Name: Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Poznaj metodę unieruchamiania żywych nicieni Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipu polidimetylosiloksanowego z retencją wody. Technika umożliwia precyzyjną mikrofalową radiację, długoterminową obserwację zachowań oraz wielokrotne użycie chipu w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Atsushi Higashitani za uprzejme rady dotyczące leczenia C. elegans oraz dr Yuya Hattori, Yuichiro Yokota i Yasuhiko Kobayashi za cenne dyskusje. Autorzy dziękują Centrum Genetycznemu Caenorhabditis za dostarczenie szczepów C. elegans i E. coli. Dziękujemy załodze cyklotronu TIARA w QST-Takasaki za życzliwą pomoc w eksperymentach z napromienianiem. Dziękujemy dr Susan Furness za zredagowanie szkicu tego manuskryptu. Badanie to było częściowo wspierane przez KAKENHI (Granty Numery JP15K11921 i JP18K18839) od JSPS do M.S.

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
<li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li>
<li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li>
<li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li>
<li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li>
<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li>
<li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li>
<li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).</li>
<li>Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf">https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf</a> (2018).</li>
<li>Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-moulded+substrates+for+the+analysis+of+structure-dependent+behaviour+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes.</a> Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Immobilizacja C. elegans w warunkach żywych przy użyciu zwilżalnego chipa mikroprzepływowego PDMS umożliwia wydajne, ukierunkowane napromienianie mikrowiązką wielu zwierząt. Łatwość obsługi i funkcje zapobiegające wysuszaniu sprawiają, że system ten nadaje się nie tylko do zastosowań w napromienianiu mikrowiązką, ale także w kilku testach behawioralnych. Te arkusze robaków zostały już skomercjalizowane i można je łatwo zdobyć. Konwencjonalne chipy mikroprzepływowe, takie jak chipy węchowe, wiążą się z problemami...

Promieniowanie, w tym promieniowanie rentgenowskie, gamma i wiązka ciężkich jonów, jest szeroko stosowane do zastosowań biologicznych, takich jak diagnozowanie i leczenie nowotworów oraz do hodowli wiązki jonów. Liczne badania i osiągnięcia techniczne koncentrują się obecnie na skutkach promieniowania1,2,3. Napromienianie mikrowiązką jest skutecznym sposobem identyfikacji miejsc wrażliwych na promieniowanie w organizmach żywych4. Takasaki Advanced Radiation Research Institute of National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki) opracowuje technologię napromieniania pojedynczych komórek pod obserwacją mikroskopową przy użyciu mikrowiązek ciężkich jonów5 i opracował metody umożliwiające celowane naświetlanie mikrowiązką kilku zwierząt modelowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans4,6, silkworms7, oraz Oryzias latipes (japońska medaka)8. Ukierunkowane naświetlanie mikrowiązką nicienia C. elegans pozwala na skuteczne zniszczenie określonych obszarów, takich jak pierścień nerwowy w okolicy głowy, pomagając w ten sposób zidentyfikować rolę tych układów w procesach takich jak poruszanie się.
Opracowano metodę unieruchamiania C. elegans na chipie bez potrzeby znieczulenia, aby umożliwić naświetlanie mikrowiązką4. Ponadto, aby ulepszyć chipy mikroprzepływowe użyte w poprzednim badaniu4, niedawno opracowaliśmy zwilżalne, przenikające jony, mikroprzepływowe chipy z polidimetylosiloksanu (PDMS), określane jako arkusze ślimakowe (patrz Tabela materiałów), do unieruchamiania osobników C. elegans9. Składają się one z ultracienkich miękkich arkuszy (grubość = 300 μm; szerokość = 15 mm; długość = 15 mm) z wieloma (20 lub 25) prostymi kanałami mikroprzepływowymi (głębokość = 70 μm; szerokość = 60 μm lub 50 μm; długość = 8 mm) na powierzchni (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A-D). Kanały mikroprzepływowe są otwarte i pozwalają na zamknięcie w nich wielu zwierząt jednocześnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Arkusze są sprężyste, aby umożliwić rozszerzenie kanałów mikroprzepływowych (o ~10%, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F), a elastyczność pozwala na delikatne otulenie zwierząt. Ponadto, dzięki zdolności samoadsorpcji PDMS, zwierzęta mogą być zamykane w kanałach poprzez pokrycie powierzchni arkusza ślimaka cienką folią ochronną, w której zwierzęta nie są wpychane do kanałów do obudowy. Odwracając folię okrywową, możemy w łatwy sposób zebrać zwierzęta.
Kanały nie szkodzą robakom, gdy są zamknięte lub gdy są zbierane. Ponadto arkusze są wykonane z PDMS, który jest zasadniczo hydrofobowy, ale retencję wody można osiągnąć poprzez nadanie materiałowi hydrofilowości. Retencja wody i grubość są korzystnymi cechami arkuszy ślimakowych. Zdolność zatrzymywania wody zapobiega odwodnieniu zwierząt po długotrwałym unieruchomieniu i umożliwia prowadzenie długotrwałych obserwacji.
Ponadto, jak opisano wcześniej9, arkusze mają tylko 300 μm grubości, co pozwala ciężkim jonom, takim jak jony węgla (o zasięgu około 1 mm w wodzie), przechodzić przez arkusz otaczający zwierzęta. Pozwala to na wykrycie cząstek jonów i dokładny pomiar zastosowanej dawki promieniowania. Co więcej, arkusze ślimakowe mogą być ponownie wykorzystane, a tym samym są ekonomiczne. W przypadku konwencjonalnej metody iniekcji zamknięte zwierzęta są czasami martwe i nie można ich wyjąć z kanału; Ich jaja mogą również zatykać kanały. To sprawia, że chip nie nadaje się do użytku. W związku z tym chipy są w zasadzie jednorazowego użytku, a stosunek kosztów do korzyści jest słaby.
W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy szereg metod unieruchamiania żywych osobników C. elegans na chipie za pomocą arkuszy robaków. Poprzez testy lokomocji zwierząt 3 godziny po unieruchomieniu na chipie, oceniliśmy odpowiednią folię osłonową. Ponadto pokazaliśmy przykłady unieruchomienia na chipie zarówno dla obserwacji obrazowych, jak i naświetlania mikrowiązką.

<table><tbody><tr><td>C. elegans szczep typu dzikiego</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>N2</td><td>Szczep C. elegans powszechnie stosowany w tym badaniu</td></tr><tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutant szczep</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA</td><td>CB4845</td><td>Szczep C. elegans stosowany tylko jako przykład mutantów o nieprawidłowym kształcie ciała&nbsp;</td></tr><tr><td>C. elegans transgeniczny szczep HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>HBR4</td><td>Genotyp tego transgenicznego szczepu C. elegans to HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&ndash; 3' utr, UNC-119(+)]V. Szczep ten został wykorzystany tylko do obserwacji obrazowej.</td></tr><tr><td>Szczep E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA</td><td>Szczep OP50</td><td>E. coli stosowany jako pokarm dla C. elegans</td></tr><tr><td>Worm Sheet IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japonia</td><td>BCM17-0001</td><td>Układ mikroprzepływowy z 25 prostymi 50/60-&mikro; m szerokości kanałów używanych we wszystkich eksperymentach i obserwacjach w tym artykule&nbsp;</td></tr><tr><td>Arkusz robaka 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japonia</td><td>BCM18-0001</td><td>Układ mikroprzepływowy z 20 prostymi 60 i mikro; Kanały o szerokości m. Jest to możliwe do zlokalizowania dla dorosłych 3-5 dni po wykluciu w temperaturze 20&nbs;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Arkusz ślimakowy 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japonia</td><td>BCM18-0002</td><td>Układ mikroprzepływowy z 20 prostymi 50 & mikro; Kanały o szerokości m. Jest to możliwe do zlokalizowania dla dorosłych ~ 3 dni po wykluciu w temperaturze 20& stopni C.&nbsp;</td></tr><tr><td>SZKŁO Z MIKRO POKRYWĄ</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Szkło nakrywkowe (grubość: 130-170 &mikro; m) stosowany w testach lokomocji w Protokole 3</td></tr><tr><td>Folia polistyrenowa</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japonia</td><td>BCM18-0001 / BCM18-0002</td><td>Dołączone elementy arkuszy robaków. PS filim (grubość: ~130 &mikro; m) stosowane w testach lokomocji w Protokole 3.</td></tr><tr><td>Folia poliestrowa Lumirror</td><td>TORAY INDUSTRIES, INC., Tokio, Japonia</td><td>Lumirror T60 (t 125 &micro; m)</td> <td>filim PET (grubość: 125 i mikro; m) stosowane w testach lokomocji w Protokole 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm / naczynie niepoddane obróbce</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japonia).</td><td>1010-060</td><td>Naczynie niepoddane obróbce używane do infuzji C. elegans w protokole 1</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/naczynie niepoddane obróbce</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japonia).</td><td>1010-035</td><td>Naczynie niepoddane obróbce stosowane w testach lokomocji w Protokole 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, Francja</td><td></td><td>Woda ultraczysta</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokio, Japonia</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm; 200 arkuszy/ pudełko</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td><td>59-AWP</td><td>Picker Platina przeznaczony do zbierania C. elegans</td></tr><tr><td>Badawczy mikroskop stereoskopowy</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td> Mikryskop <td>SZX16</td><td>używany we wszystkich eksperymentach i obserwacjach w tym artykule</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stojak do ustawiania ostrości dla SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Był używany do obserwacji jasnego pola w Protokole 3-8.</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu (&razy; 1)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td><td>SDFPLAPO1 i czasy; PF</td><td>NA: 0,15; Szer.: 60 mm. To pozwala na obserwację jasnego pola w Protokole 3-8.</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu (&razy; 2)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA: 0,3; Szer.: 20 mm. Ten&nbsp; Wypożyczenie wykorzystano do obserwacji obrazowych.</td></tr><tr><td>Mercury Light Source</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td><td>U-LH100HG</td><td>Szerokie spektrum emisji umożliwia przeprowadzenie szeregu eksperymentów obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu wszystkich powszechnie stosowanych fluoroforów.</td></tr><tr><td>SZX16 Filtr fluorescencyjny (wysoka wydajność dla YFP)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japonia</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. Wykorzystano to do obserwacji obrazowej szczepu HBR4.</td></tr><tr><td>Szybki aparat cyfrowy EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokio, Japonia</td><td></td><td>EX-F1 Rysunek 1B, 1E, 1F, Rysunek 2A-C i wideo 1 zostały uzyskane przy użyciu tego aparatu cyfrowego.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA</td><td></td><td>EXCEL Oprogramowanie używane do analiz statystycznych</td></tr></tbody></table>

unieruchomienie żywych osobników caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Promieniowanie jest szeroko stosowane do zastosowań biologicznych i hodowli wiązki jonów, a wśród tych metod, promieniowanie mikrowiązką stanowi potężny sposób identyfikacji miejsc wrażliwych na promieniowanie w organizmach żywych. W artykule opisano szereg metod immobilizacji na chipie opracowanych do celowanego naświetlania mikrowiązką żywych osobników Caenorhabditis elegans. W szczególności szczegółowo wyjaśniono postępowanie z mikroprzepływowymi chipami z polidimetylosiloksanu (PDMS), które wcześniej opracowaliśmy w celu unieruchomienia osób z C. elegans bez konieczności znieczulenia. Ten chip, określany jako arkusz robaka, jest sprężysty, aby umożliwić rozszerzenie kanałów mikroprzepływowych, a elastyczność pozwala na delikatne otoczenie zwierząt. Ponadto, dzięki zdolności samoadsorpcji PDMS, zwierzęta mogą być zamykane w kanałach poprzez pokrycie powierzchni arkusza ślimaka cienką folią ochronną, w której zwierzęta nie są wpychane do kanałów do obudowy. Odwracając folię okrywową, możemy w łatwy sposób zebrać zwierzęta. Co więcej, arkusz robaka wykazuje retencję wody i pozwala osobnikom C. elegans na długotrwałą obserwację mikroskopową w warunkach życia. Ponadto arkusz ma grubość zaledwie 300 μm, co pozwala ciężkim jonom, takim jak jony węgla, przechodzić przez arkusz otaczający zwierzęta, umożliwiając w ten sposób wykrycie cząstek jonów i dokładny pomiar zastosowanej dawki promieniowania. Ponieważ wybór folii ochronnych używanych do owijania zwierząt jest bardzo ważny dla skutecznego długotrwałego unieruchomienia, przeprowadziliśmy wybór odpowiednich folii osłonowych i pokazaliśmy zalecaną spośród niektórych folii. Jako przykład zastosowania chipa wprowadziliśmy obrazową obserwację aktywności mięśniowej zwierząt otaczających kanał mikroprzepływowy arkusza robaka, a także naświetlanie mikrowiązką. Przykłady te wskazują, że arkusze robaków znacznie rozszerzyły możliwości eksperymentów biologicznych.

Aktywne osobniki C. elegans można skutecznie unieruchomić za pomocą ultra cienkiego, zwilżalnego chipa mikrofluidycznego z PDMS (arkusz do nicieni). zbadaliśmy przydatność różnych folii pokrywowych do uszczelniania arkusza do nicieni, zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu. Aby ocenić efekty uszczelniania folii pokrywowych, określiliśmy ruchliwość zwierząt 3 h po unieruchomieniu na chipie, stosując odpowiednio szkiełko podstawowe (grubość: 130-170 µm), folię PET (grubość: 125 µm) ...

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Jedną z zalet tego protokołu jest to, że arkusz ślimakowy jest łatwy w obsłudze. Arkusz posiada cechy zapobiegające wysychaniu, dzięki czemu możemy przeprowadzać naświetlanie mikrowiązką żywych zwierząt, wykonywać kilka testów behawioralnych i prowadzić długotrwałą obserwację. Kanały mikroprzepływowe w tym arkuszu ślimaków są otwarte, co ułatwia zbieranie zwierząt.Te arkusze ślimakowe mogą być również używane wielokrotnie, dzięki czemu są bardziej ekonomiczne. Kiedy opracowywaliśmy tę technikę, chcieliśmy naświetlić tylko część zwierząt mikrowiązką pod mikroskopem. Potrzebowaliśmy więc przezroczystych, bardzo cienkich wiórów, które byłyby w stanie utrzymać zwierzęta.Na początek umieść cienki, przezroczysty arkusz na scenie, aby użyć go jako dolnej folii okładkowej. Delikatnie umieść arkusz robaka na dolnej folii okładki za pomocą płaskiej pęsety. Umieścić co najmniej trzy kropelki roztworu buforowego na powierzchni 6-centymetrowej, niepoddanej obróbce szalki Petriego.Następnie wybierz kilka dorosłych C.elegans za pomocą zbieracza platiny z płytki hodowlanej. Przenieś zwierzęta do kropelki za pomocą zbieracza platiny i pozwól zwierzętom pływać w buforze, aby usunąć wszelkie bakterie. Umyj zwierzęta w dwóch oddzielnych kropelkach i opłucz je w kolejnej kropli.Następnie umieść kroplę roztworu buforowego na powierzchni arkusza ślimaka. Usuń umyte zwierzęta z kropli buforowej i przenieś je do kropli na arkuszu robaków. Użyj płaskiej pęsety, aby umieścić folię osłonową PS na arkuszu ślimaka i delikatnie dociśnij kanały od jednego końca arkusza do drugiego.Lub po prostu wrzuć zwierzęta do kropelki i delikatnie uszczelnij folią pokrywającą, aby kropla rozprzestrzeniła się między pokrywą a arkuszami robaków ze zwierzętami w kanale. Upewnij się, że zwierzęta żyją, sprawdzając ruch pod mikroskopem przy powiększeniu 1-2x. Zapisz pozycje zwierząt, a w szczególności zanotuj numer kanału, w którym każde zwierzę jest zamknięte, oraz pozycję każdego zwierzęcia w kanale.Do zbierania unieruchamiających zwierząt użyj płaskiej pęsety, aby usunąć folię ochronną z arkusza robaków, a następnie upuść 10-15 mikrolitrów roztworu buforowego na jeden z kanałów mikroprzepływowych otaczających zwierzęta. Pod mikroskopem stereoskopowym obserwuj zwierzęta, gdy zaczynają się obracać. Następnie użyj zbieracza platiny, aby podnieść pływające zwierzęta i przenieść je na płytkę testową.Po zamknięciu zwierząt, jak pokazano wcześniej, obserwuj fluorescencyjne plamy na zwierzętach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie zobrazuj propagację fal jonów wapnia za pomocą akwizycji wideo, aby obserwować dynamiczne aktywności. Umieść zużyty arkusz robaka na sześciocentymetrowej szalce Petriego i umieść na nim około 100 mikrolitrów wysterylizowanej ultraczystej wody.Palcami w rękawiczkach rozprowadź wodę na powierzchni prześcieradła i zmyj wszelkie zanieczyszczenia. Następnie użyj jednorazowych chusteczek, aby usunąć wilgoć z arkusza robaka. Wlej pięć mililitrów 70% etanolu na szalkę Petriego i użyj palców w rękawiczkach, aby rozprowadzić etanol na arkuszu ślimaka.Na koniec, po wyschnięciu arkusza, umieść go na sterylnej szalce Petriego i przykryj. Korzystając z tego protokołu, zbadano przydatność różnych folii okładkowych. Nie stwierdzono istotnej różnicy w ruchliwości między zwierzętami kontrolnymi a zwierzętami zamkniętymi w kanałach mikroprzepływowych z folią PS.Natomiast ruchliwość była znacznie zmniejszona u zwierząt zamkniętych pod szkłem nakrywkowym. Ruchliwość zwierząt zamkniętych folią dla zwierząt domowych również uległa znacznemu zmniejszeniu. Ważne jest, aby starannie dobierać folie osłonowe do uszczelniania kanałów mikroprzepływowych.Korzystając z tego protokołu, oceniliśmy przydatność różnych folii pokryciowych za pomocą testów lokomocji zwierząt trzy godziny po unieruchomieniu na chipie. Korzystając z tej techniki, zamierzaliśmy opracować ultracienki chip zwilżalny przeznaczony wyłącznie do naświetlania mikrowiązką. Jednak te arkusze robaków były już używane do obrazowania i testów behawioralnych poza ich pierwotnymi zastosowaniami.

immobilization-live-caenorhabditis-elegans-individuals-using-an-ultra

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Ten artykuł opisuje protokoły budowy i obsługi etapu chłodzenia w celu masowego unieruchomienia C. elegans na ich oryginalnych płytach uprawowych.

Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę unieruchamiania żywych nicieni Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipu polidimetylosiloksanowego z retencją wody. Technika umożliwia precyzyjną mikrofalową radiację, długoterminową obserwację zachowań oraz wielokrotne użycie chipu w badaniach neurobiologicznych.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody (Wideo) | JoVE Journal

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Przeglądaj więcej filmów