Name: Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanoemulsji z konjugatem kwasu oleinowego z platyną stabilizowaną tripeptydem KYF do enkapsulacji leków przeciwnowotworowych. Biodegradowalny system zwiększa skuteczność terapii raka jajnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe od National Cancer Institute, grant SC2CA206194. Nie deklaruje się żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

1. Synteza koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II)
<ol>
	<li>Aktywacja cisplatyny
	<ol>
		<li>Zawiesić 50 mg (0,167 mmol) cisplatyny w 4 ml wody (np. nanoczystej) w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Dodać kroplami 55,2 mg (0,325 mmol) AgNO3 w 0,5 ml wody do roztworu cisplatyny i mieszać reakcję przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 60 °C. Utworzy się biały osad AgCl wskazujący na postęp reakcji.</li>
		<li>Aby ustalić, czy reakcja aktywacji została zakończona, należy wykonać test z 10% HCl na obecność wolnego jonu Ag+ w roztworze. Test powinien być ujemny (nie powinien powstawać dodatkowy osad AgCl).</li>
		<li>Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 3,220 x g przez 10 minut i usunąć biały osad AgCl.</li>
		<li>Zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Zbadać supernatant na obecność platyny, nakładając 2-3 krople roztworu za pomocą pipety Pasteura na kryształy SnCl2. Test jest pozytywny, jeśli kolor kompleksu współrzędnych cyny z platyną jest ciemnożółty/pomarańczowy.</li>
		<li>W drugim etapie należy użyć supernatantu z aktywowanym Pt(II).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja kwasu oleinowego z aktywowanym Pt(II)
	<ol>
		<li>Zawiesić 94,2 mg kwasu oleinowego (0,333 mmol) w 3 ml wody o temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Dodać 13,3 mg (0,333 mmol) NaOH w 1 ml wody i wymieszać z roztworem aktywowanego Pt(II) z kroku 1.1</li>
		<li>Mieszać reakcję przez 2 godziny w temperaturze 60 °C, a następnie w temperaturze pokojowej przez noc. Produktem surowym jest oleisty brązowo-żółty osad.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 3,220 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Suszyć surowy produkt w temperaturze 25 °C za pomocą wyparki obrotowej. Oczyść produkt przez wielokrotne mycie acetonitrylem. Ostateczny kolor sprzężonego czystych kwasów oleinowych – Pt(II) jest bladożółty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synteza KYF-Pt-NE i nanoemulsji FITC-KYF-Pt-NE znakowanej FITC
<ol>
	<li>Synteza tripeptydu KYF i fluorescencyjnie znakowanego tripeptydu FITC-KYF
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj KYF przy użyciu standardowej chemii peptydów w stanie stałym. Użyj następujących standardowych warunków sprzęgania, aby przyłączyć każdy aminokwas: żywica Wang (2,19 mmol), aminokwas chroniony Fmoc (4,38 mmol), 2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminowy tetrafluoroboran (TBTU) (4,38 mmol) i diizopropyloetyloamina (DIPEA) (8,76 mmol). Rozpuść aminokwasy z TBTU w dimetyloformamidzie (DMF) i DIPEA.</li>
		<li>Namocz 5,7 g żywicy alkoholowej Fmoc-L-Phe 4-alkoksybenzylowej (0,382 meq/g) w 25 ml DMF przez 1 godzinę przed użyciem.</li>
		<li>Zdeprotect grupę aminową aminokwasu L-fenyloalaniny za pomocą 15 ml 20% roztworu piperydyny/DMF przez 5 minut, wyrzucić rozpuszczalnik i powtórzyć płukanie w cyklu 20 minut.</li>
		<li>Myj żywicę przez 1 minutę następującymi rozpuszczalnikami: DMF, alkohol izopropylowy (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Wyrzuć rozpuszczalnik po każdym praniu.</li>
		<li>Wykonaj test Kaisera, aby określić obecność wolnej grupy NH2 na żywicy (patrz podkroki) i jeśli jest dodatni (ziarno żywicy jest fioletowe), dodaj aminokwas Fmoc-L-tyrozyny i wykonaj sprzęganie przez noc.
		<ol>
			<li>Przygotuj roztwory testowe Kaisera w osobnych butelkach.</li>
			<li>Rozpuścić 5 g ninhydryny w 100 ml etanolu.</li>
			<li>Rozpuścić 80 g fenolu w 20 ml etanolu.</li>
			<li>Zmieszać 2 ml 0,001 M wodnego roztworu cyjanku potasu z 
			98 ml pirydyny.</li>
			<li>Dodaj 2-3 krople każdego roztworu testowego Kaisera do próbki i podgrzewaj we wrzącej wodzie przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po pomyślnym sprzężeniu drugiego aminokwasu wykonaj test Kaisera, a jeśli wynik jest negatywny, postępuj zgodnie z protokołem deprotekcji (kroki od 2.1.3 do 2.1.5). Powtórz proces z aminokwasem Fmoc-fenyloalanina.
		<ol>
			<li>Po sprzęgnięciu wszystkich aminokwasów przemyć żywicę przez 1 minutę 5 ml DMF, IPA, DMF, metanolu, dichlorometanu i eteru dietylowego, po każdym płukaniu wyrzucić rozpuszczalnik. Zachowaj żywicę do dalszej obróbki.</li>
			<li>Użyj połowy żywicy do następnych kroków (2.1.7-2.1.9), aby zmodyfikować peptyd za pomocą FITC. Aby uzyskać niezmodyfikowany tripeptyd KYF, postępuj zgodnie z procedurą rozpoczynającą się od 2.1.10.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmodyfikuj N-końcowy aminokwas KYF do KYF-N3 za pomocą kwasu 6-azydoheksanowego. W tym celu należy zmieszać 1 g (0,382 mmol) żywicy KYF Wang i 120,1 mg (0,764 mmol) kwasu 6-azydoheksanowego z 245,2 mg (0,764 mmol) TBTU i 197,1 mg (1,528 mmol) DIPEA w 30 ml DMF. Mieszaj reakcję przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Otrzymać KYF-FITC z syntezy KYF-N3 z propargylowo-fluoresceiną w reakcji klikania. W tym celu należy zmieszać 253 mg (0,097 mmol) żywicy KYF-N3 Wang z 3,78 mg (0,019 mmol) CuI stałego, 71,9 mg (0,193 mmol) propargylu fluoresceiny i 2,24 mg (0,017 mmol) DIPEA. Reakcja powinna zmienić kolor z zielonego na brązowy.</li>
		<li>Po 24 godzinach płukać żywicę przez 1 minutę na przemian pięciokrotnie 5 ml DMF i IPA, trzykrotnie metanolem i wodą, trzykrotnie DMF i wodą oraz trzykrotnie dichlorometanem i eterem dietylowym. Wyrzuć rozpuszczalnik po każdym praniu.</li>
		<li>Rozszczepić peptyd KYF-FITC lub KYF z żywicy roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA)/triizopropylosilanu (TIPS)/H2Ow stosunku 95/2,5/2,5 przez 3 godziny.</li>
		<li>Surowy peptyd wytrącić w zimnym eterze dietylowym, przemyć trzykrotnie zimnym eterem, a następnie wysuszyć w próżni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza nanoemulsji stabilizowanej FITC-KYF z Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) i KYF-Pt-NE
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 mg (0,0126 mmol) koniugatu kwasów oleinowych – Pt(II) w 1,5 ml izopropanolu i umieścić w strzykawce o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę ze sprzężonym kwasem oleinowym – Pt(II) w pompie strzykawkowej i ustawić przepływ na 0,1 ml/min.</li>
		<li>W celu syntezy FITC-KYF-Pt-NE należy rozpuścić 1 mg (0,00105 mmol) FITC-KYF i 1 mg (0,00219 mmol) KYF (stosunek molowy 1:2 FITC-KYF:KYF) w 20 ml wody i dostosować temperaturę roztworu do 37 °C. Przykryj ścianki pojemnika folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania fluoroforu FITC. Aby zsyntetyzować KYF-Pt-NE, rozpuścić 2 mg (0,0044 mmol) tripeptydu KYF w 20 ml wody i dostosować temperaturę roztworu do 37 °C.</li>
		<li>Dodawać kroplami koniugat kwasów oleinowych – Pt(II) do roztworu tripeptydu FITC-KYF/KYF lub KYF. Wykonaj ten krok pod maską.</li>
		<li>Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze pokojowej, aby odparować rozpuszczalniki organiczne i umożliwić samoorganizację FITC-KYF-Pt-NE lub KYF-Pt-NE.</li>
		<li>Skoncentrować FITC-KYF-Pt-NE lub KYF-Pt-NE w koncentratorze odśrodkowym (10k MWCO) i przemyć trzykrotnie 4 ml wody nanoczystej.</li>
		<li>Roztwory wodne KYF-Pt-NE i FITC-KYF-Pt-NE należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Analizuj zawartość platyny za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS), postępując zgodnie z przewodnikiem producenta48.
		<ol>
			<li>Przygotuj wzorce platyny w 10% roztworze HCl dla krzywej kalibracyjnej (efektywny zakres dla AAS wynosi od 100 do 1 200 ppb (części na miliard)).</li>
			<li>Rozpuścić 50 μl roztworu KYF-Pt-NE z kroku 2.2 w 100 μl wody królewskiej (mieszanina stężonego kwasu solnego i kwasu azotowego w stosunku 3:1) i pozostawić na noc w temperaturze pokojowej. Dodać 850 μl wody, aby uzyskać końcową objętość próbki 1 ml. Przeanalizuj próbkę za pomocą usługi AAS. Końcowe stężenie kwasu powinno wynosić 10% we wszystkich analizowanych próbkach.</li>
			<li>Zapisać odczyt stężenia Pt w ppb i obliczyć końcową zawartość platyny w próbce (uwzględnić rozcieńczenie próbki i początkową objętość nanoemulsji).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfokalne obrazowanie wychwytu komórkowego FITC-KYF-Pt-NE
<ol>
	<li>Wysiewaj 6 linii komórkowych raka jajnika (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G i ES2) do 4 dobrze komorowych naczyń konfokalnych o gęstości 4,7 x 104 komórek na komorę i wstępnie hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach przemyć komórki trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i inkubować z FITC-KYF-Pt-NE w pożywce do hodowli komórkowych (patrz krok 6.1 w celu uzyskania szczegółowych informacji dotyczących linii komórkowej) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki zimnym metanolem przez 5 minut w temperaturze -20 °C i przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml 0,1% Triton-X przez 10 minut w temperaturze pokojowej i trzykrotne przemycie 1 ml PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 90 minut z przeciwciałem LAMP1 sprzężonym z Alexa Fluor 647 (1 ml) w rozcieńczeniu 1:50 w PBS w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki 3 razy PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy DAPI (1 mg/ml) do 1 μg/ml w PBS. Następnie dodaj 1 ml rozcieńczonego roztworu do każdej komory i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki 3 razy PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą medium montażowego.</li>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego na żywej komórce przy długości fali wzbudzenia 405 nm, 488 nm i 633 nm. Ustaw parametry detekcji w następujący sposób: moc lasera od 0,2% i nie więcej niż 1%, jednostka Pinole 1 Airy, Gain master 650-750, offset cyfrowy 0.</li>
	<li>Otwórz obraz w oprogramowaniu do obrazowania. W obszarze wyświetlany obraz wybierz opcję Grafika i wybierz opcję Wstaw podziałkę liniową, aby wstawić podziałkę liniową do obrazu.</li>
</ol>
4. Badania nad uwalnianiem leków
<ol>
	<li>Przeprowadzenie badań nad uwalnianiem leku w PBS. Dostosuj wartości pH trzech PBS odpowiednio do 7,4, 6,8 i 5,0.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 μl KYF-Pt-NE w 180 μl buforu PBS o odpowiednim pH, przenieść do mini kubka dializacyjnego MWCO o mocy 3,5 kDa i inkubować w temperaturze 37 °C w PBS.</li>
	<li>Usunąć bufor z każdych trzech mini probówek dializacyjnych po 2, 4, 6, 24, 48 i 140 godzinach i zmierzyć stężenie platyny za pomocą AAS. Przygotować wszystkie próbki zgodnie z krokiem 2.2.8, ale dostosować końcową objętość próbki do 500 μl.</li>
</ol>
5. Metody hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowych A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV-21G, ES-2 w pożywce do hodowli komórkowych (DMEM) uzupełniona 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) lub 15% (TOV-21G, OV-90) płodową surowicą bydlęcą (FBS), z L-glutaminą i penicyliną/streptomycyną. Hoduj wszystkie komórki w atmosferze nasyconej wodą o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wysiewaj 3 x 105 komórek na każdej 96-dołkowej płytce i hoduj wstępnie przez noc do eksperymentów inkubacyjnych in vitro. Przygotuj roztwory KYF-Pt-NE, cisplatyny i karboplatyny w wodzie. Dostosuj stężenie Pt(II) w KYF-Pt-NE, aby dopasować stężenie karboplatyny i cisplatyny dla każdej linii komórkowej. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji oceń żywotność komórek za pomocą testu kolorymetrycznego (test proliferacji komórek MTT). Na krótko usunąć pożywkę i dodać 110 μl 10% MTT w pożywce do każdego dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie dodać 100 μl detergentu do każdej studzienki i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Sprawdzić absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek. Analizuj wyniki za pomocą analizy statystycznej z testem Z i testem P.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Krytyczne etapy syntezy nanoemulsji obejmują regulację stosunku molowego substratów, utrzymanie kontroli temperatury i natężenia przepływu podczas dodawania kwasów oleinowych do Pt(II), zapewnienie wystarczającej ilości czasu na samoorganizację oraz oczyszczanie produktu za pomocą kolumny koncentratora odśrodkowego. Parametry te wpływają na wielkość i morfologię KYF-Pt-NE; Dlatego szczególnie ważne jest utrzymanie odpowiedniego stosunku zębów trzonowych i prawidłowe dostosowanie warunków syntezy.
<p class="jove_conte...

W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie inżynierią nanocząsteczek do takich zastosowań biomedycznych, jak dostarczanie leków i bioobrazowanie1,2,3,4. Wielofunkcyjność systemów opartych na nanocząstkach często wymaga włączenia wielu komponentów w jednym preparacie. Elementy budulcowe, które są oparte na lipidach lub polimerach, często różnią się pod względem właściwości fizykochemicznych, a także biokompatybilności i biodegradowalności, co ostatecznie może wpłynąć na funkcję nanostruktury1,5,6. Materiały pochodzenia biologicznego, takie jak białka i peptydy, od dawna są uznawane za obiecujące składniki wielofunkcyjnych nanostruktur ze względu na ich elastyczność sekwencji7,8. Peptydy samoorganizują się w wysoce uporządkowane architektury supramolekularne, tworząc spiralne wstęgi9,10, rusztowania włókniste11,12, torując w ten sposób drogę do budowy hybrydowych nanostruktur opartych na biomolekułach przy użyciu podejścia oddolnego13.
Peptydy zostały zbadane pod kątem zastosowań w medycynie i biotechnologii, zwłaszcza w terapii przeciwnowotworowej14 i chorobach sercowo-naczyniowych15, a także do opracowywania antybiotyków16,17, zaburzeń metabolicznych18 i infekcji19. Istnieje ponad sto leków o małych peptydach, które są w trakcie badań klinicznych20. Peptydy są łatwe do modyfikacji i szybkie do syntezy przy niskich kosztach. Ponadto są biodegradowalne, co znacznie ułatwia ich biologiczne i farmaceutyczne zastosowania21,22. Wykorzystanie peptydów jako komponentów strukturalnych obejmuje inżynierię responsywnych nanocząstek na bazie peptydów i magazynów hydrożelu do kontrolowanego uwalniania23,24,25,26,27, biosensory oparte na peptydach28,29,30, 31, lub urządzenia bioelektroniczne32,33,34. Co ważne, stwierdzono, że nawet krótkie peptydy z dwiema lub trzema resztami aminokwasowymi, które zawierają fenyloalaninę, kierują procesami samoorganizacji35,36,37 i tworzą stabilizowane emulsje38.
Leki na bazie platyny, ze względu na ich wysoką skuteczność, są stosowane w wielu schematach leczenia raka, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z innymi środkami39,40. Związki platyny indukują uszkodzenia DNA poprzez tworzenie monoadduktów i wiązań krzyżowych wewnątrzniciowych lub międzyniciowych. Zmiany Pt-DNA są rozpoznawane przez maszynerię komórkową i, jeśli nie zostaną naprawione, prowadzą do apoptozy komórkowej. Najważniejszym mechanizmem, za pomocą którego Pt(II) przyczynia się do śmierci komórek nowotworowych, jest hamowanie transkrypcji DNA41,42. Jednak korzyści płynące z terapii platyną są zmniejszone przez ogólnoustrojową toksyczność Pt(II), która wywołuje poważne skutki uboczne. Prowadzi to do niższych klinicznych dawek Pt(II)43, co często skutkuje subterapeutycznymi stężeniami platyny docierającymi do DNA. W konsekwencji następująca naprawa DNA przyczynia się do przeżycia komórek rakowych i nabycia oporności na Pt(II). Oporność na chemioterapię platyny jest poważnym problemem w terapii przeciwnowotworowej i główną przyczyną niepowodzenia leczenia44,45.
Opracowaliśmy stabilny nanosystem, który otacza czynnik Pt(II) w celu zapewnienia efektu ekranującego w krążeniu ogólnoustrojowym i zmniejszenia skutków ubocznych wywołanych przez Pt(II). System oparty jest na rdzeniu z kwasami oleinowymi-Pt(II) stabilizowanym tripeptydem KYF w celu utworzenia nanoemulsji (KYF-Pt-NE)46. Elementy budulcowe KYF-Pt-NE, aminokwasy tripeptydu oraz kwas oleinowy, mają status ogólnie uznanego za bezpieczny (GRAS) przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). KYF-Pt-NE jest przygotowywany przy użyciu metody nanoprecypitacji47. Krótko mówiąc, koniugat kwasów oleinowych-Pt(II) rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, a następnie dodaje kroplami do wodnego roztworu KYF (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1) w temperaturze 37 °C. Roztwór miesza się przez kilka godzin, aby umożliwić samodzielny montaż KYF-Pt-NE. Nanoemulsję zagęszcza się w koncentratorach odśrodkowych o sile 10 kDa i trzykrotnie przepłukuje wodą. Chemiczna modyfikacja KYF za pomocą fluoroforu pozwala na syntezę fluorescencyjnego FITC-KYF-Pt-NE odpowiedniego do obrazowania biomedycznego.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironium tetrafluoroboran (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>4-dołkowa miska konfokalna komorowa</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>kwasu 6-bromoheksanowego</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Modyfikacja kliknięcia dla peptydu</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Hojnie zaszczepiona przez profesora Johna Martignettiego z The Mount Sinai Hospital</td><td></td><td>Linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>system filtracji wody</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Do usuwania rozpuszczalnika i suszenia próbek</td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Do separacji kompleksu platyny</td></tr><tr><td>Cis-dichlorodiaminaplatyna (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>testy in vitro</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Hojnie zaszczepiony przez profesora Johna Martignettiego ze szpitala</td><td></td> Mount Sinai <td>Linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>Cyfrowa kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Do podgrzewania pożywek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Do pomiarów wielkości nanocząstek</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99,79%</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe Żywica alkoholowa 4-alkoksybenzylowa (0,382 meq/g),</td> <td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 HERACELL 150i</td><td>Inkubator</td>CO2 <td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowa pompa strzykawkowa</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Do dodawania kompleksu platyny w syntezie nanocząstek</td></tr><tr><td>Płyta grzejna/mieszadło</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Do mieszania i podgrzewania próbek</td></tr><tr><td>Przeciwciało LAMP-1 (sprzężone z Alexa Fluor 647)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA)</td> <td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td></td></tr><tr><td>SPPS Ninhydrin 99%</td> <td>Alfa</td><td>Aesar A10409</td><td>Test Kaisera</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01421</td><td>Do syntezy kompleksu platyny</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Do mycia komórek</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Test Kaisera</td></tr><tr><td>Kwas fosfowolframowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A248-25</td><td>ujemne zabarwienie dla TEM</td></tr><tr><td>Piperydyna 99%</td> <td>BTC</td><td>219260-2,5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Platynowa standardowa rozdzielczość AAS</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug / ml do krzywej kalibracyjnej</td></tr><tr><td>Bromek propargylu 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Do alkinowej modyfikacji fluoresceiny</td></tr><tr><td>Naukowa szafka biologiczna</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-kaptur do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Samoczyszczący system próżniowy</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Pompa próżniowa do rotavapor</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Aktywacja cisplatyny</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Do syntezy kompleksu platyny</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>cyny (II)Sigma Aldrich</td><td></td><td>208256 Test na obecność platyny</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Linia komórkowa raka jajnika</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy 99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Uranina w proszku 40%</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25328A</td><td>Do alkinowej modyfikacji fluoresceiny</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Do mycia i kondensacji nanocząstek</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony VWR</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Do monitorowania kultur komórkowych</td></tr></tbody></table>

stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Opisujemy metodę wytwarzania nanoemulsji składającej się z rdzenia z kwasów oleinowych-Pt(II) i powłoki lizynowo-tyrozynowo-fenyloalaninowej (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE hermetyzuje Pt(II) o masie 10 %, średnicy 107 ± 27 nm i ujemnym ładunku powierzchniowym. KYF-Pt-NE jest stabilny w wodzie i surowicy oraz jest biologicznie aktywny. Koniugacja fluoroforu z KYF pozwala na syntezę fluorescencyjnej nanoemulsji, która nadaje się do obrazowania biologicznego. Synteza nanoemulsji odbywa się w środowisku wodnym, a KYF-Pt-NE powstaje w wyniku samoorganizacji krótkiego peptydu KYF i koniugatu kwasów oleinowych z platyną(II). Proces samoorganizacji zależy od temperatury roztworu, stosunku molowego substratów i natężenia przepływu dodawanego substratu. Kluczowe kroki obejmują utrzymanie optymalnej szybkości mieszania podczas syntezy, zapewnienie wystarczającej ilości czasu na samoorganizację oraz stopniowe wstępne zagęszczanie nanoemulsji w koncentratorze odśrodkowym.

Reprezentatywny obraz TEM KYF-Pt-NE przygotowanego zgodnie z tym protokołem przedstawiono na Ryc. 2A. KYF-Pt-NE mają morfologię sferyczną, są dobrze rozproszone i jednorodne pod względem rozmiaru. Średnica rdzenia KYF-Pt-NE, zmierzona bezpośrednio na trzech obrazach TEM przy wykonaniu minimum 20 pomiarów, wynosi 107 ± 27 nm. Średnica hydrodynamiczna KYF-Pt-NE, analizowana za pomocą dynamicznej spektroskopii rozproszenia światła (DLS), wyniosła 240 nm przy ind...

Ten protokół opisuje skuteczną metodę syntezy nanoemulsji koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II) stabilizowanego tripeptydem lizyna-tyrozyna-fenyloalanina (KYF). Nanoemulsja powstaje w łagodnych warunkach syntetycznych poprzez samoorganizację KYF i koniugatu.

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Biorąc pod uwagę szeroki zakres krótkich sekwencji peptydowych, metodę tę można rozszerzyć na wiele innych projektów nanocząstek. Modyfikacja peptydów może sprawić, że system będzie odpowiedni do celów diagnostycznych. Kapsułkowanie przeciwnowotworowej platyny w lekach za pomocą biodegradowalnego środka stabilizującego o niskiej toksyczności jest bardzo istotne dla zastosowań farmaceutycznych.Wstępne badania in vivo nad rakiem jajnika są obiecujące i będą dalej badane. Na początek zawiesić 50 miligramów cisplatyny w czterech mililitrach ultraczystej wody o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Dodawać roztwór azotanu srebra kroplami do roztworu cisplatyny i mieszać mieszaninę z prędkością od 300 do 400 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza w ciemności.Następnie użyj 10% wagowo kwasu solnego, aby potwierdzić, że w roztworze nie ma wolnych jonów srebra. Jeżeli po dodaniu kwasu solnego nie tworzy się dodatkowy chlorek srebra, odwirować mieszaninę pod ciśnieniem 3,220 razy większym od grawitacji przez 10 minut. Zdekantować supernatant i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra.Następnie przetestuj filtrat na obecność platyny, nakładając dwie do trzech kropli na 10 dwóch kryształów chlorku. Platyna jest obecna, gdy zawiesina zmieni kolor na ciemnobrązowy lub pomarańczowy. Następnie dodaj 13,3 miligrama wodorotlenku sodu w jednym mililitrze wody do 94,2 miligrama zawiesiny kwasu oleinowego w trzech mililitrach wody o temperaturze 60 stopni Celsjusza.Mieszaj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie wyłącz ogień i kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez 16 do 24 godzin, aby uzyskać surowy produkt w postaci oleistego, żółto-brązowego środka strącającego. Odwirować mieszaninę reakcyjną pod 3 220-krotnością grawitacji przez 10 minut i usunąć supernatant.Wysuszyć produkty na wyparce obrotowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Zawiesić surowy produkt w pięciu mililitrach acetonitrylu przez wirowanie i odzyskiwanie produktu przez odwirowanie. Powtórzyć ten proces mycia jeszcze co najmniej dwa razy i trzy, aby otrzymać czysty koniugat platyny II kwasu oleinowego w postaci bladożółtego ciała stałego.Najpierw namocz 5,7 grama chronionej przez Fmoc żywicy Wang funkcjonalizowanej L-fenyloalaniną w 25 mililitrach dimetyloformamidu przez godzinę. Następnie namocz żywicę w 15 mililitrach 20% piperydyny w DMF przez pięć minut, wstrząsając z prędkością 80 obr./min, aby usunąć ochronę aminy. Odcedź żywicę i powtórz zdejmowanie ochrony przez 20 minut.Następnie umyj żywicę DMF i alkoholem izopropylowym. Po potwierdzeniu odbezpieczania, dodać L-tyrozynę chronioną przed Fmoc TBTU i DIPEA i mieszać mieszaninę przez 16 do 24 godzin, aby przeprowadzić sprzęganie. Umyj żywicę DMF i alkoholem izopropylowym.Wykonaj test Kaisera i kontynuuj zdejmowanie ochrony i pranie zgodnie z wcześniejszym opisem. Sprzęgnij i odchroń Fmoc chronioną lizynę w ten sam sposób. Następnie umyj żywicę DMF, IPA, metanolem, dichlorometanem i eterem dietylowym.Odłóż na bok jeden gram żywicy zawierającej KYF do modyfikacji FITC. Namocz pozostałą żywicę w 95% kwasie trifluorooctowym. 2,5% triizopropylosilanu i 2,5% wody przez trzy godziny, aby oddzielić tripeptyd od żywicy.Wytrącić surowy peptyd eterem dietylowym schłodzonym do 20 stopni Celsjusza. Przemyć osad trzykrotnie przez odwirowanie w 30 do 40 mililitrowych porcjach zimnego eteru dietylowego i wysuszyć go w próżni. Następnie wymieszaj pozostały gram żywicy KYF ze 120,1 miligramami kwasu 6-acetoheksanowego w 30 mililitrach DMF z TBTU i DIPEA.Mieszać mieszaninę przez 16 do 24 godzin w temperaturze pokojowej, aby otrzymać tripeptyd modyfikowany azydkiem. Następnie połącz 253 miligramy tej żywicy z 3,78 miligramami stałego jodku miedzi(I), 71,9 miligramami propargylu floriseanu i 2,24 miligramami DIPEA. Pozwól mieszaninie zareagować, wstrząsając przez 24 godziny.Następnie dokładnie umyj modyfikowaną przez FITC żywicę łożyskową KYF. Rozszczepić zmodyfikowany FITC KYF z żywicy i oczyścić go w taki sam sposób, jak niezmodyfikowany tripeptyd. Aby rozpocząć przygotowanie nanoemulizji, rozpuść 10 miligramów koniugatu platyny II kwasu oleinowego w 1,5 mililitra IPA.Pobrać ten roztwór do strzykawki o pojemności 5 mililitrów, założyć igłę o rozmiarze 20 i zamontować strzykawkę na pompie strzykawkowej nad obszarem reakcji. Ustawić pompę strzykawkową na 0,1 mililitra na minutę. W przypadku nanoemulsji z modyfikowanym FITC KYF należy rozpuścić jeden miligram zmodyfikowanego FITC KYF i jeden miligram niezmodyfikowanego KYF w 20 mililitrach wody.Aby uzyskać nanoemulsję z niemodyfikowanym KYF, zamiast tego rozpuść dwa miligramy KYF w 20 mililitrach wody. Podgrzej zmodyfikowany lub niezmodyfikowany roztwór KYF do 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że roztwór KYF miesza się z prędkością około 400 obr./min i że strzykawka jest wyrównana z roztworem.Następnie uruchom pompę strzykawkową, aby rozpocząć dodawanie kwasu oleinowego platyny w dwóch sprzężonych kroplach. Po dodaniu koniugatu zmniejsz prędkość mieszania do 150 obr./min i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Kontynuuj mieszanie przez 16 do 24 godzin.Następnie skoncentruj nanoemultion w jednostce filtra odśrodkowego o mocy 10 000 daltonów. Umyj nanoemulsję w filtrze odśrodkowym trzykrotnie czterema mililitrowymi porcjami ultraczystej wody. A następnie przechowuj go jako roztwór wodny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Produkt końcowy jest opalizujący dla nanocząstek KYF i fluorescencyjny dla nanocząstek modyfikowanych FITC. Kropelki w nanoemulsji przygotowanej z niemodyfikowanym KYF były kuliste, dobrze zdyspergowane i stosunkowo jednorodne pod względem wielkości. Na podstawie obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej stwierdzono, że jądra miały średnicę około 107 nanometrów.Zmodyfikowana przez FITC nanoemulsja, która pojawia się tutaj na zielono, może wnikać do komórek z różnych linii komórkowych raka jajnika. Podczas gdy średnica hydrodynamiczna obu preparatów zwiększyła się w ciągu czterech miesięcy przechowywania w wodzie, ogólne wymiary zostały zachowane. Ponadto nie zaobserwowano opsonizacji emulsji po dniu inkubacji w 20% płodowej surowicy bydlęcej.Uwalnianie platyny z emulsji było najwolniejsze przy pH 7,4, przy czym tylko 20,8% platyny uwalniało się po czterech godzinach. Uwalnianie platyny przyspieszało wraz ze spadkiem pH. Nanoemulsja pokryta platyną KYF zmniejszyła żywotność tych linii komórkowych raka jajnika w znacznie większym stopniu niż osiągnięto to w przypadku karboplatyny, klinicznie istotnego analogu.Nanoemulsja wykazała również porównywalne lub większe zmniejszenie żywotności niż cisplatyna w pięciu z sześciu linii komórkowych. Nanoemulsja pokryta KYF konsekwentnie powodowała porównywalne lub większe zmniejszenie żywotności niż sam koniugat platyny II z kwasem oleinowym. Jest to prosta, skuteczna metoda kapsułkowania terapii hydrofobowych w rusztowaniu nanocząsteczkowym na bazie tripeptydu.Krótkie peptydy są biodegradowalne i mają niską toksyczność, co ma znaczenie dla medycyny i biotechnologii. Wykonaj tę procedurę pod wyciągiem, aby uniknąć narażenia na rozpuszczalniki organiczne. Nanoemulsje platynowo-oleinowe i KYF platyny mają właściwości przeciwnowotworowe i dlatego należy obchodzić się z nimi ze szczególną ostrożnością.Metoda ta jest prosta ze względu na niską aktywność filabilitora i sprzęt, jednak opiera się na właściwym zastosowaniu strategii syntezy i podstawowych koncepcji chemicznych. Nasza metoda może być rozszerzona o dostarczanie innych małych cząsteczek leków. Rdzeń nanocząsteczkowy składa się z kwasu oleinowego i dlatego nadaje się do enkapsulacji środków hydrofobowych.

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanoemulsje przesunięcia fazowego (PSNE) mogą być waporyzowane przy użyciu wysokointensywnego skupionego ultradźwięku w celu wzmocnienia lokalnego ogrzewania i poprawy ablacji termicznej w guzach. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie stabilnych PSNE o wąskim rozkładzie wielkości. Ponadto zademonstrowano wpływ waporyzowanych PSNE na ablację indukowaną ultradźwiękami w fantomach imitujących tkankę.

Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Opisujemy produkcję i charakterystykę nanocząsteczek i mikrocząsteczek składających się z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) przy użyciu witaminy E-TPGS jako emulgatora. Dzięki różnicowaniu parametrów formulacji, takich jak stężenie emulgatora, możliwe jest wytworzenie nanocząstek o średnich średnicach w zakresie od 220 nm do 1,98 μm.

Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Oleje używane do dostarczania leków mogą zaburzać profil lipidowy pacjentów, co jest niepożądane w chorobach sercowo-naczyniowych. Oleje bogate w kwasy tłuszczowe omega-3 są zdrową alternatywą dla konwencjonalnych olejów i mają ogromny potencjał dla samoemulgowanych systemów dostarczania leków.

Samo-nanoemulgacja zdrowych olejów w celu zwiększenia rozpuszczalności leków lipofilowych

Aby racjonalnie zaprojektować skuteczne adiuwanty, opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami kwasu poli-mlekowo-glikolowego (PNPE). PNPE posiadał wyjątkową miękkość i hydrofobowy interfejs zapewniający silny kontakt komórkowy i oferował ładowanie antygenem o wysokiej zawartości, poprawiając powinowactwo komórkowe systemu dostarczania do komórek prezentujących antygen i indukując wydajną internalizację antygenów.

Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

W tym protokole opracowaliśmy kationowy kwas retinowy (RA) kapsułkowany nanoemulsją, który ma być stosowany jako adiuwant do promowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi ogólnoustrojowych i śluzówkowych. Poprzez dodanie zatwierdzonego przez FDA RA do nanoemulsji, sIgA specyficzne dla antygenu było promowane w pochwie i jelicie cienkim po domięśniowym wstrzyknięciu nanoemulsji.

Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Poznaj metodę syntezy nanoemulsji z konjugatem kwasu oleinowego z platyną stabilizowaną tripeptydem KYF do enkapsulacji leków przeciwnowotworowych. Biodegradowalny system zwiększa skuteczność terapii raka jajnika.

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

Przeglądaj więcej filmów