Name: Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj zaawansowaną metodę obrazowania ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w modelu zapalenia alergicznego in vivo przy użyciu mikroskopii arkuszowej światła. Ta technika umożliwia badanie dynamiki komórek T w tkance płucnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za dofinansowanie przez DFG Collaborative Research Centers, SFB 1181 i TRR 241. Centrum Obrazowania Optycznego w Erlangen (OICE), a w szczególności Ralf Palmisano, Philipp Tripal i Tina Fraaß (projekt Z2 DFG CRC 1181) są uznawani za fachowe wsparcie techniczne w zakresie obrazowania mikroskopowego za pomocą fluorescencji na arkuszach świetlnych.

M.F. Neurath pracował jako doradca dla firm Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda i Boehringer. Pozostali autorzy nie ujawniają żadnego konfliktu.

Opisane tutaj warunki doświadczalne dają możliwość monitorowania zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w warunkach zapalnych in vivo, a tym samym odpowiednio uzupełniają klasycznie przeprowadzane testy adhezji i chemotaksji in vitro. Aby wziąć pod uwagę specyficzne cechy anatomiczne narządów płuc, ważne aspekty naprowadzania komórek odpornościowych (w tym chemotaksję i dystrybucję komórek w narządzie docelowym), a także znaczenie kliniczne i możliwość przen...

Klasyczne choroby zapalne płuc, takie jak astma alergiczna i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), są dobrze znane z tego, że są napędzane przez zwiększoną rekrutację aktywowanych limfocytów do tkanki płucnej1,2. Cytokiny uwalniane przez limfocyty (np. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ i TNF-α) dodatkowo promują chemotaksję wrodzonych i nabytych komórek odpornościowych, indukują przebudowę zwłóknień dróg oddechowych lub bezpośrednio uszkadzają miąższ płuca2. Jak dotąd mechanizmy leżące u podstaw patologicznej akumulacji limfocytów w tkance płucnej nie są jeszcze w pełni poznane. Analogicznie do selektywnego tkankowo imprintingu limfocytów T opisanego dla naprowadzania jelit i skóry, płucne komórki dendrytyczne (DC) są oczywiście w stanie przygotować obwodowe limfocyty T do preferencyjnej infiltracji płuc, przynajmniej częściowo poprzez indukcję ekspresji CCR4 na powierzchni limfocytów3. Oprócz CCR4, limfocyty T naciekające drogi oddechowe charakteryzują się również szczególnie zwiększoną ekspresją receptorów chemokiny CCR5 i CXCR3 w porównaniu z limfocytami T w krwi obwodowej <klasa sup = "xref" > 1, 4,5. Ogólnie rzecz biorąc, istniejące dane są zgodne z koncepcją, że naprowadzanie limfocytów T w płucach w warunkach fizjologicznych lub zapalnych obejmuje szereg różnych receptorów chemokiny i ich odpowiednich ligandów, a zatem zasadniczo zależy od ściśle kontrolowanej współpracy między wrodzonymi i adaptacyjnymi komórkami odpornościowymi1. Szczególnie w początkowej fazie ekspozycji na patogen lub alergen komórki wrodzonego układu odpornościowego reagują na stymulację TLR lub sieciowanie za pośrednictwem IgE poprzez natychmiastowe uwalnianie różnych chemoatraktantów, takich jak LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 i PGD21,6,7. Najlepszym przykładem jest to, że interakcja między PGD2 a receptorem chemoatraktantu CRTh2 ma szczególne znaczenie dla chemotaksji komórek Th2 i dlatego wydaje się być obiecującym celem terapeutycznym w klinicznym leczeniu astmy. Rzeczywiście, pacjenci z umiarkowaną astmą wykazali poprawę objawów i znaczny wzrost natężonej objętości wydechowej w ciągu jednej sekundy (FEV1) po leczeniu selektywnym antagonistą CRTh2 w porównaniu z grupą placebo8,9. W bardziej zaawansowanym stanie odpowiedzi zapalnej już zrekrutowane limfocyty T są w stanie dalej wzmacniać akumulację limfocytów płucnych poprzez uwalnianie IL-4 i IL-13 jako silnych bodźców dla płucnych DC. Następnie, te wrodzone komórki pochodzenia szpikowego regulują ekspresję CCL17 i CCL22 w sposób zależny od STAT61,10,11. Chociaż złożoność opisanego scenariusza nadal utrudnia pełne zrozumienie naprowadzania płuc przez limfocyty T, oferuje on mnóstwo celów molekularnych dla potencjalnie zoptymalizowanej kontroli terapeutycznej zapalnych lub alergicznych chorób płuc. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na innowacyjne techniki eksperymentalne, które są w stanie jeszcze bardziej pogłębić i uzupełnić naszą wiedzę w dziedzinie chemotaksji limfocytów T i naprowadzania płuc.
Ze względu na fakt, że na naprowadzanie limfocytów w ludzkim ciele wpływa wiele parametrów komórkowych, humoralnych i fizycznych1, większość istniejących metod eksperymentalnych nie jest w stanie modelować całej złożoności tego procesu immunologicznego. Zamiast tego wiele standardowych protokołów analizy naprowadzania płuc selektywnie koncentruje się na konkretnym aspekcie związanym z kaskadą przyciągania, adhezji, migracji i zatrzymywania limfocytów. Oprócz czysto opisowego określenia wzorca ekspresji mRNA lub białka integryn i receptorów chemokiny na limfocytach obwodowych lub naciekających płuca oraz uzupełniającego pomiaru odpowiednich poziomów chemokiny we krwi, płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL) lub tkance płucnej12,13,14,15, dobrze ugruntowane testy hodowli komórkowych in vitro pozwalają na funkcjonalną charakterystykę adhezji limfocytów lub chemotaksji w określonych warunkach eksperymentalnych<klasa sup="xref">16,<klasa sup="xref">17,<klasa sup="xref">18. Zasadniczo, statyczne testy adhezji in vitro monitorują zdolność wiązania hodowanych limfocytów do monowarstwy śródbłonka lub do szkiełek pokrytych rekombinowanymi cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka (np. MAdCAM-1, VCAM-1), podczas gdy standardowe testy chemotaksji in vitro są zwykle stosowane w celu ilościowego określenia zdolności limfocytów do migracji wzdłuż gradientu chemokin w systemie transwell19. Oba warunki in vitro umożliwiają kontrolowane dostosowanie i modulację warunków eksperymentalnych, ale z drugiej strony brakuje w nich ważnych zmiennych, o których wiadomo, że mają krytyczny wpływ na chemotaksję in vivo i adhezję limfocytów. W przeważającej mierze statyczne testy hodowli komórkowych ignorują wpływ sił ścinających spowodowanych stałym przepływem krwi19 i potencjalnie zaniedbują zaangażowanie otaczającego środowiska immunologicznego i oddziałujących na siebie komórek odpornościowych nielimfocytów, obecnych w żywym organizmie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, interpretacja wyników uzyskanych w statycznych testach chemotaksji in vitro lub adherencji wymaga dalszej walidacji w dynamicznych eksperymentach adhezyjnych w warunkach przepływu20,21 oraz w modelach in vivo patologii narządów zapalnych19. Rzeczywiście, ważne wnioski na temat regulacji naprowadzania płuc przez limfocyty T w warunkach zapalnych lub alergicznych można wyciągnąć z badań na zwierzętach analizujących genetycznie zmodyfikowane myszy w zdefiniowanych modelach różnych chorób płuc3,22,23. Ilościowe porównanie limfocytów naciekających płuca między myszami typu dzikiego a myszami z niedoborem określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania stanowi dobrze ugruntowane i szeroko stosowane narzędzie do określania wpływu określonych szlaków komórkowych lub receptorów na wzorce dystrybucji limfocytów T sterowane chorobą. Jednak w przeciwieństwie do wcześniej omówionych testów hodowli komórkowych in vitro, projekt badania oparty na klasycznych modelach zwierzęcych nie ma możliwości analizowania i monitorowania pierwotnych ludzkich limfocytów T pochodzących bezpośrednio z krwi lub BAL pacjentów cierpiących na zapalną chorobę płuc. W związku z tym nadal wyzwaniem pozostaje funkcjonalna walidacja, czy zdiagnozowana choroba płuc jest w stanie wdrukować ludzkie limfocyty w celu preferencyjnego tropizmu płuc i jak bardzo parametry kliniczne mogą wpływać na ten scenariusz. Niedawno wprowadzono bardzo eleganckie podejście in vivo w kontekście chorób zapalnych jelit (IBD), które było w stanie przezwyciężyć większość tych ograniczeń i otworzyło nowe możliwości dla zaawansowanych badań translacyjnych nad naprowadzaniem limfocytów jelitowych 24. Korzystając z protokołów oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika, a następnie przekrojowej mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi jako potężnego narzędzia do obrazowania, możliwe było zobrazowanie infiltracji i dystrybucji adoptyjnie przeniesionych ludzkich limfocytów T w jelicie myszy z niedoborem odporności na colit24. W szczególności w tym środowisku eksperymentalnym wdrożono dwie główne innowacje: (1) pierwotne ludzkie komórki odpornościowe mogą być analizowane w eksperymentalnie zdefiniowanych warunkach in vivo; (2) dość duży obszar chorego narządu (około 1,5 cm x 1,5 cm) można zobrazować w jakości wysokiej rozdzielczości, a następnie przeprowadzić rekonstrukcję 3D. Co więcej, kilka ostatnich badań z powodzeniem ustaliło zastosowanie oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika i mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych jako ważnych narzędzi do zaawansowanego obrazowania płuc 25,26. Aby skorzystać z tego postępu technologicznego w dziedzinie immunologii płuc, przyjęliśmy teraz system do analizy naprowadzania płuc.
Prezentowany tutaj protokół krok po kroku wprowadza do tego, jak oczyszczać i fluorescencyjnie znakować pierwotne ludzkie limfocyty T do transferu do myszy z indukowanym zapaleniem płuc, a ponadto szczegółowo opisuje późniejszy proces obrazowania mikroskopowego fluorescencji za pomocą arkusza świetlnego, w tym przygotowanie narządów i przetwarzanie obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję wesprzeć przyszłe badania translacyjne w dziedzinie zapalnych lub alergicznych chorób płuc poprzez wprowadzenie zaawansowanego, ale mimo to wykonalnego, eksperymentalnego modelu monitorowania naprowadzania ludzkich limfocytów w płucach w warunkach in vivo.

<table><tbody><tr><td>Agarose NEEO Ultra</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFlour594 przeciwciało anty-ludzkie CD45</td><td>BioLegend, San Diego, USA</td><td>304060</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>K2981</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik proliferacyjny komórek eflour670</td><td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi potas-EDTA, 9 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>21066001</td><td></td></tr><tr><td>Ethly cinnamate (ECi)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy</td><td>112372-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol &ge; 99,5% (EtOH)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>5054.3</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca) Good Forte</td><td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Niemcy</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 100 &mikro; m&nbsp;</td><td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Niemcy</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td><td>Bitplane AG, Zurych, Szwajcaria</td><td>n.a.ImspectorPro</td><td></td></tr> <tr><td>software</td><td>Abberior Instruments GmbH, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>n.d.Ketamin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>3617KET-V</td><td></td></tr><tr><td>LaVision UltraMicroscope II</td><td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Niemcy</td><td>n.a.MACS</td><td></td></tr> <tr><td>MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula Multifly 20 G</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>851638035</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 G</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesja, Niemcy</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Neubauer</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td>C-1003</td><td></td></tr><tr><td>Pattex Glue</td><td>Henkel AG & Co, D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td>Kolumna PSK1C</td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów (gęstość 1,077 g/ml)</td><td>anprotec</td><td>AC-AF-0018</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Merck</td><td>1,071,440,025</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anty-ludzki CD4</td><td>BioLegend, San Diego, Stany Zjednoczone</td><td>317428</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 mysz IgG2b, &kappa; izotyp Ctrl</td><td>BioLegend, San Diego, USA</td><td>400337</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyd)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>0335.1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>86.1254.001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesja, Niemcy</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>260067</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td><td>260069</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72,706,400</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 2 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72.695.400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 2 mL, brązowa</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72,695,001</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (Rompun 2%)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy</td><td>KPOBD32</td><td></td></tr></tbody></table>

zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Przytłaczająca akumulacja wysoce aktywowanych komórek odpornościowych stanowi cechę charakterystyczną różnych przewlekłych chorób zapalnych i stała się atrakcyjnym celem terapeutycznym w klinicznym leczeniu dotkniętych pacjentów. W celu dalszej optymalizacji strategii mających na celu regulację terapeutyczną patologicznie niezrównoważonego naciekania tkanek prozapalnych komórek odpornościowych, szczególnie ważne będzie uzyskanie lepszego wglądu w specyficzne dla choroby i narządu właściwości naprowadzania limfocytów obwodowych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny pozwala na monitorowanie akumulacji w płucach znakowanych fluorescencyjnie i adoptywnie przenoszonych ludzkich limfocytów w kontekście zapalenia płuc wywołanego papainą. W przeciwieństwie do standardowych testów in vitro często stosowanych do analizy migracji komórek odpornościowych i chemotaksji, obecnie wprowadzone warunki in vivo uwzględniają specyficzne dla płuc aspekty organizacji tkanek i wpływ złożonego scenariusza zapalnego zachodzącego w żywym organizmie myszy. Co więcej, trójwymiarowe obrazowanie mikroskopowe fluorescencji w przekroju poprzecznym nie tylko dostarcza danych ilościowych na temat naciekających komórek odpornościowych, ale także przedstawia wzorzec lokalizacji komórek odpornościowych w płucach objętych stanem zapalnym. Ogólnie rzecz biorąc, jesteśmy w stanie wprowadzić innowacyjną technikę o wysokiej wartości dla badań immunologicznych w dziedzinie przewlekłych zapalnych chorób płuc, którą można łatwo zastosować, postępując zgodnie z dostarczonym protokołem krok po kroku.

Przedstawiony protokół opisuje eksperymentalny model mysi, który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację akumulacji adoptywnie przeniesionych ludzkich limfocytów T w płucach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszem światła. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przegląd etapów in vivo harmonogramu eksperymentalnego. W celu zagwarantowania wiarygodnych wyników kluczowe jest zapewnienie wysokiej jakości izolowanych i znakowanych fluorescencyjnie ludzkich komórek T CD4<s...

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Nasza technika pozwala na precyzyjne obrazowanie ludzkich komórek odpornościowych zgromadzonych w płucach w warunkach zapalnych in vivo, dostarczając ekscytujących informacji na temat procesu naprowadzania płuc przez limfocyty T. Protokół ten wspiera badania translacyjne nad naprowadzaniem płuc przez limfocyty T, a tym samym może pomóc w identyfikacji nowych celów dla zoptymalizowanej terapii zapalnych lub alergicznych chorób płuc. W szczególności możliwość uwzględnienia wpływu specyficznych dla choroby właściwości komórek odpornościowych, organizacji tkanki płucnej i środowiska zapalnego na naprowadzanie płuc limfocytów T sprawia, że metoda ta jest bardzo korzystna.Ogólnie rzecz biorąc, nasza technika ma dużą wartość dla badań immunologicznych w dziedzinie przewlekłych chorób zapalnych płuc, które często są napędzane przez przytłaczającą akumulację tkankową aktywowanych komórek odpornościowych. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u co najmniej 16-gramowej, sześciotygodniowej, znieczulonej czarnej myszy C57 6J, użyj mikropipety, aby powoli podawać 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu papainy do jednego nozdrza myszy raz dziennie przez trzy kolejne dni. Dzień po ostatnim podaniu papainy należy umieścić 10 mililitrów pożywki Ficoll pod ludzką krwią obwodową od zdrowego ochotnika, wstępnie rozcieńczoną w stosunku jeden do dwóch w PBS w celu separacji gradientu gęstości przez wirowanie.Przenieś obwodową jednojądrzastą krwinkę krwi lub warstwę interfazową PBMC do nowej 50-mililitrowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie należy przeprowadzić izolację mikrokulek magnetycznych komórek CD4-dodatnich zgodnie z protokołem producenta. Ponowne zawieszenie izolowanych limfocytów T CD4 z dodatnim ciśnieniem do jednego razy dziesięć do siódmego limfocytów T na co najmniej 500 mikrolitrów stężenia PBS.Oznacz komórki odpowiednim czerwonym światłem pobudliwym barwnikiem proliferacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję znakowania pięcioma objętościami pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS na pięć minut na lodzie, a następnie trzy płukania w pożywce. W celu adoptywnego transferu ludzkich limfocytów T CD4-dodatnich do myszy biorców narażonych na papainę, ponownie zawiesić fluorescencyjnie znakowane limfocyty T do stężenia jeden razy 10 do siódmych komórek na mililitr w PBS i załadować 100 mikrolitrów komórek do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 na zwierzę biorcy, a następnie wstrzyknąć całą objętość komórek z jednej strzykawki do żyły ogonowej zwierzęcia leczonego papainą, utrzymując końcówkę igły w środku żyły przez dodatkowe pięć sekund po dostarczeniu komórki, aby zapobiec rozładowaniu zawiesiny komórek.Trzy godziny po adoptywnym transferze komórek nakłuj prawą komorę każdej uśpionej myszy kaniulą o rozmiarze 21 podłączoną do cewnika i wykonaj nacięcie w lewej komorze. Powoli perfunduj płuca 20 mililitrami lodowatego PBS uzupełnionego pięciomilimolowym EDTA, a następnie dwoma mililitrami lodowatego 4% paraformaldehydu. Kiedy cały utrwalacz zostanie przepłukany przez tkankę, usuń gruczoły ślinowe i przetnij mięsień gnykowy mostka, aby umożliwić wsunięcie kleszczy pod tchawicę w celu odsłonięcia tkanki rurki powietrznej.Wykonaj wstępne nakłucie odsłoniętej tchawicy igłą o rozmiarze 30 przed zastąpieniem igły cewnikiem o rozmiarze 30, aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu tkanki. Za pomocą uchwytu na igłę uszczelnić połączenie między wprowadzonym cewnikiem a tchawicą i ostrożnie napełnić drogi oddechowe agarozą o temperaturze około 37 stopni Celsjusza 0,75%, aż do całkowitego rozwinięcia się płuc. Ścisłe połączenie między cewnikiem a tchawicą ma kluczowe znaczenie dla rozszerzenia płuc do jego fizjologicznych rozmiarów i utrzymania architektury tkankowej do obrazowania.Gdy agaroza całkowicie zastygnie, wyjmij cewnik i ostrożnie przenieś płuco do ciemnej, dwumililitrowej rurki wypełnionej 4% paraformaldehdye. Następnie odwodnić tkankę za pomocą sekwencyjnych inkubacji etanolu w ciągłej rotacji z prędkością 31 obrotów na minutę i w czterech stopniach Celsjusza, jak wskazano, przez cztery godziny na inkubację. Po całkowitym odwodnieniu przenieść próbkę do cynamonianu etylu na nocną inkubację w temperaturze pokojowej, aż tkanka stanie się przezroczysta.W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza użyj małej kropli kleju stabilnego w rozpuszczalniku organicznym, aby przykleić płuco do uchwytu próbki mikroskopu i ustaw płatek płuca na uchwycie w pozycji pionowej. Umieść uchwyt na próbkę w jego komorze i wybierz odpowiednie lasery do eksperymentu w oprogramowaniu instrumentu. Następnie użyj suwaków w obszarze Optyka, aby ustawić szerokość arkusza i aperturę numeryczną, która równomiernie odsłania cały narząd lub określoną sekcję zainteresowania.Użyj suwaka, aby ustawić intensywność lasera pod kontrolą transmisji laserowej dla każdego wybranego lasera i kliknij przycisk Zastosuj. Użyj zaawansowanych ustawień pomiaru, aby scalić lewy i prawy arkusz świetlny w celu utworzenia jednorodnie oświetlonego obrazu. Zdefiniuj pozycję początkową i końcową stosu Z, który ma być mierzony w zakresie skanowania, i ustaw rozmiar kroku na pięć mikrometrów, a następnie wybierz opcję autozapis, aby automatycznie zapisać pliki i rozpocząć pomiar w celu przechwycenia obrazów.Po uzyskaniu wszystkich obrazów aktywuj przycisk Surpass w oprogramowaniu do analizy 3D po obrazowaniu i załaduj pierwszy obraz z jednego stosu Z, aby zainicjować otwieranie i automatyczną rekonstrukcję 3D wszystkich innych obrazów wybranego stosu Z, a następnie w obszarze Regulacja wyświetlania dostosuj intensywność, poziom czerni i kontrast dla każdego kanału. Aby porównać nagromadzenie komórek ludzkich w tkance płucnej w różnych próbkach, wybierz opcję Edytuj i Przytnij 3D, aby zdefiniować sześcian płuc o określonej objętości. Aby określić ilościowo oznaczone komórki w zdefiniowanym sześcianie płuc, otwórz Dodaj nowe miejsca na pasku narzędzi, kliknij Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie i wybierz kanał 640 nanometrów.Ustaw skalę promienia na 10,00 mikronów, kliknij przycisk Wybierz, a następnie w obszarze Edycja kliknij lewym przyciskiem myszy, aby indywidualnie oznaczyć każdą fluoryzującą komórkę kropką. Ogólna liczba zliczonych komórek zostanie wyświetlona w statystykach. Aby przechwycić obraz, użyj narzędzia migawki lub użyj narzędzia animacji, aby przechwycić wideo.Wzbogacanie komórek za pomocą mikrokulek, a następnie znakowanie fluorescencyjne, jak wykazano, zwykle skutkuje czystością CD4 dodatnią co najmniej 95% i pomyślnym znakowaniem tych komórek, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej. Oczyszczanie tkanek na bazie cynamonianu etylu osiąga wysoki poziom przezroczystości narządów, co wskazuje na pomyślne dopasowanie współczynnika załamania światła. Sygnał autofluorescencyjny tkanki płucnej stanowi pomocne narzędzie do obrazowania struktury anatomicznej płuc za pomocą mikroskopii świetlnej, która może być wyświetlana jako projekcja średniej intensywności lub w trybie powierzchniowym.W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią, mikroskopia arkuszowa ma tę zaletę, że obrazowanie całego narządu i późniejsza rekonstrukcja 3D umożliwiają identyfikację i wizualizację znakowanych barwnikiem proliferacji, przeniesionych ludzkich komórek T w kontekście całego narządu, ponadto preferencja przenoszonych ludzkich limfocytów T do selektywnej akumulacji w tkance płucnej stanu zapalnego zwierząt narażonych na papainę jest dodatkowo wspierana przez fakt, że nie można odzyskać ludzkich limfocytów T CD4 dodatnich z błony śluzowej jelit zwierząt biorców. W celu ilościowego określenia i porównania akumulacji płucnej ludzkich limfocytów T CD4-dodatnich w różnych warunkach, znakowane komórki można również policzyć w kilku kostkach płuc o określonej objętości, jak pokazano. Staranne przygotowanie tkanek, w tym perfuzja płuc, napompowanie i oczyszczenie tkanek, jest bardzo ważne dla zoptymalizowanego generowania obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości.Aby dodatkowo potwierdzić udaną diapedezę przeniesionych ludzkich limfocytów, protokół ten można łatwo połączyć z cytometryczną cytometryczną kwantyfikacją ludzkich limfocytów w mysim popłuczynku oskrzelowo-pęcherzykowym. Zdolność do monitorowania komórek odpornościowych pochodzących od poszczególnych pacjentów w warunkach in vivo wspiera identyfikację zmian funkcjonalnych w komórkach odpornościowych wdrukowanych przez określoną chorobę lub terapię.

advanced-imaging-lung-homing-human-lymphocytes-an-experimental-vivo

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj zaawansowaną metodę obrazowania ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w modelu zapalenia alergicznego in vivo przy użyciu mikroskopii arkuszowej światła. Ta technika umożliwia badanie dynamiki komórek T w tkance płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła (Wideo) | JoVE Journal

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Przeglądaj więcej filmów