkubuj hodowle z 10% odpowiednim roztworem wskaźnika żywotności w reprezentacyjnych punktach czasowych przez pięć godzin w temperaturze 37°C i zmierz absorbancję za pomocą spektrofotometru przy 490 nm z korekcją długości fali ustawioną na 630 nm. Aby ocenić różnicowanie komórek PC 12 w obecności porowatych nośników krzemowych z załadowanym NGF, wysiej komórki PC 12 na 12 płytek powlekonych niskokolagenowym białkiem na 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych, a następnie wprowadź wcześniej uzyskane próbki uwolnione in vitro do odpowiednich studni eksperymentalnych.Po 24-godzinnej inkubacji obrazuj komórki za pomocą mikroskopii świetlnej i ręcznie policz liczbę komórek z neurytami w każdej studzience. W celu analizy morfometrycznej zróżnicowanych komórek PC 12 wykonaj obrazy w kontraście fazowym hodowanych komórek do trzech dni po traktowaniu NGF, a następnie otwórz pliki w programie Neuron J. Konwertuj plik obrazu do formatu ośmiobitowego i użyj paska skali obrazu, aby wyznaczyć stosunek pikseli do mikrometrów. Użyj funkcji Analyze i Set Scale, aby ustawić skalę oraz zmierzyć długość każdego neurytu.Następnie ręcznie policz liczbę punktów rozgałęzień oraz liczbę neurytów wychodzących z każdego somy komórki. Przedstawiono obrazy z wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej otrzymanej utlenionej porowatej warstwy krzemu. Mikrografia warstwy z widoku z góry ujawnia jej wysoce porowatą strukturę z porami o średnicy około 40 nanometrów.Mikrografia przekroju poprzecznego oddzielonej warstwy wykazuje grubość warstwy porowatej wynoszącą 2,9 µm, która charakteryzuje się obecnością połączonych ze sobą porów cylindrycznych. Osiągnięto przedłużone uwalnianie NGF bez efektu gwałtownego wyrzutu w okresie jednego miesiąca, przy czym w pierwszym tygodniu uwalnianie NGF przebiegało szybciej w porównaniu do znacznie wolniejszego tempa uwalniania w późniejszych dniach okresu uwalniania. Leczenie z użyciem porowatych nośników krzemowych obciążonych NGF indukuje tworzenie neurytów w charakterystycznych, rozgałęzionych sieciach neuronalnych w hodowlach komórek PC 12.Należy zauważyć, że nawet po 26 dniach uwalniany NGF indukuje różnicowanie komórek na poziomie powyżej 50%, co wskazuje, że zamknięcie NGF wewnątrz porowatego nośnika zachowuje aktywność biologiczną białka przez okres około jednego miesiąca. Analiza morfometryczna populacji komórek traktowanych porowatym krzemem obciążonym NGF w pierwszym i trzecim dniu wykazuje, że komórki PC 12 traktowane porowatym krzemem obciążonym NGF wykazują wartości morfometryczne zbliżone do tych obserwowanych w kulturach kontrolnych dla wszystkich trzech badanych parametrów. Odpowiednie i dokładne wykonanie przedstawionych kroków pozwoli na uzyskanie korzystnego systemu dostarczania NGF, zdolnego do podtrzymywania przeżycia i różnicowania komórek neuronalnych.Obecnie badamy wykorzystanie porowatych nośników krzemowych z NGF jako implantów uwalniających substancję w sposób długotrwały w mózgu, aby zbadać ich normalny efekt ochronny oraz poznać choroby degeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera. Po zastosowaniu tej procedury można również zbadać wpływ porowatych nośników krzemowych z NGF na prawidłowy wzrost komórek z zwojów korzeni grzbietowych. Porowaty krzem jest obiecującym nanomateriałem, który może być wykorzystywany w szerokim zakresie zastosowań.Inne niż przedstawione tutaj, w tym czujniki biologiczne lub chemiczne, diagnostyka i obrazowanie. Aby wykluczyć potencjalną toksyczność porowatych nośników krzemowych względem stosowanej linii komórkowej, należy przeprowadzić test żywotności oraz wysterylizować próbki porowatego krzemu.

designing-porous-silicon-films-as-carriers-of-nerve-growth-factor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

W niniejszej pracy opisujemy prostą metodę wzorowania wolnego od tlenków krzemu i germanu za pomocą reaktywnych monowarstw organicznych oraz demonstrujemy funkcjonalizację wzorowanych podłoży małymi cząsteczkami i białkami. Podejście to zapewnia całkowitą ochronę powierzchni przed utlenianiem chemicznym, umożliwia precyzyjną kontrolę nad morfologią struktur oraz zapewnia łatwy dostęp do wzorów rozróżnialnych chemicznie.

Funkcjonalizacja i wzorowanie krzemu oraz germanu beztlenkowego metodą miękkiej litografii

Źródło: Rosenberg, M., et al. Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie degradowalnej nanostrukturalnej porowatej folii krzemowej (PSi) do przedłużonego uwalniania czynnika wzrostu nerwów (NGF) w celu wspierania różnicowania komórek PC12. NGF jest adsorbowany na porach folii poprzez oddziaływania elektrostatyczne i jest stopniowo uwalniany do mediów w wyniku dyfuzji i degradacji rusztowania. To...

Trwałe dostarczanie czynnika wzrostu nerwów za pomocą porowatego filmu krzemowego w komórkach guz chromochłonnego szczura 12

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

W tym manuskrypcie demonstrujemy przygotowanie biohybrydowego hydrożelowego biotuszu zawierającego grafen do użycia w inżynierii tkanek obwodowych. Za pomocą tego biohybrydowego materiału 3D przeprowadzany jest protokół różnicowania neuronalnego komórek macierzystych. Może to być ważny krok w kierunku wprowadzenia podobnych biomateriałów do kliniki.

Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

Poznaj metodę projektowania porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów. Technika ta umożliwia bezpieczne i przedłużone uwalnianie NGF w badaniach nad różnicowaniem komórek PC12.

Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Przeglądaj więcej filmów