Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach
19 lutego 2019
Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.
Metoda ta może ujawnić przestrzenne wzorce ekspresji genów bakteryjnych i strategie fizjologicznej adaptacji do mikrośrodowisk tkanek gospodarza, które są tracone po uśrednieniu w całej populacji w tkankach. Dzięki tej technice można wykryć potencjalne niejednorodności, które należy wziąć pod uwagę przy identyfikowaniu nowych szlaków bakteryjnych i białek, które mają być celem związków przeciwwirusowych lub przeciwbakteryjnych. Zacznij od narysowania interesujących szczepów S.aureus na płytkach z agarem krwi z zamrożonego bulionu glicerolowego i inkubacji płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin, aby potwierdzić ich hemolityczne fenotypy w oparciu o ich zdolność do lizy czerwonych krwinek i tworzenia przezroczystych stref.
Zaszczepić pojedyncze izolaty kolonii każdego szczepu w czterech mililitrach bulionu sojowego tryptycznego lub TSB w sterylnych szklanych probówkach i obracać probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin w rolce rurowej pod kątem około 70 stopni i 70 obrotów na minutę. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną kultur na poziomie 600 nanometrów lub OD 600 na spektrofotometrze i rozcieńcz komórki do OD 600 0,05 w 25 mililitrach sterylnego TSB w stosunku pięć do jednego kolby do objętości w 125-mililitrowych kolbach Delonga. Inkubuj kultury w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 280 obrotów na minutę i zbieraj komórki w fazie wykładniczej.
Osadzać komórki przez odwirowanie i umyć komórki dwa razy w równej objętości sterylnego PBS. Następnie ponownie zawiesić komórki w świeżym PBS do jednego razy 10 do ósmego stężenia tworzącego kolonię na mililitr w celu ich późniejszego wstrzyknięcia zwierzęciu biorcy. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zbierz nerki, serce, wątrobę, płuca i śledzionę do 15-mililitrowych probówek polipropylenowych zawierających 10% buforowanej formaliny na 24 do 48 godzin inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem lub obracaniem.
Pod koniec utrwalania należy zanurzyć narządy w klarownym podłożu do zamrażania tkanek w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą kriostatu pozyskać skrawki tkanek o grubości 10 mikrometrów i suszyć je na indywidualnych, wstępnie oczyszczonych, naładowanych szkiełkach przez 20 minut w ciemności przed nałożeniem twardego podłoża mocującego uzupełnionego DAPI. Następnie nałóż szkiełka nakrywkowe i utwardź je w temperaturze pokojowej przez noc przed przeniesieniem próbek do długotrwałego przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby zidentyfikować zmiany chorobowe w próbkach, należy umieścić szkiełko na stoliku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i użyć odpowiedniego celu do wizualizacji poszczególnych komórek, aby uzyskać obrazy zmian. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji w obrazach konfokalnych, otwórz obraz w ImageJ i dostosuj jasność i kontrast, aby prawidłowo zobrazować sygnał fluorescencji zmiany. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do wyboru wielokątów i dodaj ROI do menedżera ROI na karcie Edytuj w ImageJ.
Wybierz pozycję Edytuj, następnie Zaznaczenie, a na końcu Dodaj do menedżera. Następnie zmień nazwę ROI i oznacz odpowiedni obraz. Aby zdefiniować środek ciężkości, otwórz kartę Analiza i wybierz opcje Obszar, Średnia wartość szarości, Środek ciężkości i Ogranicz do progu.
Wyodrębnij wartość intensywności fluorescencji środka ciężkości lub zmierz średnią intensywność fluorescencji w danej zmianie na jednostkę powierzchni. Można to osiągnąć, korzystając z funkcji progowania, aby w razie potrzeby ustawić dolną i górną granicę fluorescencji. Eksportuj dane do pliku Excel i przygotuj kolumnę wskazującą średnią intensywność fluorescencji na jednostkę powierzchni dla obrzeży i rdzenia.
Aby obliczyć średnie natężenia fluorescencji na jednostkę powierzchni na obrzeżach i w rdzeniu, należy ręcznie zdefiniować górną i dolną granicę progów. Fluorescencja termonukleazy gronkowcowej gronkowca złocistego GFP jest średnio prawie dziewięciokrotnie wyższa w komórkach będących nosicielami genu fuzyjnego niż w komórkach nieposiadających fuzji reporterowej. Podobnie, tandemowa dimeryczna fluorescencja fuzji pomidorów jest około sześciokrotnie wyższa niż w przypadku zerowej kontroli reporterowej.
Wzorzec aktywności reporterowej można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej z homogenatami tkankowymi. Chociaż różnice w fałdowaniu fluorescencji są zwykle niższe. Różnice w pomiarach fluorescencji mogą wynikać z niejednorodnej ekspresji reporterów.
Na przykład w tych reprezentatywnych próbkach zaobserwowano, że niektóre zmiany wykazywały ekspresję jednego lub obu reporterów w odległości około 100 mikrometrów w tej samej próbce tkanki. Badanie aktywności reporterowej do rozdzielczości pojedynczej komórki w społecznościach ropni gronkowcowych ujawnia przestrzenną regulację ekspresji termonukleazy Staphylococcus aureus w ropniach ograniczonych silnym barwieniem DAPI, prawdopodobnie związanym z tworzeniem i uwalnianiem zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Na przykład znacznie wyższą fluorescencję termonukleazy gronkowcowej GFP obserwuje się w wewnętrznym rdzeniu społeczności ropni gronkowcowego w porównaniu z zlokalizowaną na obrzeżach.
W tym samym ropniu wzór tandemowej dimerycznej fluorescencji fuzji pomidorów wydaje się być odwrócony. Jednak wzorzec w tym eksperymencie nie był statystycznie istotny. Uzyskanie nienaruszonych kriogenicznych rozwarstwień ma zasadnicze znaczenie dla analizy obrazu fluorescencyjnego i powinno być wykonane ostrożnie.
Sortowanie komórek bakteryjnych w celu uchwycenia subpopulacji wyrażających fuzję w różnym stopniu, w połączeniu z analizą RNA-Seq, może rzucić światło na zmiany w transkryptomie w całym genomie. Zachowaj ostrożność podczas pracy z formaliną, ponieważ jest ona rakotwórcza i może powodować podrażnienie skóry, reakcje alergiczne lub uszkodzenie oczu przy bezpośrednim narażeniu. Wygenerowanie zmutowanych pochodnych szczepów przenoszących interesujące nas reportery fluorescencyjne może pomóc w ujawnieniu genetycznych podstaw obserwowanych przestrzennych wzorców regulacyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ta metoda ujawnia przestrzenne wzorce ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierząt, podkreślając zróżnicowanie fenotypowe w odpowiedzi na środowiska tkankowe podczas infekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Analiza ekspresji genów
Tło
- Rozumienie zachowania bakterii w tkankach gospodarza jest kluczowe dla opracowywania nowych strategii terapeutycznych.
- Tradycyjne metody mogą pomijać ważne różnorodności w populacjach bakterii.
- Ta technika pozwala na szczegółową analizę na poziomie komórkowym.
- Może pomóc w identyfikacji nowych ścieżek bakteryjnych i białek do wycelowania.
Cel badania
- Aby analizować ekspresję genów bakteryjnych w tkankach zwierząt.
- Aby badać zróżnicowanie fenotypowe bakterii podczas infekcji.
- Aby zidentyfikować potencjalne cele dla związków przeciwwirulencyjnych lub przeciwbakteryjnych.
Zastosowane metody
- Nasmażanie szczepów S. aureus na płytkach z krwistym agarem i inkubacja w celu potwierdzenia fenotypu hemolitycznego.
- Inokulacja pojedynczych izolatów kolonii w bulionie sojowym tryptykowym i inkubacja w określonych warunkach.
- Pomiar gęstości optycznej w celu standaryzacji kultur bakteryjnych.
- Zbieranie komórek w fazie eksponencyjnego wzrostu w celu analizy.
Główne wyniki
- Przestrzenne wzorce ekspresji genów zostały pomyślnie zidentyfikowane.
- Wykryto różnorodności w populacjach bakteryjnych.
- Metoda dostarczyła wglądu w strategie adaptacji bakterii.
- Sugerowano potencjalne nowe cele dla związków przeciwbakteryjnych.
Wnioski
- Ta metoda poprawia rozumienie zachowania bakterii w tkankach gospodarza.
- Jest cennym zasobem dla przyszłych badań nad infekcjami bakteryjnymi.
- Wyniki mogą prowadzić do ulepszonych strategii zwalczania chorób bakteryjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Spatially resolved fluorescence-based quantification of bacterial gene expression in infected tissues enables mechanistic de-risking and target validation for anti-virulence drug discovery. This approach reveals heterogeneity and microenvironment-driven regulation that are masked by bulk analyses, supporting predictive confidence in target selection and translational continuity from discovery to preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of candidate virulence gene regulation in physiologically relevant tissue contexts.
- Supports functional target validation by revealing spatial and temporal heterogeneity in gene expression.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping regulatory network responses to host microenvironments.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets with context-dependent activity.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for multiplexed reporter analysis in complex tissue architectures.
- Delivers quantitative, single-cell resolution outputs for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of genetic or chemical perturbations for effects on spatial gene regulation.
- Supports development of robust, scalable assays for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery-stage findings with disease-relevant tissue models for translational biomarker development.
- Maintains continuity from in vitro to in situ and in vivo validation of target engagement.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by revealing context-dependent target activity.
- Supports preclinical model selection based on spatial regulatory patterns observed in infection sites.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based method bridges early discovery and preclinical validation by enabling direct, quantitative analysis of bacterial gene regulation in infected tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping gene expression at single-cell resolution in situ.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides spatially resolved fluorescence intensity measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of discovery data with preclinical infection models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any genetically tractable bacterium and infection model, supporting broad portfolio applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue processing and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage by revealing context-dependent target activity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-virulence and antibacterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, tissue processing, and advanced fluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable across bacterial species and infection models with genetic tractability.
- Dependent on careful tissue handling to preserve spatial integrity for accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Bacterial Inoculum Preparation and Infection
2:17
Organ Harvest and Tissue Processing
3:20
Laser Scanning Confocal Microscopy and Image Processing
4:52
Results: Representative Localization of nuc-sGFP in the Staphylococcal Abscess Microenvironment
6:22
Conclusion
