Analiza wskaźnika zużycia tlenu w pierwotnych kardiomiocytach noworodków myszy z hodowlą pierwotną przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Protokół ten pozwala nam wyizolować i wyhodować wysoki poziom bi-BBT, znany tylko kardiomiocytom myszy. Aby ocenić funkcję mitochondriów, tempo zużycia tlenu przez kardiomiocyty można przeanalizować za pomocą rzeczywistego analizatora strumienia srebra. Jedną z zalet tej techniki jest to, że zużycie tlenu przez kardiomiocyty można łatwo zmierzyć w stanie przylegającym w formacie 96-dołkowym, co umożliwia testowanie wielu stanów z dużą liczbą powtórzeń.

Naczynie to dostarcza ważnych informacji na temat obszaru badawczego kardiologii. Oprócz zużycia tlenu możemy również badać inne parametry metaboliczne, takie jak grekwity i epoksydacja nadkwasowa. Osiągnięcie wysokiej zmienności kardiomiocytów ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu.

Wymaga to sprawnego trawienia serc. Ponieważ kardiomiocyty noworodków są bardzo delikatne, ważne jest również delikatne obchodzenie się z kardiomiocytami. W kapturze do hodowli komórkowych podwielokrotnić 5 ml HBSS do każdego dołka na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i umieścić go na lodzie.

Ponadto przelej 10 ml HBSS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych, a następnie przygotuj 20 ml roztworu do wstępnego trawienia trypsyny w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie. Następnie wyekstrahuj serce i natychmiast przenieś je do sterylnego naczynia do hodowli komórek zawierającego HBSS.

Usuń resztki tkanki płucnej i większe naczynia. Umyj serce w HBSS, delikatnie mieszając. Następnie pokrój serce cienkimi nożyczkami na 8 kawałków i przenieś tkankę serca za pomocą kleszczy do jednego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z HBSS.

Za pomocą łyżki Moria umyj tkankę serca, przenosząc ją ze studzienki do studzienki na 6-dołkową płytkę wypełnioną HBSS. Następnie przenieś tkankę serca do stożkowej probówki zawierającej 20 ml trypsyny i inkubuj z delikatnym mieszaniem w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 4 godziny. W tej procedurze podgrzej roztwór do trawienia kolagenazy w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieś stożkową rurkę zawierającą tkankę serca i roztwór do wstępnego trawienia z 4 stopni Celsjusza do okapu do hodowli komórkowych. Pozwól, aby tkanka serca opadła na dno probówki i usuń roztwór wstępnego trawienia za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Następnie dodaj 10 ml HBSS do probówki.

Ponownie zawiesić tkankę serca za pomocą HBSS 2 do 3 razy, aby wypłukać trypsynę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odessać HBSS i dodać 10 ml podgrzanego roztworu do trawienia kolagenazy do probówki z tkanką serca. Do pierwszego trawienia inkubuj probówkę z tkanką serca w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut bez mieszania.

Następnie przenieś probówkę do okapu do hodowli komórkowych. Rozetrzeć tkankę, delikatnie ją ponownie zawieszając 10 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Umożliwi to rozproszenie serca i uwolnienie komórek z tkanki serca.

Niech niestrawiona tkanka opadnie. Przenieś strawiony roztwór wzbogacony w kardiomiocyty do nowej stożkowej rurki i natychmiast dodaj równą ilość pożywki do hodowli komórkowych, aby zatrzymać trawienie kolagenazy. Następnie dodaj 10 ml roztworu do trawienia kolagenazy do probówki zawierającej pozostałą niestrawioną tkankę serca.

Do drugiego trawienia inkubuj rurkę z tkanką serca w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Powtórz procedury pierwszego trawienia i przenieś strawiony roztwór wzbogacony w kardiomiocyty do nowej stożkowej rurki przed zatrzymaniem trawienia kolagenazy. Następnie umieść sterylne sitko do komórek w nowej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

Wstępnie zwilż sitko komórkowe 2 do 3 ml pożywki do hodowli komórkowych i przepuść komórki przez sitko komórkowe. Następnie przepłucz sitko komórkowe pożywką do hodowli komórkowych. Następnie odwiruj stożkową rurkę zawierającą kardiomiocyty przez 5 minut przy 180-krotności grawitacji.

Po 5 minutach odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i inkubuj je przez godzinę. Następnie delikatnie porusz płytką.

Zmyć nieprzylegające komórki i ponownie zawiesić komórki, wielokrotnie pipetując pożywkę do hodowli komórkowych na naczyniu za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Następnie przenieś nieprzylegające komórki do nowego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej i inkubuj je przez kolejną godzinę. Po godzinie delikatnie porusz płytkę i zmyj nieprzylegające komórki.

Przenieś kardiomiocyty do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę hodowlaną, dzieląc 50 mikrolitrów roztworu powlekającego w każdym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Jeśli obecne są bąbelki, usuń je za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić wyschnięcie powłoki matrycy. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Umieść komórki na pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej o gęstości od 10 do 30 tysięcy komórek na dołek.

I umieść komórki w inkubatorze. Aby przygotować test zużycia tlenu, należy uwodnić wkład czujnika analizatora strumienia przez co najmniej 3 godziny, dodać 200 mikrolitrów roztworu kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej. Umieść wkład czujnika z powrotem na płytce użytkowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez suplementacji CO2 lub O2 przez co najmniej 3 godziny.

Na godzinę przed testem delikatnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych i dwukrotnie umyj komórki 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki do badania wysiłków mitochondrialnych. Po drugim praniu dodaj 175 mikrolitrów podgrzanej pożywki do testów wysiłkowych w mitochondriach. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez suplementacji dwutlenkiem węgla lub tlenem.

Przygotować 3 ml każdego z badanych związków w mitochondrialnej pożywce do testów wysiłkowych. Załaduj 25 mikrolitrów każdego związku do portów wtryskiwaczy wkładu czujnika za pomocą pipety wielokanałowej. Stan komórek i wszelkie obróbki wstępne mogą wpływać na maksymalną odbudowę uzyskaną przez wstrzyknięcie rozprzęgacza FCCP.

Wrażliwość komórek na rozprzęgacz może również ulec zmianie, dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie stężenia roboczego FCCP dla każdego konkretnego zabiegu. Następnie skonfiguruj protokół testu strumienia zewnątrzkomórkowego i uruchom program. Najpierw włóż kartiridge czujnika do maszyny w celu kalibracji.

Wymień kaliber płytki testowej po zakończeniu etapu kalibracji. W razie potrzeby, po wykonaniu testu, ostrożnie wyrzuć całe podłoże testowe za pomocą pipety wielokanałowej. I przechowuj mirkopłytkę hodowli komórkowej w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza w celu przyszłej normalizacji komórek za pomocą testu białkowego.

Korzystając z opisanego protokołu, serca izolowano od 0 dnia noworodków, a kardiomiocyty wysiewano w gęstości 10, 20 lub 30 tysięcy komórek na studzienkę na płytkach 96-dołkowych. Po całonocnej hodowli stwierdzono, że kardiomiocyty są dobrze przyczepione do powlekanej powierzchni z tworzywa sztucznego i jest bardzo mało nieprzyłączonych komórek. W tym momencie spontanicznie kurczące się kardiomiocyty były łatwo widoczne.

Gęstość wysiewu wynosząca 30 000 komórek na studzienkę wykazała konfluencję jednego dnia po wysiewie, gdy komórki się rozprzestrzeniały. Kardiomiocyty wybarwiono immunologicznie przeciwciałem przeciwko sarkomerowej alfa aktyninie, markerowi specyficznemu dla kardiomiocytów. Jak pokazano tutaj, większość komórek wykazywała dodatnie barwienie alfa-aktyniny, co wskazuje na wysoką czystość izolacji kardiomiocytów.

Schemat jednego typowego mitochondrialnego testu wysiłkowego jest pokazany tutaj. Test wysiłkowy mitochondriów rozpoczyna się od podstawowego pomiaru wskaźnika zużycia tlenu, po którym następuje wstrzyknięcie oligomiozyny, która hamuje ATPA. Następnie wstrzyknięto środek rozprzęgający FCCP w celu zmierzenia maksymalnego wskaźnika zużycia tlenu.

Wreszcie, po wstrzyknięciu dwóch inhibitorów kompleksu transportu elektronów, oddychanie mitochondrialne całkowicie ustaje, a OCR spada do najniższego poziomu. Aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki. Ma to kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej przeżywalności.

Dlatego ważne jest, aby używać nowonarodzonych noworodków i delikatnie obchodzonych tkanek serca w kardiomiocytach. Wykorzystując nowe lub istniejące genetycznie zmodyfikowane linie myszy, metodę tę można łatwo przełożyć na dane, które mogą prowadzić do zrozumienia nowych mechanizmów regulacji bioenergetycznej w sercu. Mitochondria odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu serca.

Oczekujemy, że ta metoda pomoże zidentyfikować nowe regulatory i szlaki regulujące metabolizm utleniający oraz znaleźć nowe cele terapeutyczne w leczeniu niewydolności serca.