Name: Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjną analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych zakażonych S. aureus. Technika ta ujawnia przestrzenne wzory ekspresji i heterogeniczność populacji bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alexandrowi Horswillowi za dar fuzji PsarAP1-tdTomato oraz Karen Creswell za pomoc w analizie cytometrii przepływowej. Dziękujemy również Alyssie King za porady dotyczące analizy statystycznej. Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH Exploratory/Developmental Research Award (grant AI123708) oraz fundusze na rozpoczęcie pracy przez wydział dla SRB. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Georgetown.
1. Generacja fluorescencyjnego szczepu reporterowego
<ol>
	<li>Sekwencyjnie trawić integrujący genom wektor pRB4 za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoRI i SmaI. Postępując zgodnie z protokołem producenta, należy przeprowadzić roztwarzanie przez noc za pomocą SmaI przy użyciu 1 μg pRB4 w temperaturze 25 °C, a następnie kontynuować drugie trawienie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, dodając EcoRI do mieszaniny reakcyjnej. Dezaktywować enzymy przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
	<li>PCR amplifikuje region regulatorowy będący przedmiotem zainteresowania z genomowego DNA (w tym przypadku fragment DNA o parach zasad ~ 350 zawierający region promotora termonukleazy [nuc]), zawierający miejsce restrykcyjne 5' EcoRI i miejsce restrykcyjne 3' SmaI. Sekwencja rozpoznawania SmaI musi znajdować się w ramce z translacyjnym kodonem start. W tym badaniu PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z zaleceniami producenta z starterem do przodu oRB015 (5'-atcattgaattccaaagtaaattataagttatac-3') i starterem odwrotnym oRB016 (5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Temperatura wyżarzania wynosiła 53 °C. Powstały fragment należy oczyścić za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Trawić otrzymany produkt PCR za pomocą EcoRI i SmaI, jak wykonano w kroku 1.1, i ligować strawiony fragment DNA do tych samych miejsc pRB4 przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z zaleceniami producenta w celu wytworzenia konstruktu integracyjnego. Wprowadzić mieszaninę ligacji do E. coli i potwierdzić sekwencję konstruktu.</li>
	<li>Elektropomuluj konstrukt do szczepu S. aureus RN4220, jak wcześniej opisano34. Krótko mówiąc, użyj 1 μg plazmidu z 70 μl elektrokompetentnych ogniw (100 Ω, 25 μF i 2,3 kV) w bulionie B2 (1% [w/v] hydrolizat kazeiny, 2,5% [w/v] ekstrakt drożdżowy, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] Glukoza). Wybrać odporność na erytromycynę (Emr) w temperaturze dopuszczalnej (30 °C) na tryptycznym agarze sojowym (TSA) uzupełnionym erytromycyną (5 μg mL-1) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydem (X-Gal; 80 μg mL-1). Powstałe transformanty są niebieskie ze względu na aktywność β-galaktozydazy kodowanej przez plazmid. 
	nuta: Transfer DNA do izolatów klinicznych jest niezwykle trudny ze względu na silną barierę restrykcyjno-modyfikacyjną35. Tak więc S. aureus RN4220 został użyty jako pośredni biorca konstruktu fuzyjnego, ponieważ ma niedobór ograniczeń i jest wysoce transformowalny.</li>
	<li>Przenieś plazmid do szczepu S. aureus USA300 będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą elektroporacji lub transdukcji za pośrednictwem fagów36 w temperaturze dopuszczalnej. Krótko mówiąc, rozpropaguj cząsteczki bakteriofaga Φ11 na szczepie dawcy za pomocą płytek TSA zawierających 5 mM CaCl2 przez noc w temperaturze 30 °C, a następnie sterylizuj przez filtrację przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,45 μM. Użyj lizatów do transdukcji szczepu S. aureus LAC do Emr. 
	nuta: LAC jest szeroko stosowanym izolatem klinicznym, który wcześniej był wrażliwy na Em poprzez szeregowe przejście w pożywce TSB w celu wyleczenia szczepu natywnego plazmidu pUSA03, który nadaje Emr 37,38.</li>
	<li>Zintegruj konstrukt za pomocą dwóch, następujących po sobie zdarzeń rekombinacji homologicznej z chromosomem, jak opisano wcześniej32. Rekombinanty są odporne na chloramfenikol (Cmr) na płytkach TSA zawierających 5 μg mL-1 chloramfenikolu, wrażliwego na erytromycynę (Erms) i już nie niebieskiego. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, ponownie wprowadź oznaczoną fuzję do USA300 poprzez transdukcję za pośrednictwem faga, aby uniknąć akumulacji mutacji związanych z pasażem szczepu in vitro39 i zmianami temperatury.</li>
</ol>
2. Zakażenie zwierząt: przygotowanie inokulum, zakażenie ogólnoustrojowe i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotowanie inokulum bakteryjnego
	<ol>
		<li>Szczepy Streak S. aureus będące przedmiotem zainteresowania do izolacji na płytkach z agarem z krwi z zamrożonego bulionu glicerynowego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16–24 godziny w celu potwierdzenia fenotypów hemolitycznych na podstawie ich zdolności do lizy czerwonych krwinek (RBC) i tworzenia przezroczystych stref.</li>
		<li>Zainicjuj nocne hodowle, zaszczepiając pojedyncze kolonie każdego szczepu do 4 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w sterylnych szklanych probówkach. Obracaj rury w temperaturze 37 °C przez 16–24 godzin w rolce rurowej ustawionej pod kątem około 70° i 70 obrotów na minutę [RPM].</li>
		<li>Użyć spektrofotometru do zmierzenia gęstości optycznej kultur z kroku 2.1.2 przy długości fali 600 nm (OD600). Użyj sterylnego podłoża jako odniesienia optycznego (ślepego namiaru). Rozcieńczyć te komórki do OD600 0,05 w 25 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w oddzielnych 125 ml kolbach DeLonga (stosunek kolby 5:1 do objętości) i inkubować kultury w łaźni wodnej (dla prawidłowego przenoszenia ciepła do kultur), wytrząsając z prędkością 280 obr./min i ustawiając na 37 °C. 
		UWAGA: Wzrost inokulum może być przeprowadzony na różne sposoby; Przedstawiono jedną z metod hodowli komórek do fazy wykładniczej. Niezależnie od tego, ważne jest, aby konsekwentnie stosować tę samą metodę do przygotowania komórek do zaszczepienia.</li>
		<li>Przy OD600 ~1 ponownie rozcieńczyć komórki na świeżej pożywce do początkowego OD600 0,05, aby upewnić się, że komórki osiągną fazę wykładniczą i że czynniki, które gromadzą się podczas inkubacji przez noc, zostały zredukowane do poziomów fazy wykładniczej.</li>
		<li>Zbierz komórki w fazie wykładniczej (OD600 ~ 0,6–0,8), wirując przy 3,000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć granulki dwukrotnie w równoważnej objętości sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4).</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1x PBS (pH 7,4) do stężenia 1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) mL-1 lub odpowiednio do pożądanego eksperymentu. 
		UWAGA: ważne jest, aby określić związek między OD600 a CFU mL-1 dla każdego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ zależne od szczepu zmiany wielkości i kształtu komórek mogą wpływać na właściwości rozpraszania światła, a ostatecznie na dawkę infekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zwierząt i infekcja bakteryjna
	<ol>
		<li>Aklimatyzuj myszy przez 7 dni na oczyszczonej diecie AIN-93. Dieta została opracowana tak, aby zapewnić odpowiednie odżywianie przy jednoczesnym zmniejszeniu autofluorescencji tkanek związanej ze spożyciem składników roślinnych stosowanych w standardowej klasie chow40. 
		nuta: Wykorzystuje się tutaj samice myszy C57/BL6 (w wieku 6-8 tygodni), ale szczep myszy i płeć będą zależeć od badania.</li>
		<li>Przed infekcją rozszerz żyły ogona myszy letnią wodą.</li>
		<li>Zakażone zwierzęta należy wprowadzić w postaci wstrzyknięcia 100 μl inokulum bakteryjnego przez żyły ogonowe w celu wywołania infekcji ogólnoustrojowej. W przypadku wykonywania cytometrii przepływowej należy zachować podwielokrotność początkowego inokulum (patrz punkt 4).</li>
		<li>Codziennie monitoruj zwierzęta i oceniaj ich stan zdrowia za pomocą systemu monitorowania sprawdzonego i zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.</li>
		<li>Pozwól, aby infekcja postępowała przez pożądany czas. W tym przypadku eksperymenty są przerywane 3 dni po infekcji. 
		nuta: W tych warunkach ropnie składają się ze społeczności bakterii z ropniem gronkowcowym, otoczonej złogami fibryny i otoczonej koncentrycznymi warstwami komórek odpornościowych5,41.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie narządów i przetwarzanie tkanek
	<ol>
		<li>Eutanazja zwierząt przez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy jako metoda wtórna i przeprowadzenie sekcji zwłok.</li>
		<li>Pobrać nerkę (po prawej) i inne ważne narządy (serce, wątrobę, płuca, śledzionę) i przenieść do 15 ml probówek polipropylenowych zawierających 10% buforowaną formalinę. Przejdź do kroku 2.3.4 poniżej.</li>
		<li>Przenieś lewą nerkę do sterylnej, odpornej na uderzenia probówki o pojemności 2 ml zawierającej ~500 μl kulek krzemionkowych o średnicy 2 mm i 1 ml sterylnego 1x PBS (pH 7,4). Przejdź do kroku 4.2 z tym narządem.</li>
		<li>Pozwól narządom z kroku 2.3.2 utrwalić się w ciemności w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając lub obracając, przez co najmniej 24 godziny, ale nie dłużej niż 48 godzin.</li>
		<li>Osadzać narządy w klarownym podłożu do zamrażania tkanek i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu pokrój tkankę na plastry o grubości 10 μm.</li>
		<li>Wysuszyć skrawki na wstępnie oczyszczonym, naładowanym szkiełku podstawowym przez 20 minut w ciemności, nałożyć twarde podłoże mocujące z barwnikiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI) i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zamontowane szkiełka utwardzić w temperaturze pokojowej przez noc i przenieść do temperatury 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna i przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Zbadaj zamontowane szkiełka, aby zlokalizować zmiany chorobowe za pomocą laserów odpowiednich dla używanego reportera fluorescencyjnego. W tym przypadku używane są sygnały fluorescencyjne zielony (GFP), czerwony (tdTomato) i niebieski (DAPI).</li>
	<li>Uzyskaj obraz za pomocą odpowiedniego obiektywu do wizualizacji pojedynczych komórek (np. zwykle używane są obiektywy 20x lub 40x).</li>
	<li>Zmierz natężenie fluorescencji w obrazach konfokalnych.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz konfokalny na obrazie J i dostosuj jasność/kontrast, aby prawidłowo zobrazować sygnał fluorescencyjny zmiany.</li>
		<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania i korzystając z opcji Thresholding, ustaw dolną i górną granicę fluorescencji zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Zdefiniuj środek ciężkości, wybierając opcję Obszar → Średnia wartość szarości → Środek ciężkości → Ogranicz do progu na karcie Analizuj na obrazie J. </li>
		<li>Ekstrahować wartość intensywności fluorescencji środka ciężkości lub mierzyć średnią intensywność fluorescencji w danej zmianie na jednostkę powierzchni (średnia intensywność fluorescencji, MFI) dla GFP i tdTomato. W tym przypadku użyto powierzchni o wielkości jednegoμm2. 
		nuta: Druga analiza z zaślepioną próbą minimalizuje błąd systematyczny, gdy znana jest tożsamość próbki.</li>
		<li>Wykreśl dane i wykonaj odpowiednie analizy statystyczne dla każdego porównania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>(Opcjonalnie) Określić aktywność fuzyjną inokulum w dniu zakażenia (z sekcji 2.2.3)
	<ol>
		<li>Do 899 μL 1x sterylnego PBS (pH 7,4) dodaj 100 μL każdego inokulum i 1 μL barwnika kwasu nukleinowego przenikanego przez błonę (patrz tabela materiałów). Jako kontrolę należy dołączyć próbkę pozbawioną barwienia kwasem nukleinowym.</li>
		<li>Wykonać cytometrię przepływową na wszystkich próbkach. 
		nuta: W pierwszym eksperymencie przydatne jest uwzględnienie tylko sterowania wektorowego dla fuzji będącej przedmiotem zainteresowania, aby określić właściwe napięcie do użycia. Wyraźna separacja między próbkami dodatnimi i ujemnymi jest niezbędna do analizy danych, co wskazuje, że osoba zgłaszająca znajduje się znacznie powyżej sygnału tła.</li>
		<li>Aby zidentyfikować populację bakterii, wykreśl zdarzenia za pomocą barwienia kwasem nukleinowym (oś y) i rozproszenia do przodu (oś x).</li>
		<li>Narysuj bramkę inkluzji wokół zdarzeń, które są zarówno dodatnie pod względem barwienia kwasem nukleinowym, jak i mają prawidłowy rozmiar bakterii na podstawie rozproszenia do przodu (od 0,5 do 2,0 μm dla S. aureus). 
		nuta: Bądź rygorystyczny podczas identyfikowania tej populacji, ponieważ bardzo ważne jest uwzględnienie zdarzeń, które wyraźnie mieszczą się w tych parametrach. Należy upewnić się, że bramka ta wyklucza wszystkie zdarzenia dotyczące kontroli ujemnych w innych warunkach. W tym badaniu około 70% populacji komórek spełniło te wymagania w analizie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek tkanek po uśmierceniu:
	<ol>
		<li>Poddać zwierzęta eutanazji, pobrać lewe nerki (patrz krok 2.3) i przenieść do probówek do ubijania kulek zawierających 1 ml 1x sterylnego PBS (pH 7,4) i 250 μl 2 mm kulek borokrzemianowych.</li>
		<li>Rozbijaj tkanki, aby uwolnić komórki bakteryjne. W przypadku nerek użyj homogenizatora, aby rozbić komórki. W tym przypadku zastosowano trzy 30-sekundowe serie przy 6800 obr./min z 1-minutowymi okresami chłodzenia na mokrym lodzie między cyklami, aby zminimalizować nagrzewanie się próbek.</li>
		<li>Większe resztki tkanki należy rozdrabniać przez odwirowywanie przy 250 x g przez 3 minuty w mikrowirówce stołowej schłodzonej do temperatury 4 °C. 
		nuta: Zazwyczaj na dnie rurki znajduje się granulka komórki, a na górze warstwa pływających zanieczyszczeń. Środkowa warstwa wodna zawiera komórki bakteryjne.</li>
		<li>Przenieść 10 μl z warstwy wodnej do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 μl barwienia kwasem nukleinowym w 989 μl PBS (całkowita objętość 1 ml).</li>
		<li>Przeprowadzić cytometrię przepływową przy użyciu tych samych parametrów pozyskiwania danych i bramkowania, jak w przypadku początkowej inokulacji. 
		nuta: Liczba komórek bakteryjnych będzie bardzo niska, ponieważ próbka zawiera głównie szczątki tkanek. Opcja "Bramka na żywo" może być również używana, jeśli komórki są dodatnie pod względem barwienia kwasami nukleinowymi i bramkowane rozmiarem, gdy dane są ładowane do aplikacji. Pomoże to również przeanalizować więcej zdarzeń docelowych i zmniejszyć rozmiar pliku. Zlicza się prawie milion zdarzeń na próbkę, ale może być konieczne zwiększenie liczby zdarzeń w zależności od ciężkości infekcji i wielkości analizowanej tkanki.</li>
		<li>Analiza danych: Określić średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdego fluoroforu w danej próbce, korzystając z bramek inkluzyjnych określonych w sekcji 4.1.4. Normalizacja próbek w oprogramowaniu do analizy przepływu w celu uzyskania liczby zdarzeń. W analizie zwykle wystarcza 10 000 zliczeń. 
		nuta: Nierzadko zdarza się, że próbki zawierają mniej niż tę liczbę zdarzeń, ponieważ zależy to od powstawania ropni i ciężkości infekcji. Stosując to podejście, w zakażonej tkance zwykle znajduje się 500-40 000 zdarzeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Bakteryjne choroby zakaźne stanowią coraz większy problem zdrowotny na całym świecie ze względu na nabywanie determinantów oporności na antybiotyki46. Ponieważ adaptacja do środowiska gospodarza jest niezbędna do wzrostu i przetrwania podczas infekcji, strategie ukierunkowane na programy ekspresji genów, które zwiększają zdolność patogenów, mogą okazać się przydatne terapeutycznie. Jednym z takich programów jest zestaw genów kontrolowanych przez dwuskładnikowy system SaeR/S (TCS), który jak wykaza...

Bakterie reagują na zmieniające się warunki fizjologiczne i zmiany w stanie odżywienia swojego środowiska poprzez różnicową ekspresję genów niezbędnych do adaptacji i przetrwania. Na przykład oportunistyczne patogeny kolonizują powierzchnie ciała o stosunkowo niskiej gęstości i często są nieszkodliwe. Jednak gdy bakteria przeniknie przez bariery fizyczne i chemiczne, musi zmagać się z przeciwobroną komórek odpornościowych gospodarza i ograniczoną dostępnością składników odżywczych1. Na przykład Staphylococcus aureus kolonizuje około jednej trzeciej populacji bezobjawowo, ale jest również przyczyną wyniszczających infekcji skóry i tkanek miękkich, zapalenia kości i szpiku, zapalenia wsierdzia i bakteriemii2. Sukces S. aureus jako patogenu jest często przypisywany jego elastyczności metabolicznej, a także arsenałowi czynników wirulencji związanych z powierzchnią i wydzielanych, które umożliwiają bakterii ucieczkę z krwiobiegu i replikację w tkankach obwodowych3,4,5. Ponieważ śmierć gospodarza z powodu choroby gronkowcowej jest ewolucyjnym ślepym zaułkiem i ogranicza transmisję na nowych gospodarzy6, zaangażowanie w produkcję czynników wirulencji musi być dokładnie kontrolowane.
Złożona sieć regulacyjna białek i niekodujących RNA reaguje na różne bodźce środowiskowe, w tym gęstość komórek, fazę wzrostu, czynniki związane z neutrofilami i dostępność składników odżywczych, aby zapewnić, że geny wirulencji są wyrażane w dokładnym czasie i miejscu w tkankach gospodarza7,8,9,10,11,12,13. Na przykład dwuskładnikowy system SaeR/S (TCS) reguluje ekspresję kilku czynników wirulencji za pośrednictwem kinazy czujnikowej (SaeS) i regulatora odpowiedzi (SaeR)14. SaeS ulega autofosforylacji na konserwatywnej reszcie histydyny w odpowiedzi na sygnały gospodarza (np. ludzkie peptydy neutrofilowe [HNP], kalprotektyna)8,15,16. Grupa fosforylowa jest następnie przenoszona do reszty asparaginianu na SaeR, aktywując ją jako białko wiążące DNA (SaeR ~ P) 17. SaeR/S TCS reguluje ponad 20 genów, które przyczyniają się do patogenezy, w tym białka wiążące fibronektynę (FnBP), leukocydyny i koagulazę14,18,19,20. Cele można podzielić na cele genów o wysokim i niskim powinowactwie, które prawdopodobnie są indukowane, gdy poziom SaeR~P wzrasta pod wpływem jego sygnałów21. Aktywność SaeR/S jest kontrolowana przez inne regulatory ekspresji genów, takie jak system wykrywania kworum agr, białko represora toksyn (Rot) i alternatywny czynnik sigma B (SigB)22,23,24.
nuc jest zależnym od Sae genem wirulencji w Staphylococcus aureus i koduje termonukleazę (Nuc), która jest niezbędna do ucieczki z neutrofilnych extracellular traps (NETs) i do rozprzestrzeniania się w trakcie infekcji25,26. Ekspresja nuc jest również silnie pośrednio tłumiona przez CodY w obecności aminokwasów rozgałęzionych i GTP27, a bezpośrednio tłumiona przez gronkowcowe białko regulatora akcesoryjnego SarA28,29, na którego aktywność wpływa tlen (stan redoks) i pH30. Biorąc pod uwagę, że mutanty sae i nuc są atenuowane w mysich modelach infekcji, istnieje zainteresowanie opracowaniem interwencji chemicznych, które hamują ich odpowiadające im aktywności26,31. Mimo to nie ma informacji na temat ich regulacji podczas infekcji.
Fluorescencyjne reportery zostały użyte do monitorowania i ilościowego określania ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. W niniejszym artykule przedstawiono metodę ilościowego oznaczania S. Ekspresja genu złocistego podczas infekcji, która w połączeniu z analizą transkryptomu in vitro i potężnymi technikami obrazowania, takimi jak rezonans magnetyczny (MRI) i spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS), może ujawnić, w jaki sposób fizjologia bakterii jest regulowana in vivo i względną obfitość składników odżywczych w niektórych niszach. Metodę można zastosować do każdego patogenu bakteryjnego z podatnym systemem genetycznym.
Przegląd wektora integrującego genom. 
Wektor integrujący genom pRB4 zawiera po 500 par zasad z regionów górnego i dolnego pseudogenu S. aureus USA300 SAUSA300_0087, aby ułatwić rekombinację homologiczną. pRB4 pochodzi z wrażliwego na temperaturę szkieletu wektora pMAD zawierającego kasetę oporności na erytromycynę (ermC) i termostabilny gen beta-galaktozydazy bgaB do niebieskiego/białego badania przesiewowego rekombinantów32. Zmodyfikowany konstrukt reporterowy zawiera również marker oporności na chloramfenikol (cat) do selekcji po integracji genomu i eliminacji plazmidu, a także miejsca EcoRI i SmaI do fuzji regionu regulatorowego będącego przedmiotem zainteresowania z superfolderem białka zielonej fluorescencji (sGFP) (Figura 1). Wiadomo, że wybór miejsca wiązania rybosomów (RBS) wpływa na aktywność reportera i często wymaga empirycznej optymalizacji33. W związku z tym RBS nie jest dostarczany. W tym przypadku wykorzystuje się natywne miejsce wiązania rybosomów, aby zapewnić bardziej naturalny wzorzec ekspresji genów, ale można użyć innych miejsc.

<table><tbody><tr><td>5% krwi owczej</td><td>Hardy Diagnostics (Santa Maria, Kalifornia)</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galaktopiranozyd (X-Gal)</td><td>ThermoScientific</td><td>R0402</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Myszy</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0378</td><td></td></tr><tr><td>konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>kriostat mikrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Culture, Cap</td><td>VWR International</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>D+2:25NA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>Analizator przepływu</td><td>Koraliki szklane Becton Dickinson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z273627</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep, plazmid</td><td>Promega</td><td>A1220</td><td></td></tr><tr><td>orbitalna kąpiel wodna wstrząsająca</td><td>Nowy Brunszwik Innova</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie PCR</td><td>QIagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Saline (PBS)</td><td>Cellgrow</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24</td><td>Bertin Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-Kan</td><td>GenScript (Piscataway, NJ)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Taq DNA Polimeraza New</td><td>England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>Nowość England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza</td><td>New England BioLabs</td><td>E6300L</td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sekwencjonowanie</td><td>Genewiz (Germantown, MD)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sub Xero przezroczyste medium do zamrażania tkanek</td><td></td> Szkiełka mikroskopowe <td>Mercedes Medical</td> MER5000 <td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>superloop</td><td>GE Lifesciences</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, filtr</td><td>VWR International</td><td>28145-481</td><td></td></tr><tr><td>Syto 40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11351</td><td>Membrana przepuszczalna barwnik kwasu nukleinowego</td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td> UV <td>Beckman Coulter-DU350</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Geny zjadliwości bakterii są często regulowane na poziomie transkrypcji przez wiele czynników, które reagują na różne sygnały środowiskowe. Niektóre czynniki działają bezpośrednio na geny wirulencji; Inne kontrolują patogenezę, dostosowując ekspresję dalszych regulatorów lub akumulację sygnałów, które wpływają na aktywność regulatora. Chociaż regulacja była szeroko badana podczas wzrostu in vitro, stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, jak ekspresja genów jest dostosowywana podczas infekcji. Taka informacja jest ważna, gdy dany produkt genowy jest kandydatem do interwencji terapeutycznej. Podejścia transkrypcyjne, takie jak ilościowe, RT-PCR w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie RNA, są skutecznymi sposobami badania ekspresji genów na poziomie globalnym, ale borykają się z wieloma wyzwaniami technicznymi, w tym niską obfitością bakteryjnego RNA w porównaniu z RNA gospodarza i degradacją próbki przez RNazy. Ocena regulacji za pomocą reporterów fluorescencyjnych jest stosunkowo łatwa i może być multipleksowana za pomocą białek fluorescencyjnych o unikalnych właściwościach spektralnych. Metoda pozwala na jednokomórkową, czasoprzestrzenną analizę ekspresji genów w tkankach, które wykazują złożoną trójwymiarową architekturę i gradienty fizykochemiczne wpływające na bakteryjne sieci regulacyjne. Takie informacje są tracone, gdy dane są uśredniane w populacji większościowej. W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego określania ekspresji genów w patogenach bakteryjnych in situ. Metoda opiera się na prostym przetwarzaniu tkanek i bezpośredniej obserwacji fluorescencji białek reporterowych. Wykazujemy użyteczność tego systemu, badając ekspresję termonukleazy Staphylococcus aureus (nuc), której produkt genu jest niezbędny do unikania odporności i pełnej zjadliwości ex vivo i in vivo. Pokazujemy, że nuc-gfp ulega silnej ekspresji w ropniach nerek i ujawniamy niejednorodną ekspresję genów częściowo ze względu na pozorną regulację przestrzenną aktywności promotora nuc w ropniach w pełni zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną. Metodę tę można zastosować do każdej bakterii z manipulacyjnym systemem genetycznym i dowolnym modelem infekcji, dostarczając cennych informacji do badań przedklinicznych i opracowywania leków.

Opracowaliśmy plazmid pochodny od pMAD32, który umożliwia wprowadzenie dowolnego konstruktu fuzji reporterowej do chromosomu poprzez homologiczną rekombinację z podwójnym crossing-overem (Rycina 1). Konstrukt ten pozwala na ilościową analizę dowolnego regionu regulacyjnego, który wspiera produkcję białka GFP i sygnał fluorescencyjny powyżej poziomu tła. Plazmid nadaje oporność na ampicylinę (Apr) w celu utrzymania i propagac...

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Metoda ta może ujawnić przestrzenne wzorce ekspresji genów bakteryjnych i strategie fizjologicznej adaptacji do mikrośrodowisk tkanek gospodarza, które są tracone po uśrednieniu w całej populacji w tkankach. Dzięki tej technice można wykryć potencjalne niejednorodności, które należy wziąć pod uwagę przy identyfikowaniu nowych szlaków bakteryjnych i białek, które mają być celem związków przeciwwirusowych lub przeciwbakteryjnych. Zacznij od narysowania interesujących szczepów S.aureus na płytkach z agarem krwi z zamrożonego bulionu glicerolowego i inkubacji płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin, aby potwierdzić ich hemolityczne fenotypy w oparciu o ich zdolność do lizy czerwonych krwinek i tworzenia przezroczystych stref.Zaszczepić pojedyncze izolaty kolonii każdego szczepu w czterech mililitrach bulionu sojowego tryptycznego lub TSB w sterylnych szklanych probówkach i obracać probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin w rolce rurowej pod kątem około 70 stopni i 70 obrotów na minutę. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną kultur na poziomie 600 nanometrów lub OD 600 na spektrofotometrze i rozcieńcz komórki do OD 600 0,05 w 25 mililitrach sterylnego TSB w stosunku pięć do jednego kolby do objętości w 125-mililitrowych kolbach Delonga. Inkubuj kultury w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 280 obrotów na minutę i zbieraj komórki w fazie wykładniczej.Osadzać komórki przez odwirowanie i umyć komórki dwa razy w równej objętości sterylnego PBS. Następnie ponownie zawiesić komórki w świeżym PBS do jednego razy 10 do ósmego stężenia tworzącego kolonię na mililitr w celu ich późniejszego wstrzyknięcia zwierzęciu biorcy. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zbierz nerki, serce, wątrobę, płuca i śledzionę do 15-mililitrowych probówek polipropylenowych zawierających 10% buforowanej formaliny na 24 do 48 godzin inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem lub obracaniem.Pod koniec utrwalania należy zanurzyć narządy w klarownym podłożu do zamrażania tkanek w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą kriostatu pozyskać skrawki tkanek o grubości 10 mikrometrów i suszyć je na indywidualnych, wstępnie oczyszczonych, naładowanych szkiełkach przez 20 minut w ciemności przed nałożeniem twardego podłoża mocującego uzupełnionego DAPI. Następnie nałóż szkiełka nakrywkowe i utwardź je w temperaturze pokojowej przez noc przed przeniesieniem próbek do długotrwałego przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby zidentyfikować zmiany chorobowe w próbkach, należy umieścić szkiełko na stoliku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i użyć odpowiedniego celu do wizualizacji poszczególnych komórek, aby uzyskać obrazy zmian. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji w obrazach konfokalnych, otwórz obraz w ImageJ i dostosuj jasność i kontrast, aby prawidłowo zobrazować sygnał fluorescencji zmiany. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do wyboru wielokątów i dodaj ROI do menedżera ROI na karcie Edytuj w ImageJ.Wybierz pozycję Edytuj, następnie Zaznaczenie, a na końcu Dodaj do menedżera. Następnie zmień nazwę ROI i oznacz odpowiedni obraz. Aby zdefiniować środek ciężkości, otwórz kartę Analiza i wybierz opcje Obszar, Średnia wartość szarości, Środek ciężkości i Ogranicz do progu.Wyodrębnij wartość intensywności fluorescencji środka ciężkości lub zmierz średnią intensywność fluorescencji w danej zmianie na jednostkę powierzchni. Można to osiągnąć, korzystając z funkcji progowania, aby w razie potrzeby ustawić dolną i górną granicę fluorescencji. Eksportuj dane do pliku Excel i przygotuj kolumnę wskazującą średnią intensywność fluorescencji na jednostkę powierzchni dla obrzeży i rdzenia.Aby obliczyć średnie natężenia fluorescencji na jednostkę powierzchni na obrzeżach i w rdzeniu, należy ręcznie zdefiniować górną i dolną granicę progów. Fluorescencja termonukleazy gronkowcowej gronkowca złocistego GFP jest średnio prawie dziewięciokrotnie wyższa w komórkach będących nosicielami genu fuzyjnego niż w komórkach nieposiadających fuzji reporterowej. Podobnie, tandemowa dimeryczna fluorescencja fuzji pomidorów jest około sześciokrotnie wyższa niż w przypadku zerowej kontroli reporterowej.Wzorzec aktywności reporterowej można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej z homogenatami tkankowymi. Chociaż różnice w fałdowaniu fluorescencji są zwykle niższe. Różnice w pomiarach fluorescencji mogą wynikać z niejednorodnej ekspresji reporterów.Na przykład w tych reprezentatywnych próbkach zaobserwowano, że niektóre zmiany wykazywały ekspresję jednego lub obu reporterów w odległości około 100 mikrometrów w tej samej próbce tkanki. Badanie aktywności reporterowej do rozdzielczości pojedynczej komórki w społecznościach ropni gronkowcowych ujawnia przestrzenną regulację ekspresji termonukleazy Staphylococcus aureus w ropniach ograniczonych silnym barwieniem DAPI, prawdopodobnie związanym z tworzeniem i uwalnianiem zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Na przykład znacznie wyższą fluorescencję termonukleazy gronkowcowej GFP obserwuje się w wewnętrznym rdzeniu społeczności ropni gronkowcowego w porównaniu z zlokalizowaną na obrzeżach.W tym samym ropniu wzór tandemowej dimerycznej fluorescencji fuzji pomidorów wydaje się być odwrócony. Jednak wzorzec w tym eksperymencie nie był statystycznie istotny. Uzyskanie nienaruszonych kriogenicznych rozwarstwień ma zasadnicze znaczenie dla analizy obrazu fluorescencyjnego i powinno być wykonane ostrożnie.Sortowanie komórek bakteryjnych w celu uchwycenia subpopulacji wyrażających fuzję w różnym stopniu, w połączeniu z analizą RNA-Seq, może rzucić światło na zmiany w transkryptomie w całym genomie. Zachowaj ostrożność podczas pracy z formaliną, ponieważ jest ona rakotwórcza i może powodować podrażnienie skóry, reakcje alergiczne lub uszkodzenie oczu przy bezpośrednim narażeniu. Wygenerowanie zmutowanych pochodnych szczepów przenoszących interesujące nas reportery fluorescencyjne może pomóc w ujawnieniu genetycznych podstaw obserwowanych przestrzennych wzorców regulacyjnych.

a-fluorescence-based-method-to-study-bacterial-gene-regulation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: Behera, R. K. i in. Metoda oparta na fluorescencji do badania regulacji genów bakteryjnych w tkankach zakażonych. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje metodę przygotowania zakażonej tkanki nerki myszy, barwienia DNA oraz wykrywania ekspresji genów bakterii za pomocą dwóch fluorescencyjnych reporterów. Czerwony oznacza wszystkie bakterie, a zielony podkreśla komórki reagujące na infekcje.

Obrazowanie fluorescencyjne kolonizacji bakteryjnej w tkance nerek myszy

Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF) do wykrywania in vivo infekcji Mycobacterium tuberculosis. Zakażonym myszom wstrzykuje się dootrzewnowo substrat do obrazowania REF. Po hydrolizie przez bakteryjny enzym β-laktamazę substrat wydziela fluorescencję, której wykrycie pomaga w ocenie infekcji.

Obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych do śledzenia infekcji bakteryjnych in vivo

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Poznaj metodę fluorescencyjną analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych zakażonych S. aureus. Technika ta ujawnia przestrzenne wzory ekspresji i heterogeniczność populacji bakteryjnych.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Przeglądaj więcej filmów