Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie
6 marca 2019
W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.
Protokół ten opisuje syntezę i zastosowanie PODS, nowego odczynnika do biokoniugacji białek i peptydów specyficznej dla danego miejsca. Technologia ta stanowi wyraźny postęp w porównaniu z tradycyjnymi biokoniugacjami opartymi na maleimidzie i tiolu. Największą zaletą tego zabiegu jest prostota, z jaką wykonany jest odczynnik.
Metoda pozwala na syntezę odczynnika w praktycznie każdym laboratorium. W 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej rozpuścić 100 miligramów tiolu aminofenylu oksadiazolu w trzech mililitrach metanolu. Do roztworu dodaj 360 mikrolitrów diizopropyloetyloaminy i mieszadło magnetyczne.
Uszczelnić kolbę gumowym korkiem i mieszać roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności jednego mililitra przebij otwór w gumowym korku i szybko dodaj do mieszaniny 32 mikrolitry jodometanu. Pozwól mieszaninie reagować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
W 25-mililitrowej kolbie okrągłodennej rozpuść 387 miligramów kwasu karboksylowego chronionego przed boc w 10 mililitrach dichlorometanu. Do roztworu dodaj 480 mikrolitrów diizopropyloetyloaminy, 264 miligramy EDCI, 200 miligramów aniliny i mieszadło magnetyczne. Zamknąć kolbę szklanym korkiem i pozostawić reakcję do mieszania przez pięć dni w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu reakcji przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza i przemyć trzykrotnie pięcioma mililitrami jednomolowego kwasu solnego. Zebrać fazę organiczną i przenieść ją do rozdzielacza rozdzielającego. Następnie przemyj fazę organiczną jednomolowym węglanem sodu, a następnie wodą.
Następnie zbierz fazę organiczną i dodaj siarczan magnezu, aby usunąć wszelkie ślady wody. Następnie przefiltrować mieszaninę za pomocą średniej fryty szklanej. Za pomocą wyparki obrotowej usuń lotne rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać ciało stałe o białawym odcieniu.
Następnie ponownie rozpuść wyizolowane ciało stałe w 10 mililitrach octanu etylu. Następnie wytrącić produkt poprzez stopniowe dodawanie 30 mililitrów cykloheksanu. Przefiltrować roztwór za pomocą pośredniej fryty szklanej, aby otrzymać produkt karbaminianu w postaci białego proszku.
W 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej rozpuścić 30 miligramów karbaminianu w czterech mililitrach dichlorometanu. Powoli dodać do mieszaniny 49 miligramów 70% kwasu chloroperbenzoesowego i mieszadło magnetyczne i zamknąć kolbę szklanym korkiem. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze pokojowej, ostatecznie uzyskując żółtą mieszaninę.
Następnego dnia przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Następnie przemyj mieszaninę 0,1-molowym wodorotlenkiem sodu, a następnie wodą. Zbierz fazę organiczną i dodaj siarczan magnezu, aby usunąć wszelkie ślady wody.
Następnie przefiltrować mieszaninę za pomocą średniej fryty szklanej. W 25-mililitrowej kolbie okrągłodennej rozpuść 30 miligramów karbaminianu w dwóch mililitrach dichlorometanu. Dodaj mieszadło magnetyczne do mieszanki.
I 400 mikrolitrów kwasu trifluorooctowego i zamknąć kolbę szklanym korkiem. Następnie mieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Po zakończeniu reakcji usunąć substancje lotne pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać oleistą pozostałość.
Rozpuść oleistą pozostałość w siedmiu mililitrach wody. I przenieść do rozdzielacza. Przemyć roztwór wodny trzykrotnie czterema mililitrami octanu etylu.
W 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki rozpuść 10 miligramów PODS i 300 mikrolitrów dimetylosulfotlenku. Następnie dodaj 26 mikrolitrów N, N-diizopropyloetyloaminy do roztworu. Rozpuść 15,2 miligrama DOTA NCS w 100 mikrolitrach sultlenku dimetylu i połącz roztwór z roztworem PODS.
Uszczelnij probówkę do mikrowirówki i pozwól reakcji inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć 61 mikrolitrów roztworu podstawowego trastuzumabu z 859 mikrolitrami PBS w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej o niskiej wiązalności białka. Do tej mieszaniny dodaj 6,7 mikrolitra świeżo przygotowanego 10-milimolowego roztworu TCEP w wodzie.
Dodać 73 mikrolitry roztworu PODS-DOTA o stężeniu jednego miligrama na mililitr do mieszaniny reakcyjnej. Na koniec zamknij probówkę do mikrowirówki i inkubuj roztwór przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Synteza PODS jest solidna i niezawodna.
Deproteinacja i podstawienie tiolu aminofenylooksadiazolu zapewniło tioeter jeden w wydajności ilościowej. Ligacja tioeteru jednego i kwasu karboksylowego chronionego przed boc dała związek drugi w 55% wydajności. Utlenianie zapewniło związek trzeci w 90% wydajności.
A usunięcie grupy chroniącej przed bocs dało PODS w 98% wydajności. Tożsamość każdego produktu została potwierdzona za pomocą NMR protonowego, NMR węglowego i MS o wysokiej rozdzielczości. Wariant metalatora DOTA zawierający izotiocyjanian sprzężono z aminą wiszącą PODS w celu uzyskania dwufunkcyjnego chelatora z wydajnością 75%. Tożsamość produktu została potwierdzona za pomocą protonowego NMR, węglowego NMR i MS o wysokiej rozdzielczości. Pokazano tutaj selektywną biokoniugację PODS-DOTA z przeciwciałem ukierunkowanym na HER2 trastuzumabem.
Wiązania dwusiarczkowe w regionie zawiasowym przeciwciała zostały selektywnie zredukowane, a przeciwciało następnie inkubowano z PODS-DOTA, aby zapewnić immunokoniugatowi zawierającemu DOTA 80% plon. Analiza MALDI-TOF wykazała stopień znakowania 1,8 DOTA na przeciwciało. Który pozostaje spójny w całym zakresie ludzkich, humanizowanych i chimerycznych przeciwciał IgG1.
Jednak w tych samych warunkach powstają immunokoniugaty o stopniu znakowania 1,5 dla mysich przeciwciał IgG1. Ze względu na wrażliwość tego związku na światło, ważne jest, aby wszystkie reakcje zachodziły w naczyniach pokrytych folią. Zwiększy to ogólną wydajność produktu.
Chociaż protokół ten opisuje syntezę PODS-DOTA, podobną procedurę można zastosować do szerokiego zakresu potencjalnych ładunków, w tym fluoroforów, toksyn i innych chelatorów. Metoda ta ułatwi budowę dobrze zdefiniowanych, jednorodnych i wysoce stabilnych immunokoniugatów, które mogą być stosowane w wielu różnych dziedzinach. Ważne jest, aby pamiętać, że jodometan dodany w pierwszym kroku tego eksperymentu może mieć szkodliwe skutki i dlatego powinien być stosowany w dygestorium.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje syntezę i zastosowanie PODS, nowego odczynnika do specyficznej względem miejsca biokoniugacji białek i peptydów. Metoda ta umożliwia prostą syntezę odczynnika w praktycznie każdym laboratorium.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biokoniugacja
- Chemia białek
- Modyfikacja przeciwciał
Wstęp
- PODS jest odczynnikiem opartym na fenylooksadiazolylometylosulfonie.
- Umożliwia on selektywne w miejscu przyłączanie ładunków do grup tiolowych biomolekuł.
- Technologia ta stanowi udoskonalenie tradycyjnych biokoniugacji opartych na maleimidzie i tiolu.
- Znaczącą zaletą jest prostota procesu syntezy.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu syntezy PODS.
- Zaprezentowanie zastosowania PODS w biokoniugacji.
- Charakterystyka bifunkcyjnego chelatora zawierającego PODS.
Zastosowane metody
- Rozpuszczenie aminofenyloksadiazolo-tiolu w metanolu.
- Dodanie diizopropyloetyloaminy do roztworu.
- Użycie magnetycznego mieszadła do mieszania.
- Charakterystyka zsyntetyzowanego PODS oraz jego sprzęganie z przeciwciałem modelowym.
Główne wyniki
- PODS został pomyślnie zsyntetyzowany w warunkach laboratoryjnych.
- Odczynnik wykazał skuteczną biokoniugację specyficzną dla danego miejsca.
- Przeprowadzono charakterystykę bifunkcyjnego chelatora zawierającego PODS.
- Metoda ta wykazała przewagę nad tradycyjnymi technikami biokoniugacji.
Wnioski
- PODS oferuje prostą i skuteczną metodę biokoniugacji.
- Odczynnik ten można syntetyzować w różnych warunkach laboratoryjnych.
- Protokół zwiększa wydajność przyłączania ładunków do biomolekuł.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Selektywna względem miejsca biokoniugacja przeciwciał pozostaje krytycznym wyzwaniem w rozwoju radiofarmaceutyków ze względu na niestabilność wiązań opartych na maleimidzie in vivo. Chemia oparta na PODS umożliwia otrzymywanie homogenicznych, stabilnych immunokoniugatów o poprawionej retencji w celu oraz zredukowanej akumulacji poza celem. Postęp ten wspiera przedkliniczne ograniczanie ryzyka w przypadku koniugatów przeciwciało-lek oraz terapeutyków znakowanych radioizotopowo poprzez zwiększenie integralności ładunku i indeksu terapeutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależności między strukturą a funkcją przeciwciała poprzez specyficzne dla miejsca przyłączanie ładunku.
- Wartość operacyjna: Redukuje heterogeniczność populacji koniugatów, co upraszcza późniejszą charakterystykę.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność ocen skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach przedklinicznych poprzez minimalizację zmienności obciążenia lekiem.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na wytworzenie dobrze zdefiniowanych immunokonjugatów odpowiednich do testów wiązania i internalizacji.
- Powtarzalność: Stały stopień znakowania (~1,8 DOTA na przeciwciało) we wszystkich podklasach IgG1 wspiera standaryzację analizy.
- Skalowalność: Niezawodna synteza w standardowych warunkach laboratoryjnych umożliwia transfer technologii pomiędzy zespołami badawczymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykazano lepszą skuteczność in vivo w mysich modelach raka jelita grubego w porównaniu z kontrolami maleimidowymi.
- Ciągłość translacyjna: Koniugacja specyficzna dla miejsca zachowuje immunoreaktywność, co wspiera badania nad wiązaniem z celem.
- Łagodzenie ryzyka: Ograniczona wymiana ładunku i degradacja retro-Michaela zmniejsza ryzyko toksyczności poza celem podczas optymalizacji wiodącego związku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Chemia PODS wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając niezawodne generowanie stabilnych immunokonjugatów do identyfikacji wiodących związków oraz badań umożliwiających złożenie wniosku o IND.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez zastosowanie zdefiniowanych koniugatów przeciwciał w celu walidacji celu oraz badania mechanizmu działania.
- Screening: Pozwala na otrzymywanie jednorodnych koniugatów do wysokoprzepustowego screeningu skuteczności i selektywności ładunku (payload).
- Analityka: Umożliwia precyzyjną kwantyfikację stosunku leku do przeciwciała (DAR) za pomocą MALDI-TOF i NMR w celu zapewnienia spójności serii.
- Badania translacyjne: Ułatwia modelowanie PK/PD dzięki stabilnym koniugatom odpornym na wymianę tiolową in vivo.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Modułowa konstrukcja odczynników pozwala na adaptację do różnych ładunków (chelatorów, fluoroforów, toksyn) w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Ulepszona walidacja celu dzięki stabilnemu, specyficznemu dla miejsca powiązaniu, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Wysokowydajna, powtarzalna synteza (98% dla PODS, 80% dla koniugacji) minimalizuje ryzyko niepowodzenia partii.
- Wartość strategiczna: Poprawiony indeks terapeutyczny i kontrast obrazowania wspierają lepsze decyzje go/no-go w portfelach przedklinicznych.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację koniugatów o lepszych profilach farmakokinetycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu syntezy organicznej i chemii biokoniugacji.
- Wymagany jest standardowy sprzęt laboratoryjny: kolby okrągłodenno, wirówka rotacyjna, rozdzielacz oraz dygestorium do pracy z jodometanem.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów koniugacji i charakterystyki analitycznej (NMR, MS, MALDI-TOF).
- Adaptacja do przeciwciał innych niż IgG1 może wymagać optymalizacji ze względu na zmienną wydajność znakowania (np. 1,5 DOTA dla mysiego IgG1).
- Wrażliwość na światło wymaga stosowania naczyń owiniętych folią aluminiową podczas przechowywania i etapów reakcji w celu zachowania wydajności i czystości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Synthesis of 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
1:15
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (2)
3:00
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (3)
3:55
Synthesis of N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phenyl}Succinamide (PODS)
4:47
Synthesis of PODS-DOTA and Bioconjugation of PODS-DOTA to Trastuzumab
6:05
Results: Synthesis of PODS and PODS-DOTA and Conjugation to Trastuzumab
8:01
Conclusion
